Abstract

O cancro do cólon é uma doença mortal que afecta milhões de pessoas em todo o mundo. desafios atuais de tratamento incluem a gestão da carga de doença, bem como melhorias na detecção e segmentação de células tumorais. Para identificar doenças assinaturas de antígenos de superfície específicos do Estado, combinamos barcoding de células fluorescentes com alta taxa de transferência de citometria de fluxo de perfis de linhas de cancro do cólon primários e metastáticos (SW480, SW620 e HCT116). A nossa técnica de multiplexagem oferece melhorias em relação aos métodos convencionais, permitindo o rastreio simultânea e rápida de células cancerosas com reduzido esforço e custo. O método utiliza uma análise ao nível de proteína com anticorpos disponíveis comercialmente em células vivas intactas com epitopos para detectar potenciais alvos específicos de tumores que podem ser adicionalmente investigados para a sua utilidade clínica. matrizes de anticorpo multiplexados pode ser facilmente aplicada a outros tipos de tumores ou patologias para abordagens baseadas em descoberta para direcionar a identificação

Citation:. Sukhdeo K, Paramban RI, Vidal JG, Elia J, Martin J, Rivera M, et al . (2013) Multiplex Citometria de Fluxo Barcoding e Antibody Arrays Identificar Antigénio de Superfície Perfis de Primário e linhas celulares de cancro de cólon metastático. PLoS ONE 8 (1): e53015. doi: 10.1371 /journal.pone.0053015

editor: Ilya Ulasov, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de junho de 2012; Aceito: 22 de novembro de 2012; Publicação: 07 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Sukhdeo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Fundação Pediátrica Brain Tumor dos Estados Unidos, Sociedade do tumor cerebral, Fundação Goldhirsh, e James D. McDonnell Foundation. Este trabalho também foi financiado pelo National Institutes of Health concede CA112958 (JNR), CA116659 (JNR), CA154130 (JNR), Pathway to Independence Award CA157948 (JDL), Case Western Reserve Medical Scientist Training Programa T32 GM007250 (KS) e Nacional Prêmio Research Service, National Cancer Institute F30 CA165857 (KS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: RIP, JGV, JE, JM, CTC e RB são pagos funcionários da BD Biosciences. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O cancro do cólon está entre os cancros mais comuns em termos de incidência e Câncer câncer mortes relacionadas nos países ocidentais [1]. câncer de cólon em estágio inicial podem ser geridos com sucesso por ressecção cirúrgica; No entanto, a doença metastática é muitas vezes refractária ao tratamento e responsável pela maior parte da morbidade e mortalidade. A tomada de decisões é guiado pela Comissão Americana Conjunta sobre o Câncer TNM (tumor-nódulo-metástase) de teste que é imperfeito para o prognóstico e não prever a resposta à terapia. A necessidade crítica existe para identificar marcadores objetivos de malignidade que poderiam ser usados ​​para a detecção precoce, o prognóstico, intervenção e /ou segmentação de células cancerosas. Como um exemplo, antigénios associados a tumores (TAAs) têm sido utilizados para a detecção de células tumorais circulantes (CTC) na corrente sanguínea, bem como as células tumorais disseminadas (DTC) na medula óssea, com a capacidade de monitorizar a carga tumoral, prever o risco de progressão, e medir a resposta à quimioterapia. Estas tecnologias incluem produtos clinicamente aprovados como CellSearch ™ (Veridex) que utilizam a imunodetecção dos CTC com base epitelial Molécula de Adesão Celular (EpCAM) expressão membranosa [2]. Os TAAs de superfície celular, em particular, também são importantes porque são acessíveis a sistemicamente-entregue segmentação moléculas (por exemplo, anticorpos, aptâmeros, etc.) que poderiam ser utilizados para fornecer cargas bioactivos, sinalização de bloco, ou activar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos.

Os esforços para identificar TAAs no câncer de cólon e outros tipos de câncer têm contado com uma grande variedade de técnicas, cada uma com seu próprio conjunto de vantagens e limitações [3], [4]. A expressão de genes de microarranjos de perfis ou bibliotecas de expressão de cDNA derivadas de tumor com o soro do paciente (por exemplo serológica de clones expressos de forma recombinante, SEREX) são baseados na expressão de nível de ARN. Estas abordagens podem ser problemático porque pós-transcricional (por exemplo miARNs) e mecanismos pós-translacionais de regulação exercer uma influência significativa sobre a quantidade real de proteína possuído por cada célula, juntamente com a função de sinalização dentro da célula [5], [6]. Isto é, as células com transcritos de baixo nível podem conter desproporcionalmente elevados níveis de proteína traduzida (por exemplo semi-vidas longas) e vice-versa. Espectroscopia de Massa e proteína microarrays matrizes utilizam conjunto de células ou lisados ​​fraccionados a partir de células de cancro do cólon para detectar TAAs diferencialmente expressos. Estes métodos à base de proteínas para detectar AAT pode ser influenciado pela interrupção inerente da conformação da proteína natural durante a preparação da amostra, a representação predominante de proteínas intracelulares, e recursos moleculares limitada (ou seja, anticorpos disponíveis comercialmente) para avaliar rapidamente o potencial de biomarcadores candidatos.

Para identificar TAAs, foi realizada uma imunofenotípicas high-throughput screening de câncer de cólon primário e metastático usando uma matriz de anticorpo contendo cobertura quase completa do cluster de diferenciação (CD) molécula de superfície família, bem como muitos outros antígenos de superfície comum . Também multiplexados tela de matriz do anticorpo através do uso de código de barras da célula fluorescente. Nossos perfis de proteínas de superfície abrangente estratégia identificados incluindo TAAs compartilhado entre amostras de tumor, bem como aqueles que eram específicas do estado de doença. O AT pan-tumor, integrina α6 (CD49f), foi validado para ter um perfil de expressão semelhante ao EpCAM, demonstrando o potencial desta tecnologia para identificar biomarcadores tumorais candidato que poderiam ser utilizados para refinar ainda mais a detecção de células malignas, incluindo CTC /CDT.

resultados

barcoding Multiplex em combinação com matriz de anticorpo triagem

dois adenocarcinoma primário (SW480, HCT116) e uma metastático foram selecionados (SW620) linhas celulares de cancro do cólon para nosso estudo. Todas as três linhas têm uma origem epitelial e sua biologia tumoral tem sido bem estudada na literatura. SW480 foi derivada de um adenocarcinoma primário do cólon de um paciente que, em seguida com recidiva difundida linfonodos mesentéricos metástases que foram utilizados para derivar a linha celular SW620 [7]. O uso de um conjunto de linhas celulares de correspondência paciente reduz a variabilidade genética e permite uma comparação mais controlado das seguintes alterações moleculares progressão metastático [8], [9].

Multiplexagem de todas as três amostras para rotulagem simultânea e análise foi conseguido através de código de barras da célula fluorescente. Nesta técnica, as células são marcadas com um corante intracelular distintiva e, em seguida, reunidas em conjunto antes da marcação do anticorpo. A identidade de cada linha de células é reconhecida no citómetro de fluxo com base na fluorescência a partir de qualquer violeta (Horizon Proliferação tintura; VPD450) ou azul (succinimidil éster carboxifluoresceína; CFSE) lasers de excitação, enquanto o laser vermelho é reservado para a detecção de Alexa647 nos anticorpos secundários. A linha celular SW480 foi código de barras por meio de etiquetagem com VPD450 enquanto SW620 células foram não marcado antes da pooling ambas as linhas de células em uma única população misturada (Figura 1, ver Materiais e Métodos). A terceira linha de células, HCT116, foi código de barras utilizando CFSE e também misturados para gerar um único conjunto de compreendida das três linhas de células diferentes. Em seguida, aplicada a combinação de células para uma matriz de anticorpo constituído por anticorpos 242 e 9 controlos isotípicos atribuídas individualmente através de três placas de 96 poços (Figura 1). Os anticorpos incluídos na matriz de proporcionar uma cobertura de quase todos os conjuntos de diferenciação (CD) molécula e muitos outros antigénios de superfície comum. Como tal, nós fomos capazes de sondar uma ampla gama de proteínas de superfície e gerar assinaturas para cada linha celular de cancro do cólon.

As três linhas de células foram marcadas com ou sem corante intracelular antes da mistura das células em uma única piscina . As células foram então divididas em alíquotas para cada poço para a marcação de anticorpos. O conteúdo de cada poço foram então processados ​​num citómetro de fluxo. A identidade de cada linha celular foi determinada com base na intensidade de fluorescência. As portas apropriadas foram desenhadas permitindo a análise simultânea para cada anticorpo. Histogramas de ratinho de controlo de isotipo IgM são mostrados.

A maioria dos anticorpos (158/242) ficaram totalmente não reactivo ou ligada a menos de 5% das células em comparação com o respectivo controlo de isotipo em todos os três linhas de células e, portanto, não mais investigada para os efeitos do presente estudo (resultados completo mostrada na Figura Tabelas S1 e S1, S2 e S3). Encontrámos 25 anticorpos que reagiram com a maioria ( 50%) de células em SW480, SW620, e linhagens de células HCT116 (Tabela 1 e Figura S2). Muitos destes anticorpos atingiram quase completa ( 95%) marcação das células tumorais. Como esperado, as proteínas relacionadas com a classe principal complexo de histocompatibilidade I foram identificados (β2-microglobulina, HLA-A /A2 /B /C e MIC-A /B) que normalmente são expressas em células nucleadas humanas. Outros TAAs foram categorizados de acordo com a função conhecida, que identificou várias proteínas envolvidas na interação matriz extracelular e adesão celular, tais como vários membros da família integrina, de acordo com a sua biologia epitelial. Uma vez que a e p integrinas formam complexos transmembranares multiméricas uns com os outros, é possível que a co-expressão de integrina α2 (CD49b) e integrina α6 (CD49f) juntamente com β4 integrina (CD104) pode indicar a interacção funcional destes membros da família ou compartilhado regulação no câncer de cólon. Foram também identificadas várias proteínas com função conhecida no metabolismo celular e de sinalização, bem como outros que medeiam a interacção com a adaptativa e sistema imune inato. Estes identificadores comuns poderiam informar sobre a biologia do tumor ou representar vias druggable para alvejar as células tumorais. Além disso, devido à sua ampla expressão na superfície das células malignas, os antígenos pan-tumorais identificadas nesta tela pode ser marcadores úteis para facilitar a identificação das CTCs /CDT.

análise bioinformática

para priorizar nossa lista de TAAs como biomarcadores candidatos, realizamos comparações cruzadas para a coleção Oncomine do gene conjuntos de dados de expressão de microarranjo de câncer de cólon, bem como o tecido normal [10] correspondente. Como tal, nós fomos capazes de avaliar a expressão das proteínas identificadas no nosso tela, em comparação com os perfis de ARN em vários investigadores, as populações de pacientes, e plataformas experimentais. Nós focada nosso exame da expressão TAA no tecido normal do cólon, fígado normais, bem como adenoma do cólon e adenocarcinoma [11] – [14]. Em seguida, seleccionados aqueles genes que foram, pelo menos, duas vezes sobre-regulada (p 0,05) ao longo do tecido normal. Este refinado ainda mais a nossa lista TAA aos genes sobre-expressos CD44, integrina α6 (CD49f) e integrina β2 (CD49b) como os candidatos mais promissores (Figura 2). Notavelmente, a expressão destes genes foi significativamente maior do que no cancro no fígado normal, sugerindo uma janela terapêutica possível para terapias específicas para poupar o tecido normal.

análise heatmap Oncomine em 4 conjuntos de dados publicados para a expressão de antigénios tumorais descritos em tabela 1. Apenas os genes que foram regulados positivamente de forma consistente entre os conjuntos de dados com p 0,05 são mostrados. Os números entre parênteses indicam o número de amostras analisadas. Abreviaturas: cólon normal, NC; cólon ascendente, AC; cólon descendente, DC; cólon sigmóide, SC; cólon transverso, TC (n = 1).

marcador tumoral validação

Para validar os resultados de nossa tela de anticorpos para detectar células tumorais em amostras de pacientes que realizamos imuno-histoquímica (IHQ) e imunofluorescência (IFC) coloração em amostras humanas arquivados a partir mucosa do cólon normal e câncer de cólon primário, bem como metástases de fígado e linfonodos (n = 6 para cada). Foram selecionados α6 integrina (CD49f) com base em sua forte reactividade ( 99%) com todas as três linhas de células de câncer de cólon em nossa tela, conhecida expressão no intestino, e upregulation na tumorigênese [15]. Com efeito, por IHC, que pode detectar coloração α6 integrina no cancro do cólon, bem como na mucosa normal adjacente não envolvido. Além disso, todas as metástases do fígado e nódulos linfáticos mostrou coloração α6 integrina, enquanto o estroma circundante foi negativo. A diferença na intensidade de coloração entre o tumor primário e normal foi subtil, mas mais pronunciado em amostras metastáticos (figura 3). Estas tendências também foram observados por IFC (Figura S3) utilizando um anticorpo de integrina α6 distinta em que co-marcação das células com EpCAM marcador epitelial como uma referência [16] demonstraram que a integrina α6 localizada a todas as células epiteliais do cólon em cada amostra analisada (Figura S3 ). Estes resultados reforçam a utilidade do nosso método de rastreio para identificar os TAAs que poderia ser usado para a detecção de células tumorais em amostras de pacientes e /ou direccionamento terapêutico

a) H . E (superior esquerdo) e integrina α6 IHC (topo direita) de espécimes clínicos de cancro do cólon em baixa ampliação. Áreas de mucosa normal (N) e adjacente primária do cancro do cólon (P) são indicados. painéis inferiores fornecer campos de ampliação superiores de α6 integrina no normal (à esquerda) e tumor (direita). B) Os exemplos representativos de metástases do fígado e linfonodos. As regiões de metástases do cancro do cólon (M) são visíveis por H E (esquerda) e coloração correspondente com α6 integrina (direita). Uma área de fígado normal (G) é indicado. Todas as amostras de nódulos linfáticos continha um alto grau de fibrose em torno da lesão que deslocado tecido linfóide normal a partir do campo de visão. Barra de escala:. 50 mm

Primária contra assinaturas antígeno de superfície metastáticos

A seguir, testaram a capacidade do nosso anticorpo método de triagem matriz para comparar e contrastar as assinaturas de superfície da doença primária e metastática usando linhas celulares SW480 e SW620, respectivamente. perfis superficiais identificadas 11 proteínas associadas a membranas que estavam presentes em, pelo menos, 5% de células e com, pelo menos, duas vezes maior positividade em células SW620, em comparação com SW480 (Tabela 2, Figura S4, e Tabela S4). CD10 (também conhecido como membrana metalo-endopeptidase (MME)) teve a mais alta dobrável mudança na expressão. Tem actividade enzimática para degradar as moléculas de sinalização importantes e é regulada positivamente no melanoma metastático [17] (Figura 4A). O aumento na expressão de CD10 identificado pelo anticorpo foi confirmada por Western blot, que mostra o elevado nível de proteínas em células SW620, mas não em SW480 (Figura 4B). Curiosamente, sete das proteínas identificadas têm conhecido papéis na função do sistema imunitário, sugestivas de um papel na imunomodulação durante a metástase (Tabela 2). Nós também descobrimos 35 proteínas com positividade celular reduzida, pelo menos de duas vezes em SW620 células, em comparação com SW480 (Tabela 3, Figura S5, e Tabela S4) incluindo vários representantes de proteínas envolvidas no metabolismo celular /sinalização, a sinalização do sistema imunitário, e celular aderência.

histograma de matriz de anticorpo para o antígeno CD10 em SW480 (a) e SW620 (B). O vermelho indica isotipo de controlo enquanto a linha azul é coloração para CD10. O número no canto superior esquerdo é a positividade celular. Há uma clara mudança a partir de uma pequena população ombro em SW480 para completar obrigatório em SW620 células. C) Immunoblotting para CD10 confirma a forte mudança na expressão CD10.

A expressão de marcadores de células-tronco

Para completar a nossa profiling antígeno de superfície dessas células do cancro do cólon linhas, foi investigada a expressão de marcadores de células estaminais cancro associado a membrana (CSC). Notavelmente, evidências recentes sugerem que as metástases são colonizados por esses CSCs que possuem as habilidades funcionais de auto-renovação e diferenciação multi-linhagem [18] – [20]. CSCs pode também funcionar no interior dos tumores para propagar e /ou manter tumores ao longo do tempo e, em resposta ao tratamento. Vários grupos têm proposto diversos marcadores que identificam intracelulares e extracelulares para CSCs que muitas vezes têm semelhanças imunofenotípicas para células-tronco de tecidos normais. É importante ressaltar que a detecção de CSCs pode ser condicionada à ligação de pós-translacional epítopos (por exemplo glicosilada) anticorpo. A adição de tais porções de péptidos, muitas vezes desconecta níveis de transcrição a partir da quantidade detectada por anticorpos (por exemplo,

/CD133

transcrições 1 Prominin-eo () epitopo CD133 AC133 em CSCs cancro do cólon [21]). Atualmente estudados proteínas de superfície CSC em câncer de cólon incluem EpCAM

alta, CD133, CD26, CD166 e CD44, de forma independente ou em conjunto [18], [20], [22] – [25]. CD26, um marcador proposta de células estaminais metastáticos [20], e CD166 [24] foram incluídos na matriz de anticorpo e os resultados são fornecidos na Figura S1. Foi realizada fluxo multicolor padrão de citometria de EpCAM, CD133 e CD44 para determinar a sua expressão individual, bem como coloração duplos e triplos (Tabela 4 e Figura S6). Apesar de não testar as propriedades de células-tronco funcionais de quaisquer populações de células tumorais, fomos capazes de detectar a expressão variada de marcadores de imunofenotipagem de células-tronco que variam de quase ausente para completar rotulagem. Estes resultados indicam que imunofenótipos marcador de células estaminais podem divergir grandemente entre tumores e nem sempre está restrita às populações raras. Melhor caracterização dessas populações, para além do âmbito do presente estudo, pode determinar a relevância destes padrões de expressão de fenótipos funcionais.

Materiais e Métodos

declaração Ética

cólon normais e tumorais espécimes de pacientes atendidos na Clínica de Cleveland foram obtidos de acordo com protocolos aprovados pela Cleveland Clinic Institutional Review Board (IRB 4134), incluindo consentimento informado por escrito.

as linhas celulares

linhas celulares de cancro do cólon humano SW480, SW620 e HCT116 foram todos adquiridos a partir da coleção American Type Tissue (ATCC) [7], [8], [26]. As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 50 U /mL de penicilina, 50 ug /mL de estreptomicina em placas de cultura de tecidos (BD Biosciences) numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2. Antes da análise, as células estavam em crescimento e 70% confluentes. Descolamento das células a partir de placas de cultura de tecidos foi realizada usando TrypLE (Gibco) de acordo com o protocolo do fabricante (10 minutos a 37 ° C). O kit de dissociação de papaína foi obtida a partir de Worthington Biochemical. Viabilidade das células foi verificada com exclusão de azul de Trypan e encontrado para ser 98%. Todas as células foram cultivadas e processadas em paralelo.

fluxo de alta capacidade análise de citometria de

alta durante todo análise de citometria de fluxo foi realizada nas três linhas celulares descritas acima, usando um método de rastreio de anticorpo desenvolvido por BD Biosciences [ ,,,0],27]. rastreio de anticorpos foi feito utilizando o painel BD Lyoplate humana na superfície celular marcador de avaliação (560747) contendo anticorpos liofilizados num formato de placa de 96 poços a 0,5 ug /poço. Para análise de citometria de fluxo, as suspensões de células foram tratadas com DNase (em 1 ml de PBS com Ca

2+, Mg

2+, 100 unidades /ml, 10 ul de banco de ADNase) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Antes da coloração com anticorpos, as linhas celulares foram código de barras com diferentes corantes de viabilidade para análise simultânea [28]. células SW480 foram marcadas com Violeta Horizon Proliferação Corante 450 (BD Biosciences 562158) de acordo com o protocolo do fabricante em 1 uM. HCT116 foi marcado com CFSE (Invitrogen, C34554) de acordo com o protocolo do fabricante em 1 uM. SW620 foi deixado não marcado e detectado com base de ser VPD450 CFSE e negativo. A eficiência de marcação foi 99%. Após lavagem apropriada, as três linhas de células foram misturados e ressuspensos em BD Pharmingen mancha Buffer (BD Biosciences) com a adição de 5 mM de EDTA para impedir a reagregação. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo redondo (BD Biosciences) a 30.000 células (10.000 para cada linha de células por poço) para coloração. coloração da superfície celular foi realizada com anticorpos reconstituídos com 1 x PBS a uma concentração de 0,5 ug para cada teste e as células foram coradas vivo em gelo durante 20 minutos. As células foram lavadas três vezes com tampão de coloração e depois coradas com anticorpos secundários específicos da espécie-Alexa647 (BD Biosciences) durante 20 minutos em gelo. As células foram lavadas três vezes em tampão de coloração mais, em seguida, ressuspensas em tampão de coloração com 7AAD (BD Biosciences) para a determinação de células vivas. As células foram analisadas em um sistema FACS Canto (BD Biosciences) equipado com um caudal Sampler alta (com carregador de placa) e os dados foram compilados utilizando com software FlowJo e um modelo do Microsoft Excel 2007 a partir de BD Biosciences (https://www.bdbiosciences.com /support/resources/stemcell/index.jsp#stemtools) para a geração de mapas de calor.

imunohistoquímica

tecidos para IHC e IFC foram obtidos através de uma equipa de recolha de tecidos dedicado dentro do Departamento de Anatomia patologia da Cleveland Clinic. As amostras para IHC foram fixadas em 4% de formalina tamponada com fosfato e embebido em cera de parafina para seccionamento. coloração IHC foi realizada em um Ventana Referência XT imunohistoquímica automatizado utilizando um DAB IHC Kit de Detecção Ventana Optiview com recuperação antigênica CC2. anticorpo primário, policlonal de coelho anti-ITGA6, (Sigma-Aldrich, HPA012696) foi diluído 1:10.

Imunofluorescência

tumor recentemente colhido ou tecido normal foi congelado rapidamente e depositou a -80 ° C. Um patologista gastrointestinal confirmado o diagnóstico histopatológico de cada amostra de forma independente. Tecido normal foi obtido a partir de um local distante do tumor do cólon primários. tecidos frescos congelados foram seccionados a uma espessura de 6 ^ m. As lâminas foram fixadas com paraformaldeído a 4%, secos ao ar e armazenadas a -20 ° C até à sua utilização. Após o tratamento com soro de cabra normal a 10% e 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) durante 45 minutos, as lâminas foram incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho purificado por afinidade anti-EpCAM humana (ab20160, Abcam) a uma diluição final de 1:200 e monoclonal de rato purificado por afinidade anti-integrina humana α6 (MAB1378, Milipore) a uma diluição final de 1:100 durante a noite a 4 ° C, lavadas três vezes com PBS, seguido de incubação durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpo de cabra anti-IgG1 de ratinho 568 AlexaFluor (1:1000 diluição) e anti-rato AlexaFluor (diluição 1:1000) de cabra 488, ambos da Invitrogen. As lâminas foram lavadas três vezes com PBS e contra-coradas com corante nuclear Hoechst 33342 (1:10000) durante 2 min. Após lavagem com PBS, as lâminas foram montadas com FluorSave (Calbiochem).

Western blotting

As células foram lisadas em Tris 50 mM, pH 8,0, 120 mN NaCl, 0,5% de NP-40, proteases inibidores (Sigma-Aldrich) e inibidores de fosfatase (Sigma-Aldrich). Quantidades iguais de lisado celular foram carregada e resolvida num gel de gradiente de bis-Tris a 4-12% (Life Technologies) e transferido para uma membrana de PVDF (Millipore). A membrana foi sondada simultaneamente durante a noite a 4 ° C para anti-CD10 (rato, 1:500, Abcam), e anti-β-actina (rato, 1:8000, Sigma). anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano foi detectado utilizando substrato de quimioluminescência aumentada (1:3000, Santa Cruz).

Stem marcador de células análise

os anticorpos adicionais para o multi-cor citometria de fluxo CD44 -PE (Miltenyi; 1:1000), EpCAM-FITC (BD Biosciences clone EBA-1; 1:1000) e CD133-APC (Miltenyi AC133; 1:1000). As células foram preparadas como descrito acima. controlos de isotipo conjugado com FITC (Santa Cruz) foram utilizados separadamente para cada um dos anticorpos para determinar a coloração da linha de base e da compensação foi realizada de acordo com técnicas padrão. Para a análise de multi-cor, de uma única linha celular foi marcada com todos os três anticorpos num único tubo, lavou-se e carrega-se um fluxo FACS Aria II citómetro (BD Biosciences). Gatings e parcelas foram construídos usando pacote de software FlowJo.

análise Oncomine

Bioinformatics análises foram realizadas utilizando o banco de dados Oncomine (www.oncomine.org). Genes de interesse foram avaliados com base em um p-valor de corte de 0,05 e nenhum filtro nível de expressão foi utilizada.

Discussão

melhorar os resultados para pacientes com câncer provavelmente irá contar com novas modalidades de detecção e de tratamento para doença primária e metastática. Aqui, utilizamos uma técnica de alto rendimento utilizando uma nova matriz de anticorpo com código de barras para definir os perfis de antigénio de superfície de linhas de células de cancro do cólon derivados de tecido de tumor primário e metastático. Nós identificamos um número de antígenos de superfície comuns e diferencialmente expressos, incluindo os ganhos e perdidos na transição para a doença avançada (Tabelas 1, 2 e 3). A robustez do sistema descrito neste documento investigadores braços com a capacidade para pesquisar a expressão da proteína global em estados de doença e /ou a resposta das células a estímulos específicos. Entre as aplicações desta abordagem, a superfície TAAs pode ser explorada para rastreamento da doença e terapia. Alguns TAAs, como EpCAM, já entraram no reino clínica com a capacidade de monitorar a carga da doença. TAAs adicionais devem tornar possível para adicionar especificidade e confiabilidade na detecção de células tumorais in situ, em circulação, ou como células disseminadas. Segmentação de TAAs com anticorpos monoclonais podem também fornecer meios para alcançar a inibição do tumor, como já foi demonstrado na prática com cetuximab (Erbitux, contra EGFR), rituximab (Rituxan; segmentação CD20), e tositumomab (segmentação CD20). cancro avançado besta HER2-positivos pode ser inibida por trastuzumabe entansina (anticorpo anti-HER2, juntamente com um inibidor de microtúbulos) [29]. Além disso, a radioimunoterapia, tais ibritumomab tiuxetan (segmentação CD20), utiliza anticorpos monoclonais para entregar doses de radiação directamente para o tecido do tumor.

a comparação dos nossos marcadores candidatos identificados ao nível da proteína por meio de citometria de fluxo contra a expressão de genes de microarranjos de ARN baseada bases de dados de câncer de cólon (Oncomine) auxiliado na nossa priorização. No entanto, se desconecta biológicas inerentes entre transcritos de RNA e polipeptídeos equipados advertem contra o uso desse filtro como um determinante final para seleção de TAAs [5]. Em vez disso, nós favorecemos a validação do conteúdo informacional do TAA com base em ensaios de nível de proteína adicionais através de um maior número de amostras de doentes (por exemplo, imuno-histoquímica em Tissue microarrays). Nós validado integrina α6 em biópsias de pacientes como um biomarcador tumor candidato abatidos a partir de nosso painel de anticorpos. Os trabalhos irão ser necessário abordar a utilidade clínica para a integrina α6 e outros antígenos de superfície identificadas na detecção de células tumorais e design da terapia.

Os resultados de perfis linhas celulares de cancro do cólon humano expandir os de Zhou et al. que também utilizada uma matriz multiplexada anticorpo [30] – [32]. O estudo utilizou uma matriz de anticorpo impresso com base-slide (DotScan ™) com uma cobertura de 122 marcadores de superfície celular. Encontrámos sinais consistentes com a maioria, mas não todos, dos seus anticorpos que reagem com células SW480 e SW620, linhas que possam ser atribuíveis a amostra técnica de preparação ou de análise. Em contraste com a matriz de anticorpo DotScan, a matriz de anticorpo aqui utilizado sondas quase o dobro de antigénios utilizando técnicas de citometria de fluxo padrão disponíveis na maior parte das instalações de investigação sem a necessidade de equipamento ou de software (isto é DotReader) adicional. O código de barras de linhas de células podem ser adicionalmente ampliados utilizando diluições de 10 vezes de corantes intracelulares e /ou em células duplamente marcado [28]. Semelhante ao método DotScan, no entanto, a matriz de anticorpo pode também ser multiplexados para analisar amostras de tumores primários que contêm múltiplas subpopulações que podem ser reconhecidos por anticorpos conjugados fluorescentes (por exemplo, células tumorais epiteliais com células CEA-FITC e hematopoiéticas com CD45-APC), enquanto o anticorpos na matriz são marcadas com Alexa647. Alternativamente, as subpopulações de tumor podem ser distinguidos com base na física (por exemplo população lado) ou funcional (por exemplo, células estaminais de ensaio) por marcação propriedades destas células às custas de, pelo menos, um canal fluorescente de outro modo utilizado para o código de barras. Por exemplo, o ensaio Aldefluor é possível através da marcação das células-tronco que expressam ALDH1 no canal verde ao sacrificar CFSE barcoding.

Vários fatores influenciam o perfil da superfície das células cancerosas. Entre estes incluem a fase de crescimento das células, meios de cultura, prato substrato de cultura, e o tipo de descolamento enzimática /dissociação, que pode clivar epitopos. Por exemplo, o tratamento de células cancerosas HCT116 do cólon com papaína (enzima utilizada para a dissociação de alguns tumores sólidos) reduziu a detecção de CD44 a partir de 93,4% até 0,5% das células na fase de EpCAM e CD133 (AC133) não foram afectados de forma significativa (Figura S7) . Assim, o cuidado deve ser usado ao projetar experimentos e interpretar dados de telas baseadas em anticorpos. Além disso, nossa 5% de positividade celular de corte pode omitir rara, mas biologicamente relevante populações de células e biomarcadores do AT.

O código de barras combinados e matrizes de anticorpo empregadas no presente estudo poderia ser estendido para células tumorais adicionais rapidamente em seu perfil de cólon e outros tipos de tecidos. A capacidade de multiplexar reacções reduz a variabilidade experimental, o consumo de anticorpo por 10 a 100 vezes, e o tempo para concluir um ensaio. Além disso, esta abordagem pode ser adaptada para a caracterização simultânea de derivados de paciente normal, primário, e /ou metastático, amostras em um único ensaio a uma fracção do tempo e as despesas. Por último, a ligação de epítopos conhecidos usando anticorpos comercialmente disponíveis acelera estudos translacionais destinadas a desenvolver recursos clínicos avançados.

Informações de Apoio

Figura S1.

Os resultados completos da matriz de anticorpos. Os resultados completos do rastreio matriz de anticorpo com código de barras de linhas de células SW480, SW620 e HCT116 CRC. A posição de cada anticorpo na placa é indicado a partir de filas A-H colunas e 1-12. Para gerar um mapa de calor da expressão de antigénios, as células individuais foram coloridos com base na sua expressão de valor 0 (branco) e 100 (vermelho). Note-se que a ratazana CD326 /EpCAM no bem F10 está aprovada apenas para a reactividade do rato pelo fabricante e é um anticorpo diferente do que o utilizado no nosso imunofluorescência e multi-cor

citometria de fluxo doi:. 10.1371 /journal.pone.0053015. S001

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Figura S2. parcelas

Histograma de antigénios na Tabela 1. Os antigénios expressa em 50% de todas as células em todas as três linhas de células. Lote em vermelho é correspondente controlo de isotipo.