Abstract
Um papel para micróbios foi suspeita de câncer de próstata, mas difícil de confirmar em pacientes humanos. Mostramos aqui que uma infecção bacteriana gastrintestinal (GI) é suficiente para melhorar a neoplasia intra-epitelial prostática (PIN) e carcinoma microinvasivo num modelo de ratinho. Descobrimos que os animais com uma predileção genética para a desregulação do
sinalização Wnt
,
Apc
Min /+
ratos mutantes, foram significativamente suscetíveis ao câncer de próstata em um forma dependente da inflamação após a infecção com
Helicobacter hepaticus
. Além disso, neoplasia precoce observado em infectado
Apc
Min /+
ratos era transmissível aos ratos não infectados por injecção intraperitoneal de nódulos linfáticos mesentéricos (MLN) apenas células de
H. hepaticus
ratos mutantes infectados. Transmissibilidade de neoplasia foi prevenida por neutralização antes da inflamação usando anticorpo anti-TNF-α em ratinhos infectados doadores MLN. Tomados em conjunto, estes dados confirmam que a inflamação sistêmica desencadeada por bactérias do trato GI desempenha um papel fundamental na tumorigênese da glândula da próstata
Citation:. Poutahidis T, Cappelle K, Levkovich T, Lee CW, Doulberis M, Ge Z , et ai. (2013) enterobactérias melhorar o desenvolvimento do cancro da próstata via sistémica de ativação de células imunitárias em ratinhos. PLoS ONE 8 (8): e73933. doi: 10.1371 /journal.pone.0073933
editor: Deyu Fang, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 15 Abril 2013; Aceito: 24 de julho de 2013; Publicação: 26 de agosto de 2013
Direitos de autor: © 2013 Poutahidis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por RO1CA108854 (SEE) e uma CEHS prêmio projeto piloto P30-ES002109 (SEE). CEHS (Centro de Ciências da Saúde Ambiental) é uma concessão centro concedido ao MIT por NIH-NIEHS (Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Apenas uma pequena proporção de displásicas e lesões neoplásicas precoce decorrentes de epitélio por todo o corpo, na verdade, avançar para câncer [1-3]. Cancer acontece quando células com potencial maligno alcançar todos os estímulos necessários para a sua evolução genética e epigenética em malignidade [4]. É agora bem documentado que para muitos tipos de cancro é um dos principais contribuintes células e factores do sistema imunológico [4-6]. Na glândula da próstata, várias linhas de evidência sugerem que a inflamação crónica conduz o processo de cancro da próstata [5,7,8], mas a sua origem permanece elusiva. agentes infecciosos, lesão de células epiteliais químico ou físico, desequilíbrios hormonais e fatores dietéticos têm sido propostas como as causas mais prováveis da inflamação crônica na próstata [8-10].
Determinar se a malignidade da próstata podem ser prevenidas, visando inflamação subjacente tem particular importância uma vez que é uma das principais causas de incapacidade relacionada ao câncer e morte entre os homens. No tracto gastrointestinal (GI), infecções por micróbios patogénicos, tais como com
Helicobacter pylori
, levar a inflamação crónica (gastrite) e cancro (adenocarcinoma gástrico) em seres humanos e em modelos do rato [4]. Da mesma forma, em modelos imunocomprometidos rato a menor bactéria intestinal
Helicobacter hepaticus
(
H. Hepaticus
) desencadeia a doença inflamatória intestinal (DII) e carcinoma colorectal (CRC) [11-13] relacionados. Na próstata, no entanto, alguns modelos animais existem para testar possíveis funções diretas ou mesmo indiretas de micróbios patogénicos em malignidade da próstata [8,10,14].
Nos seres humanos, a adenomatose polipose coli gene (APC) é um gene supressor de tumor crítico que impede malignidade do cancro da próstata e outros tecidos [15]. Aqui, usamos ratos mutantes que não possuem uma cópia do
Apc
gene (
Apc
Min /+
ratos) e exibem desregulação da β-catenina e a via de sinalização Wnt e são de outro modo usada extensivamente como um modelo de adenomas intestinal [16].
Apc
Min /+
ratos espontaneamente desenvolver neoplasia intra-epitelial prostática (PIN) e carcinoma microinvasivo (CA microinvasivo) com o aumento da idade, imitando os estágios iniciais de câncer de próstata observados em seres humanos em sua quinta ou sexta década de vida [15,17]. Nós mostramos que a administração orogástrica com
H. hepaticus
, um não-colitigenic para este modelo de rato colonizador intestinal bacteriana [17], aumenta significativamente o câncer de próstata. É importante ressaltar que o desenvolvimento do câncer de próstata era transmissível aos animais não infectados apenas por transferência de células de nódulos linfáticos mesentérica de
H. hepaticus
infectado
Apc
ratos Min /+
doadores.
Resultados
infecção orogástrico com
Helicobacter hepaticus
aumenta o risco de carcinoma de próstata em homens
Apc
Min /+
ratos
Para determinar o impacto da infecção intestinal, usamos
Apc
Min /+
ratos que estavam livres de câncer (ratos jovens de idade inferior a 12 semanas não tinha carcinoma da próstata ou pólipos intestinais) [17]. Os ratinhos foram doseados oralmente com
H. hepaticus
ou simulada foram submetidos a dosagem com a mídia em seis semanas de idade. Por 12 semanas de idade,
Apc
Min /+
camundongos infectados com
H. hepaticus
exibida características de carcinoma da próstata consistentes com os observados nos machos humanos (Figura 1A, 1B; Tabela S1).
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos apresentaram maior PIN (p 0,01) e microadenoCA (p 0,01) quando comparado com o sham-dosado correspondida controle não infectado
Apc
Min /+
ratos (Figura 1C e S1). Nem
H. hepaticus
infectado nem não infectados de 12 semanas de idade,
em peso
ratos exibiu a patologia da próstata significativo. Em conjunto, estes resultados demonstram que a infecção do tracto GI com
H. hepaticus
rapidamente aumenta a carcinogênese de próstata em ratos geneticamente susceptíveis.
A) Com a idade de 12 semanas,
Apc
Min /+
ratos desenvolvem espontaneamente neoplasia focais de baixa e alta da próstata de grau intra-epitelial (LGPIN, seta-cabeça branca; HGPIN, seta-cabeça preta), mas carcinoma microinvasivo única rara (a). Aged-combinado
Apc
Min /+
ratos com
H
.
hepaticus
, desenvolver significativamente mais PIN e lesões microinvasiveCA (asterisco) caracteriza-se pela próstata altamente atípica glândula células epiteliais que quebram através da lâmina basal e se infiltrar o estroma adjacente (b). Quando as células de nódulos linfáticos mesentérica de
H
.
hepaticus
infectado
Apc
Min /+
camundongos são transferidos para a cavidade peritoneal de
H
.
hepaticus
livre de
Apc
Min /+
ratos os ratos destinatário desenvolver lesões pré-neoplásicas e neoplásicas (início microinvasiveCA-asterisco) comparáveis aos encontrados em camundongos doadores (c). Esgotando TNF-α de
H
.
hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos traz lesões neoplásicas da próstata (LGPIN, branco seta-cabeça) ocorrência ao nível de
H
.
hepaticus
Livre de ratos (D). Hematoxilina e Eosina. Barras = 50 pm. B) aberrante β-catenina e laminina imunocoloração padrão em lesões microinvasiveCA no câncer de próstata. DLP de
WT H
.
camundongos positiva hepaticus-
(A e C),
H
.
hepaticus
infectado
Apc
Min /+
do mouse (b) e
H
.
hepaticus
livre de
Apc
Min /+
rato transferidas com células de nódulos linfáticos mesentérica de
H
.
hepaticus
infectado
Apc
Min /+
doador (d). DLP glândulas normais tinham um padrão de coloração da membrana celular epitelial laterais β-catenina normal (A) e uma lâmina basal intactas (C). Em contraste, as lesões foram caracterizados por microinvasiveCA estabilização citoplasmática e nuclear (seta-cabeças) de β-catenina (b), e ausência de laminina (asterisco) sugestivos de degradação da membrana basal em focos de células epiteliais malignas de invasão incipiente. Hematoxilina contrastante, DAB cromogénio. Barras = 25 pm. C) Gráfico de barras mostrando frequência de PIN e microinvasiveCA em grupos de tratamento. A ocorrência de câncer de próstata mais significativamente elevados é indicado por asterisco. barras de erro padrão correspondem às comparações estatísticas microinvasiveCA. D) DLP de
H
.
hepaticus
livre de
Apc
Min /+
rato transferidas com células MLN de um
H
.
hepaticus
infectado
Apc
Min /+
doador, HGPIN. A maioria das células precursoras mielóides com núcleos em forma de anel que residem no estroma têm o fenótipo da linhagem granulocítica típico (seta-cabeça preta) enquanto menos parecem ser mielo /monocítica no tipo (branco seta-cabeça). Bar = 16 mm.
Elevações de citocinas inflamatórias ocorrem sem doença inflamatória ostensiva em
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos
Estamos próximos testaram se
H. infecção hepaticus
leva a um aumento da resposta inflamatória como mostrado anteriormente [13]. Descobrimos que
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos apresentaram maior citocinas pró-inflamatórias sistêmicas, incluindo fator de necrose tumoral (TNF) -α (p = 0,013), IL 1α (p = 0,024), IL-3 (p = 0,0009) e eotaxina (p = 0,003) (Figura 2A à esquerda). Curiosamente, próstatas de
H hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos não tinham doença inflamatória ostensiva, mas exibiu ocasionais mastócitos, neutrófilos, e também precursor mielóide células portadoras de núcleos em forma de anel [18] (Figura 1D).
a) Os níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias foram aumentados em
Apc
Min /+
camundongos depois de
H
.
hepaticus
infecção. A eotaxina, IL-3, TNF-α e IL-1α foram significativamente elevados em comparação com a mesma idade não infectadas
Apc
Min /+
controlos. Quando comparado com o
H
.
hepaticus
infectado
em peso
ratos, infectados
Apc
Min /+
ratos tinham significativamente maior de IL-17, IL-1α, IL -3, eotaxina e a concentração de IL-9 no seu soro do sangue. Bio-Plex Assay citocinas utilizado soro de
n
= 5 ratos por grupo. *** P 0,001; * P 0,05. B) áreas paracortical em linfonodos mesentéricos.
H
.
hepaticus
infectado
Apc
Min /+
camundongos com alto risco de câncer de próstata tinham grandes quantidades de citoplasmática e extracelular de IL-17 que diminuiu significativamente após o esgotamento dos TNF-α. imuno-específico de IL-17; Hematoxilina contrastante, DAB cromogénio. Barras = 25 pm. C) A avaliação morfométrica de IL-17 nas secções imunohistoquímica manchadas de linfonodos mesentéricos. Ambos
Apc
Min /+
status genético e infecção intestinal por
H
.
hepaticus
correlacionar significativamente com um aumento de TNF-α mediada por IL-17 de expressão nos nódulos linfáticos mesentéricos. *** P 0,001; ** P 0,01; * P . 0,05
Neutralização inibe a inflamação
H. hepaticus
carcinoma da próstata induzida no sexo masculino
Apc
Min /+
ratos
citocina
Pro-inflamatória TNF-α foi encontrado para ser elevado (p = 0,013) em soros depois
H. infecção hepaticus Compra de seis semanas no macho de três meses de idade,
Apc
Min /+
ratos (Figura 2A). TNF-α é no vértice de uma cascata de acontecimentos pró-inflamatórias carcinogénicas [5]. Para testar se a inflamação é necessária para a patologia da próstata do tracto GI bactérias desencadeada, foi realizada a neutralização sistémica de TNF-α utilizando injecção intraperitoneal de anticorpo anti-TNF-α para a duração de 3 semanas a partir de 3 semanas pós-infecção (PI). Nós descobrimos que o tratamento anti-TNF-α aumentaram significativamente menor (p 0,01) na patologia da próstata
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos (Figura 1A, 1C e S1; Tabela S1). Tomados em conjunto com os dados anteriores, este indicou que
H. hepaticus
Triggered sediar respostas inflamatórias melhorados efeitos neoplásicas no tecido da próstata.
citocinas inflamatórias foram elevados em
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos, mas não em
H. hepaticus
infectado
em peso
ratinhos da mesma ninhada
Uma característica deste modelo do rato é que
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos exibido significativamente aumentada PIN de alto grau (HGPIN) e carcinoma da próstata; no entanto, compensada
H. hepaticus
infectado
em peso
ratinhos da mesma ninhada não conseguem desenvolver significativas PIN ou carcinoma lesões (Figura 1B, 1C e S1, Tabela S1). Após a análise dos níveis de citocinas no soro, descobrimos diferenças significativas nos níveis de proteína de IL-1α (p = 0,02) e IL-17 (p = 0,0005) entre
Apc
Min /+
e
em peso
ratos littermate (Figura 2A direita). Da mesma forma,
na marcação in situ
de IL-17 apresentaram níveis aumentados de IL-17 + expressão no MLN em
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos, mas não no
H. hepaticus
infectado
em peso
controles (Figura 2B e 2C). Tratamento de
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratinhos com anti-TNF-a anticorpo diminuiu significativamente a expressão do gene mRNA (p 0,01) e proteína (p 0,001) níveis de IL-17A em MLN (Figura 2B e 2C). Tomados em conjunto, estes dados acumulados levantou a possibilidade de que as diferenças sistémicas provenientes de inflamação bactérias desencadeadas de origem do trato gastrointestinal podem contribuir para processos cancerígenos em tecidos distantes, como próstata.
risco de câncer de próstata é transmissível aos destinatários não infectados usando mesentérica linfa células de nódulos (MLN) de
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos
Sabendo que a origem do tracto GI resposta inflamatória é necessária para o câncer de próstata em nosso modelo, a hipótese de que as células dentro gut-associados gânglios linfáticos (MLN) pode ser crucial no cancro da próstata neste modelo. Para testar esta hipótese, utilizou-se a transferência de células de MLN coletadas de
H. hepaticus
infectado ou doador dosado-sham
Apc
Min /+
ou
em peso
ratinhos da mesma ninhada (Figura 3). Para este experimento, todos os animais receptores foram
Helicobacter
sp
-livre masculino
Apc
Min /+
ou
em peso
ninhada. camundongos machos da idade de 6-8 semanas foram submetidos a injeção ip de 5X10
6 suspensão de células individuais em HBSS por ratinho de células recolhidas a partir de linfonodos mesentéricos de
H. hepaticus
infectado ou dosado-sham
Apc
Min /+
ou
em peso
ratos.
Ilustração esquemática de células MLN experiências de transferência desenhadas para testar a hipótese de que o tracto GI local de eventos da rede imune causar desequilíbrios imunes sistemáticas que determinam o destino de lesões pré-neoplásicas em epitélios topograficamente distantes, tais como os da glândula da próstata. Ensaios utilizados seis ratinhos por grupo. Experimentos foram realizados em duplicado
Por isso, encontramos aumentou significativamente baixo (p 0,05). E alto grau (p 0,01) PIN em não infectados
Apc
Min /+
ratos que apenas tinham recebido células MLN de
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos (Figura 1A, B, C e S1) em 6 semanas após a injeção ip, quando comparadas com células de doadores MLN de dosado de forma simulada
Apc
Min /+
ratos. Estes não infectados
Apc
Min /+
que recebeu células de
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
funções exibidas de preneoplasia e carcinoma consistentes com os observados em
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos (Figura 1A), e assemelhando-se aos observados em machos humanos. Além disso, não infectados
em peso
beneficiários ratos que receberam células de nódulos linfáticos de
H. hepaticus
infectado
Apc
ratos Min /+
doadores também tinha aumentado LGPIN (p 0,001), HGPIN (p 0,001) e adenocarcinoma (p 0,001) (Figura 1C e S1; Tabela S1) em comparação com ratinhos wt não infectados que receberam células de nódulos linfáticos a partir de
H. hepaticus
livre de
Apc
ratos Min /+
doadores que mostram que a predisposição genética do epitélio da próstata não foi especificamente necessário para efeito cancerígeno do
H. hepaticus
infecção. Este recurso transmissibilidade mostrou que
H. hepaticus
células -activated foram suficientes para processos neoplásicos em glândulas extra-intestinais, como próstata.
Neutralização da inflamação impede transmissibilidade células MLN de risco de câncer de próstata para os ratos não infectados
Finalmente, testou-se se neutralizar a inflamação foi suficiente para inibir a transmissibilidade mediada por células MLN de cancro da próstata neste modelo de ratinho. Utilizamos a transferência de células de MLN coletadas de
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos que tinham sido tratados com anti-TNF-a anticorpo durante 3 semanas (Figura 3). Para este experimento, todos os animais receptores foram
Helicobacter
sp
-livre masculino
Apc
Min /+
ou
em peso
animais da mesma ninhada. camundongos machos da idade de 6-8 semanas foram submetidos a injeção ip de 5X10
6 suspensão de células individuais em HBSS por ratinho de células recolhidas a partir de linfonodos mesentéricos de
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos. Como previsto, não foram encontradas diferenças significativas entre os não infectados
Apc
Min /+
ratos vs não infectado
Apc
Min /+
ratinhos que tinham recebido MLN de ratinhos com anti-TNF-alfa tratado com (p 0,05). Da mesma forma, houve significativamente menos LGPIN (p 0,01) e HGPIN (p 0,05) nos não infectados
Apc
Min /+
destinatários de MLN de tratados anti-TNF
H. camundongos infectado hepaticus
quando comparado com o
Apc
Min /+
ratos receptores de MLN de
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos (Figura 1C e S1; Tabela S1). Estes dados indicam que o papel pró-inflamatório das células MLN é a causa subjacente da transmissibilidade cancro da próstata risco observado.
Discussão
No presente estudo, testamos jovem do sexo masculino
Apc
Min /+
ratos em um /6J C57BL como modelo experimental para investigar associações de inflamação com carcinogênese na próstata. Tal como acontece com os seres humanos, onde o risco de câncer de próstata tem um forte componente genético,
Apc
Min /+
ratinhos mutantes são geneticamente predispostas a neoplasia epitelial [13,16,17]. Nós e outros demonstraram no passado que
Apc
Min /+
ratos também progressivamente desenvolver cancro da próstata com base no aumento das lesões de PIN correspondentes observado em machos humanos [15, 17]. Em nossos estudos,
Apc
Min /+
ratinhos desenvolvem lesões neoplásicas início na próstata dorsolateral tão cedo quanto aos 3 meses de idade anteriores pólipos intestinais evidentes. Na idade = 6 meses, 40% dos
Apc
Min /+
ratinhos desenvolvem adenocarcinoma microinvasivo enquanto 10-20% também têm lesões mais avançadas de câncer de próstata [15]. Este aspecto dá ao
Apc
Min /+
utilitário rato como um modelo para examinar a progressão de lesões neoplásicas pré-neoplásicas e no início da próstata humana [1-3].
Um achado importante deste estudo é que a infecção com
H. hepaticus
, uma bactéria que coloniza principalmente o intestino grosso de C57BL /6
ApcMin
/Tablet
+
ratos sem typhlocolitis ostensiva [13,19- 21], aumentou significativamente a incidência de lesões PIN e adenocarcinoma microinvasivos na próstata. Como esperado, 3 meses de idade
Apc
Min /+
camundongos infectados com o
H. hepaticus
não tinha nem ostensiva IBD nem grandes pólipos adenomatosos ainda formado em seus intestinos (dados não mostrados). No entanto, mesmo com essa idade, estes ratos exibiram níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias sistémicas, tais como TNF-α, IL-1α, IL-3, eotaxina e IL-9, em comparação com os seus homólogos de controlo não infectadas, indicativos do sistema imunológico ativação. Estes dados tomados em conjunto com evidências anteriores de que
H. infecção hepaticus
é capaz de modular tumorigênese em locais extra-intestinais [21,22], sugerem que tracto GI eventos da rede imunológica clinicamente silenciosas desencadeadas por microbiota intestinal pode causar desequilíbrios imunes sistemáticas. Por sua vez, estes desequilíbrios pode impactar o destino de lesões pré-neoplásicas em epitélios topograficamente distantes, tais como os da glândula da próstata.
As funções relacionadas do meio citocina pró-inflamatória elevada e o componente inflamatória celular encontradas no cancro da próstata propenso
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos são interessantes. Dentro da glândula prostática, PIN e adenocarcinoma microinvasivo caracterizado mastócitos, neutrófilos, e células precursoras mielóides núcleos de rolamento em forma de anel. TNF-α foi previamente comprovada essencial no recrutamento de mastócitos e tumorigênese em
Apc
Min /+
ratos [13,17,23]. A libertação de factores, incluindo o TNF-α e várias proteases a partir de mastócitos que residem no estroma da próstata pode ter um importante papel na tumorigénese [10].
TNF-α e IL-1α juntos foram implicados numa NF -κB mediada por sinal de cascata que inibiu a apoptose e aumentou a proliferação de células epiteliais da próstata humana em preneoplasia e cancro [24]. Além disso, a IL-1α promove a proliferação anormal de células epiteliais da próstata humana por meio de factor de crescimento do tipo insulina e factor de crescimento sinais relacionados-7-crescimento de fibroblastos [25,26]. A eotaxina e IL-3 regula a maturação da medula óssea, e libertação tráfico de tecido de células precursoras mielóides [27], tais como aquelas vistas nas glândulas prostáticas de
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos. papéis potenciais de eotaxina, IL-3 e células precursoras mielóides associadas em epitelial carcinogênese mandado uma investigação mais aprofundada. O poderoso papel pro-inflamatório de IL-9 é cada vez mais apreciada. células Th9 constituem a mais recente adição a expansão da matriz subtipo T-helper. A IL-9 estimula o crescimento de células hematopoiéticas, especialmente células mastro e a secreção de várias quimiocinas que recrutam células adicionais para tecidos inflamados [28]. O importante papel da IL-9 em autoimunidade e alergia [28] pode fornecer pistas importantes, especialmente à luz das hipóteses recentes que ligam a inflamação da próstata com câncer. lesão celular epitelial de próstata pode então provocar a perda de tolerância a antigénios prostáticas normais e, por conseguinte, levar a uma reacção auto-imune de auto-perpetuação [10]. No presente estudo, a nossa conclusão de que a neutralização do TNF-α foi suficiente para neutralizar realce o risco de cancro da próstata num modelo de ratinho sugere que esta citocina tem um papel central na criação de uma sistemática inflamatória macro-ambiente pró-tumorigénico que permite que a progressão do cancro na glândula da próstata.
Outra citoquina pró-inflamatória que encontramos significativamente elevados comparando
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ratos com
H. hepaticus
infectado
em peso
ratos littermate era Il-17A. As diferenças significativas em Il-17 foram de particular interesse porque temos mostrado previamente IL-17 + células no nó de linfa mesentérica (MLN) de ratos após a infecção com
H. hepaticus
[20]. Da mesma forma, a IL-17 tem sido implicada no desenvolvimento do câncer do intestino desencadeou-infecção em
Apc
Min /+
ratos [29,30]. A correlação do
Apc
Min /+
genótipo rato com sistemática e MLN elevações em Il-17 expressão pode ter uma base genética, uma vez que déficits Il-17-associado na a função das células imunes do presente modelo de ratinho foram relatados [30]. É importante ressaltar que evidências recentes de ambos rato pré-clínico [31] e estudos humanos clínicos apoiam um papel significativo para Il-17 na carcinogênese da próstata [32,33].
Para fornecer a prova experimental para esta hipótese e reter os imunológica complexa interação das várias populações de células que escolheu para transferir populações totais de células MLN em ratos. As actividades imunológicas no tecido de linfonodos sistémica [20] pode ser o elo de ligação GI flora microbiana com alterações sistemáticas universalmente pró-tumorigénicas do sistema imunitário. Surpreendentemente, descobrimos que o aumento do risco de câncer de próstata é transmissível ao não infectado
Apc
Min /+
receptores de células MLN única tiradas de
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
doadores. Não havia nenhuma evidência de
H. hepaticus
organismos no tecido da próstata de ratos receptores de transplante usando PCR ou por
in situ
exame utilizando coloração de prata (dados não mostrados), mas translocação de
H. hepaticus
organismos ou seus antígenos do intestino para linfonodos continuam a ser um possível fator contribuinte. Nossa descoberta de que células MLN tomadas a partir tratado anti-TNF
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
perdeu o cancro da próstata efeitos promotores fornece evidências de que a inflamação reforçada deste processo cancerígeno.
Em conclusão, um possível papel para micróbios no malignidade da próstata tem sido suspeito [9], mas permaneceu não provada até agora. Aqui temos demonstrado que a ingestão de
H. hepaticus
carcinogênese da próstata aumentada sozinho em
Apc
Min /+
ratos. Nossa descoberta de que a inflamação reforçada este cancro processo de formação adiciona suporte mecanicista aos benefícios bem documentados de não-esteróides anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) em pacientes humanos. Notavelmente, os ratinhos não infectados que receberam apenas células de nódulos linfáticos se tornou altamente susceptível a cancro da próstata. Esta observação de que o cancro da próstata é indutível por células destilado a partir de um outro órgão pode ajudar a explicar por que etiopatogenia de cancro da próstata em humanos tem sido difícil de elucidar. Ele continua a ser definitivamente determinado se outros micróbios do tracto GI em seres humanos, tais como
H. pylori
, podem ter um efeito semelhante na próstata e outros cânceres não-gastrintestinais de seres humanos.
Materiais e Métodos
animais experimentais
Todos os animais foram alojados e tratados de associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório animal Care (AAALAC) instalações -accredited com dietas, métodos experimentais e habitação como especificamente aprovadas pela Institutional animal Care e do Comitê Use. O MIT CAC (IACUC) aprovado especificamente os estudos, bem como a habitação e manuseamento destes animais.
Apc
Min /+
ratos em um fundo C57BL /6J foram originalmente obtidos a partir dos laboratórios Jackson e produzido in-house para fornecer
Apc
Min /+
ratos e
wildtype
(
wt
) ninhada para destinatários experimentais e doadores.
Helicobacter
status de livre de dos ratos foi confirmada por PCR usando
Helicobacter
primers específicos de gênero, como descrito anteriormente [20].
Experimental
Helicobacter hepaticus
infecção
Um total de 44 ratos experimentais foram tratados com 6 semanas de idade, com
H. hepaticus
(estirpe 3B1, ATCC # 51449) e, em seguida, alojados separadamente em uma área bio-contenção dentro da mesma instalação animal.
H. hepaticus
foi cultivada em condições microaer�icas, preparado, e confirmou puro como descrito em outros lugares [11,20]. ratinhos experimentais receberam 0,2 ml de inóculo fresco por sonda gástrica a cada dois dias para um total de três doses. Ceco, nódulos linfáticos mesentéricos (MLN) e de próstata foram coletadas 6 semanas após a infecção na necropsia e analisadas por PCR para confirmar (intestino) ou excluir (MLN, próstata) colonização.
O delineamento experimental
Um total de 96
Apc
Min /+
ratos e 60 wt ratos foram incluídos em vários regimes de tratamento ou controles como experimentais. Os experimentos foram realizados utilizando dois ensaios separados com 5-6 ratinhos cada, conforme especificado no quadro S1. Sessenta
Apc
Min /+
ratos e 40 wt idade ratinhos de 6 semanas foram injectados por via intraperitoneal com 5 x 10
6 MLN células suspensas em HBSS. Os ratos doadores de células eram do sexo masculino
H. hepaticus
infectados seis semanas antes, ou
Helicobacter
livre de C57BL /6
em peso
ou
Apc
Min /+
camundongos.
TNF-α neutralização
Um total de 24
H. hepaticus
infectado
Apc
Min /+
ou
em peso
ratos na idade de 9 semanas (a partir de 3 semanas após o
H. hepaticus
infecção) receberam anti-TNF-α anticorpo (clone XT-3;. BioExpress, Lebanon, NH) a 200 ug por ratinho três vezes por semana durante três semanas, tal como descrito anteriormente [13]
a detecção de sistémica a expressão da proteína citocina
os níveis de citocinas no soro de 5-6 animais em cada grupo experimental foram analisados utilizando o sistema de ensaio do rato Pro Cytokine Bioplex (BioRad, Hercules, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as amostras de soro foram diluídas usando o kit de diluente de amostra, incubadas com esferas revestidas com anticorpo, seguido de uma incubação de anticorpo secundário e analisados em duplicado sobre um 200 sistema Bio-Plex (BioRad, Hercules, CA).
A avaliação histológica e imuno-histoquímica
Os tecidos fixados em formalina foram processados e embebidos em parafina 5m tecido cortes foram corados com H e, técnica de Warthin Starry ou IHC e avaliados para lesões da próstata por um patologista veterinário cego para provar identidade. As lesões neoplásicas da próstata pré-neoplásicas e precoces, detectado com base em critérios recentes relatório de consenso [34], foram avaliados quantitativamente como descrito anteriormente por Poutahidis et al (2009) [17].
anticorpos Coelho primários utilizados para a imuno-histoquímica incluiu anti -β-catenina (Thermo, Fisher Scientific /Lab Vision, Fremont, CA), anti-laminina (Thermo, Fisher Scientific /Lab Vision, Fremont, CA) e anti-IL17 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Antígenos foram recuperadas com Protease 1 (Roche Diagnostics /Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) para a detecção de laminina. recuperação de antigénio induzida por calor foi realizada com tampão de citrato de pH 6 para β-catenina ou com EDTA tampão de pH 8 para a detecção de IL17. A ligação do anticorpo primário foi detectado com anticorpos de cabra anti-coelho HRP Zytochem Além disso Polímero (Zytomed Systems, Berlim, Alemanha). Sinal foi detectado com diaminobenzidina (Invitrogen, Camarillo, CA) e os tecidos foram contrastadas com hematoxilina
.
Para a quantificação de IL-17 expressão em MLN, trinta 40x imagens de alta campo de energia de seções IHC-coradas foram capturados por grupo de tratamento. Dez imagens de cada grupo foram selecionados aleatoriamente para a contagem. Cálculo automático do número de pixels correspondentes à IL-17 em imagens apareceram num histograma após o processamento de cada imagem de cor com o limiar plug-in de o programa de processamento e análise de imagem ImageJ (NIH, Bethesda, MD). contagens morfométricas foram registados como o número de IHC marcado pixels por imagem.
Análise estatística
A prevalência de LGPIN, HGPIN e micro-adenoCa entre os grupos foi comparada pelo teste de Kruskal-Wallis one-way ANOVA e pós-teste de Dunn. Comparações diretas foram feitas pelo teste de Mann-Whitney. A análise de dados de citocinas foi realizada utilizando o teste t de estudante de duas a-cauda. ** P 0,01;