Abstract

O DNA inibidores metiltransferase azacitidina e decitabina representam drogas arquetípicas para terapia do câncer epigenética. Para caracterizar a atividade demetilante de azacitidina e decitabina nós tratamos câncer de cólon e células leucêmicas com ambas as drogas e análise de metilação do DNA baseada em array usado de mais de 14.000 genes promotores. Adicionalmente, a desmetilação induzida por droga foi comparado com padrões de metilação de células cancerígenas do cólon isogénicas que faltam tanto metiltransferase de ADN 1 (DNMT1) e DNMT3B. Mostra-se que os padrões de desmetilação induzidas pela droga são altamente específicos, não aleatória e reprodutível, indicando remetilação direccionada de loci específicos após a replicação. Correspondentemente, descobriu-se que dinucleótidos CG CG dentro ilhas tornou-se preferencialmente remetilada, indicando um papel para o contexto de sequência de ADN. Também identificamos um subconjunto de genes que nunca foram desmetilados por tratamento de drogas, quer no cancro do cólon ou em linhas de células leucêmicas. Estes genes de desmetilação-resistentes foram enriquecidas para Polycomb repressivas complexo 2 componentes em células estaminais embrionárias e para o factor de transcrição motivos que não estão presentes em genes desmetilados ligação. Nossos resultados fornecem insights detalhados nos padrões de metilação do DNA induzidos pela azacitidina e decitabina e sugerem o envolvimento de mecanismos reguladores complexos em desmetilação do DNA induzido por drogas

Citation:. Hagemann S, Heil O, Lyko F, ​​Brueckner B ( 2011) azacitidina e decitabina Induzir Gene-específico e não aleatória DNA desmetila�o em linhas celulares de cancro humano. PLoS ONE 6 (3): e17388. doi: 10.1371 /journal.pone.0017388

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de novembro de 2010; Aceite: 1 de fevereiro de 2011; Publicação: 07 de março de 2011

Direitos de autor: © 2011 Hagemann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1463) para FL (www.dfg.de). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

metilação de ADN aberrante é uma importante característica do cancro [1], [2], [3]. Em células cancerosas, hipometilação global está acompanhado por genes supressores de tumores e hipermetilado transcricionalmente silenciados. Estes chamados epimutações contribuir para a perda de controlo de proliferação em células cancerosas [4], [5], [6].

A manutenção de epimutações induzida por hipermetilação requer a actividade contínua do ADN metiltransferases (DNMTs) durante a divisão celular. Assim, a inibição de DNMTs tem sido utilizado com sucesso na terapia do cancro epigenética para inverter epimutações e reactivar genes supressores de tumores silenciados epigeneticamente [7], [8], [9], [10]. Os inibidores DNMT arquétipos 5-azacitidina (azacitidina, AZA) e 2′-desoxi-5-azacitidina (decitabina, DAC) foram aprovados para o tratamento da síndrome mielodisplásica, um distúrbio da medula óssea pré-leucêmica. Apesar da sua utilização em clínica e em vários estudos pré-clínicos, o conhecimento do modo de acção destes fármacos ainda está incompleta [11].

Um dos principais efeitos celulares consistentemente observados de azacitidina e decitabina é a desmetilação de ADN . Como análogos de nucleósidos, AZA e DAC são incorporados no ADN replicante, onde podem formar ligações covalentes com DNMTs [12], [13], [14]. Esta captura de DNMTs leva a desmetilação passivo durante a replicação do DNA e divisão celular. A inibição de metilação de ADN por AZA e DAC tem sido demonstrado com sucesso em loci seleccionado em vários estudos clínicos [7], [9], [15].

Recentemente, os efeitos da AZA e CAD foram também investigados sobre o nível genómico. Devido à limitada disponibilidade de ferramentas adequadas para a análise de metilação do genoma, estes estudos foram inicialmente restringidos à análise das alterações de transcrição induzida por drogas. Por exemplo, perfil de expressão do gene foi usado para analisar os efeitos do DAC no padrão de células cancerosas HCT116 do cólon expressão dos genes e os resultados sugerem que, para além de activação de genes dos genes hipermetilado, regulação negativa da transcrição pode ser um efeito importante de DAC [16], [17]. Mais recentemente, as matrizes Illumina GoldenGate foram utilizados para caracterizar diretamente desmetilação do DNA induzido por drogas em 1.505 dinucle�idos CG que representam 807 genes relacionados ao câncer em células de leucemia mielóide [11]. No entanto, devido à baixa cobertura comparativamente desta matriz, os dados resultantes não foram analisados ​​em pormenor e as características moleculares de respostas desmetilação do DNA permaneceu a ser investigado.

No presente estudo, foram utilizados genoma escala Infinium análise para caracterizar as respostas sistematicamente após desmetilação AZA e DAC tratamento em duas linhas celulares de cancro humano. Para este fim, investigou os níveis de metilação de mais de 27.000 dinucle�idos CG representando mais de 14.000 genes [19] em HCT116 células cancerígenas do cólon e em células HL-60 de leucemia mielóide. Nossos resultados mostram que AZA e DAC desmetilar CGs em ilhas não-CG de forma mais eficiente do que aqueles em ilhas CG (CGI). Além disso, o tratamento com AZA e DAC resulta em padrões de ADN de desmetilação não aleatórios e reprodutíveis em HCT116 e células HL-60. Adicionalmente, foi identificado um subconjunto de CGs que nem é desmetilado droga após-tratamento, nem em células com níveis extremamente reduzidos de DNMT1 e não DNMT3B [20], [21]. CGs desmetilação resistentes estão associados com genes preferencialmente ligados por componentes complexos repressivas Polycomb 2 (PRC2) em células ES e são enriquecidos por motivos de ligação do factor de transcrição que não estão presentes nos genes desmetilados. Estes resultados desvendar os padrões de desmetilação do DNA por AZA e DAC e sugerem que desmetilação induzida por drogas é regulado por mecanismos moleculares definidos.

Materiais e Métodos

cultura celular

Humano células HCT116 carcinoma do cólon e HCT116 duplo knockout (NSO) células (DNMT1 – /-; DNMT3B – /-) foram gentilmente cedidas por Bert Vogelstein (Julho de 2007) e cultivadas sob condições padrão em meio 5A de McCoy suplementado com 5% de L-glutamina e 10% de FCS (Invitrogen). Identidade de células HCT116 foi confirmada por DMSZ (Braunschweig, Alemanha; Janeiro 2008) usando perfis de DNA de oito repetições curtas em tandem. As células HL60 foram obtidas da ATCC e foram cultivadas sob condições padrão em meio RPMI (Sigma) suplementado com 5% de L-glutamina e 10% de FCS (Invitrogen). frescas alíquotas de todas as linhas de células foram usadas para experiências. Para analisar os efeitos de 5-azacitidina (AZA) e 2′-desoxi-5-azacitidina (DAC), as células foram cultivadas em meios suplementados com os compostos, nas concentrações indicadas.

Inibidores

soluções reserva 5 mM de AZA (Sigma) e do DAC (Calbiochem) foram preparadas por dissolução de substâncias em água destilada H

2O (GIBCO) e armazenado a -80 ° C. Imediatamente antes do tratamento, as soluções de estoque foram diluídas em meio de cultura de células para as concentrações indicadas.

análise de metilação de ADN genómico

células tratadas com fármacos foram incubadas com as concentrações indicadas de AZA e DAC depois de um 24 h período de semear, e o ADN genómico foi preparado utilizando o DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen). níveis globais de metilação de DNA genômico foram determinadas por eletroforese capilar, como descrito anteriormente [22].

análise de metilação do DNA matriz baseada

A análise de metilação do DNA específico do gene à base de matriz foi realizada usando o chip talão Infinium HumanMethylation27 tecnologia (Ilumina) de acordo com as instruções do fabricante. Logo, o ADN genómico foi tratado com bissulfito todo o genoma amplificado e hibridado com a HumanMethylation27 BeadChip. Oligômeros, ligados a dois tipos de contas diferentes por loco interrogado, corresponder ou o não metilado ou o estado desnaturado, permitindo extensão de uma única base e detecção. O estado de metilação de uma citosina específica é indicada por valores de beta média (BVA) onde 1 corresponde a metilação completa e 0 a não metilação. valores Delta beta (DB) foram calculados subtraindo valores AVB de células tratadas ou knockout de valores AVB controle. réplicas biológicas (ver Figura S2) de cada experiência foram agrupadas e as sondas de matriz com

P

≥0.05 foram excluídos da análise. Loci foram marcados como metilado se o BVA foi maior do que ou igual a 0,2 [23]. Os dados completos de metilação de CG estão disponíveis na base de dados ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress). Para uma descrição mais detalhada de normalização e cálculos adicionais referem-se a métodos S1. Os resultados foram analisados ​​utilizando software BeadStudio da Illumina, versão 3.1.3.0 e com R, [24] versão 2.10.0. Especificamente, seguintes pacotes R foram utilizados para a análise de dados: gráficos (boxplots), estatísticas (estimativas de densidade de kernel e as análises estatísticas), o pacote limma [25] para a construção de diagramas de Venn e do pacote de rede [26] para a exibição de multivariada dados (parcelas treliça).

454 DNA bissulfito sequenciamento

DNA seqüenciamento bissulfito profundo das CGs de 4 genes (PIK3CG, Ells1, Aff2, NTRK3) foi realizada como descrito anteriormente [27], [ ,,,0],28]. Para 454 sequenciação, o ADN genómico foi tratado com bissulfito amplificado utilizando iniciadores específicos da sequência que contêm códigos de barras específico de tratamento e 454 sequências ligantes (Figura S7). 454 seqüenciamento profunda foi realizada pela Facilidade DKFZ genômica e proteômica Core.

Análise de motivos

Para identificar motivos de ligação do factor de transcrição enriquecido foi utilizada a ferramenta on-line pscan [29] e 130 de ligação do factor de transcrição transcrição perfis de ligação ao factor (

H. sapiens

) a partir do banco de dados Jaspar [30]. A análise de genes foi focada na região de -450 a +50, em relação ao seu local de início da transcrição. Para resumir os resultados da análise pscan, foi gerado um mapa de calor exibindo o logaritmo natural de

P valores

.

Resultados

O estabelecimento de condições de tratamento para aza e DAC desmetilação induzida em células HCT116

Como um primeiro passo para uma caracterização sistemática das respostas desmetilação induzida pela azacitidina (AZA) e decitabina (DAC), que teve como objetivo maximizar a eficiência desmetilação, para minimizar a toxicidade do fármaco [31], [32] e para evitar remetilação como observado durante o tratamento a longo prazo [33]. Para este fim, as células HCT116 tratada com concentrações de fármaco cada vez maiores (Figura 1A) e ao longo de vários períodos de tempo (Figura 1B) para determinar os níveis de metilação genómicas globais por electroforese capilar. Os resultados mostraram claramente para ambas as drogas que máximo desmetilação foi alcançado com concentrações de 1 mM após 24-36 h com DAC mostrando uma redução de 60% e AZA mostrando uma redução de 50% da metilação do DNA global.

Desde azanucleosídeos requerem a replicação do ADN para a sua função, analisou-se o número de células em fase S pode ser afectada pelo tratamento com drogas. As células HCT116 foram tratadas com 0,1, 1, e 10 uM de AZA ou DAC e a distribuição do ciclo celular foi analisada por FACS (separação de células de fluorescência Acitvated). Embora a percentagem de células na fase S foi aumentada após 24 h de tratamento com 0,1-10 uM AZA ou CAD, tempos de incubação mais longos única resultou numa diminuição de células em replicação por várias concentrações da droga (Figura S1A). Além disso, também FACS análises revelaram que as concentrações de droga só elevadas (10 uM) resultou numa paragem fase G2, a qual foi acompanhada por uma redução de células na fase G1 (Figura S1B). Além disso, a morte celular pronunciada foi observada apenas com concentrações elevadas da droga, especialmente após o tratamento com 10 uM AZA, o que indica que as células tratadas com AZA parado para replicar e morreu. Estas observações confirmaram que desmetilação devem ser analisados ​​após 24 horas e à 1 concentração da droga? M para excluir os efeitos de confusão de toxicidade de drogas.

baseada em matriz de todo o genoma de metilação do DNA análise

Para analisar DNA padrões de metilação de células HCT116 em uma escala de todo o genoma foi utilizado Infinium metilação profiling para interrogar o estado de metilação de 27,578 dinucle�idos CG que representa 14.475 genes associados [11], [19]. Metilação de loci individuais foi determinada por valores beta médio (AVB) que variaram de 0 (não metilado) a 1 (totalmente metilado). Com base em estudos anteriores [19], apenas CGs que mostraram uma diminuição ou aumento do seu valor BAV (delta beta, DB) de pelo menos 0,2 foram utilizados para a análise de alterações de metilação. réplicas biológicas de células de controlo e células HCT116 tratados com droga mostraram uma elevada similaridade (Figura S2A, B, C), confirmando a robustez técnica da matriz e a elevada especificidade dos padrões de metilação induzida por drogas.

Subsequente a análise dos dados revelou claramente uma distribuição bimodal de CG dinucleótido metilação com um pico de baixa metilação (13667 de 27.571 CGS) que foi encontrada em valores AVB variando de 0 a 0,2 e um pico de alta metilação (8222 de 27571) que abrangia o intervalo de 0,8 a 1,0 (Figura 1C). Tal como em células não tratadas, foi também observada a distribuição bimodal de metilação após o tratamento de células com AZA e DAC (ver Figura 1C). No entanto, após o tratamento com droga no pico de alta metilação (AVB≥0.8 em células de controlo) foi deslocado para valores mais baixos de metilação, indicando desmetilação induzida por drogas.

A, a análise de metilação global (CE) de células tratadas com HCT116 as concentrações indicadas de AZA e DAC durante 24 h. B, tempo de curso de medição CE de desmetilação induzida por drogas utilizando 1? M AZA ou DAC; Co, células HCT-116 não tratadas. C, as estimativas de densidade de Kernel de dados metilação Infinium para não tratada (Co) e células tratadas com a droga. D, Validação de dados de metilação Infinium usando 454 seqüenciamento bissulfito; dados de metilação de 4 CG loci, medidos por análise Infinium ou 454 sequenciamento, estão fortemente correlacionados (coeficiente de correlação r de Pearson = 0,84); tratamento com AZA e DAC é indicado por A e D, respectivamente; diferentes loci são indicados por cores: PIK3CG (azul), NTRK3 (verde), Ells1 (vermelho), e AFF2 (preto)

Para validar os resultados de matriz metilação, usamos altamente quantitativa 454 bissulfito. sequenciamento [28] para analisar quatro CGs fortemente metiladas que ficou desmetilados por drogas-tratamento em células HCT116. Em média, obtivemos cerca de 300 leituras por CG (veja a Figura S7). A análise de correlação de bissulfito de dados de seqüenciamento e os resultados de matriz (Figura 1D) mostrou uma boa concordância global de ambos os métodos (r = 0,84). Estes resultados demonstram que a matriz Infinium metilação gera uma representação precisa do padrão de metilação HCT116 em nossos experimentos.

padrões desmetilação induzidos por drogas are não aleatória

Outras análises de dados de matriz mostrou que o tratamento com AZA resultou em desmetilação (DB≤-0,2) de 6% (852 de 13.911) do CGS metilado nas células de controlo (Figura 2A). Mostrando uma eficácia ainda maior, o tratamento de DAC induzida desmetilação de 11% (1,487 de 13911) destes locais CG (Figura 2B). Um teste de Wilcoxon confirmaram a significância da diferença entre a metilação em aza e células tratadas com DAC (Figura 2C,

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-16). A maior eficiência de demetilação mediada DAC no nível específico do gene é consistente com a nossa análise global de metilação em células HCT116 (Figura 1A, B).

mudanças de metilação em células HCT116 tratadas durante 24 h com (A AZA ) ou DAC (B); pontos azuis e números representam desmetilado CGs (DB≤-0,2). C, Boxplots mostram a distribuição de CGs metilados em amostras de controlo HCT116 e células tratadas com AZA ou CAD; linhas pretas indicam medianas, entalhes os erros padrão, caixas do intervalo interquartil, e os bigodes percentis 2,5 e 97,5. D, diagramas de Venn indicam CGs desmetilados sobrepostas em células tratadas com a droga.

Com base na observação de que os padrões de desmetilação parecia ser surpreendentemente específico com alta reprodutibilidade inter-replicar, nós saber se ambos os fármacos partilhem comumente desmetilado dinucle�idos CG. Para identificar CGs comumente desmetilados agrupamos AZA e DAC replica, respectivamente, e encontraram uma sobreposição substancial das CGs que foram desmetilados por ambas as drogas (Figura 2D). Esta sobreposição foi significativamente maior do que o esperado por desmetilação aleatório (

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-16, teste exato de Fisher), indicando que loci específicos são preferencialmente desmetilado por AZA e DAC. Apesar da actividade de desmetilação generalizada de AZA e DAC, um número substancial de dinucleótidos CG apareceu resistente a desmetilação induzida por fármacos em células HCT116 (Figura 2A, B).

A resistência à desmetilação induzida por droga é na maior parte em superar DNMT1 ; DNMT3B células double knockout

Para caracterizar ainda mais o CGs resistente a desmetilação induzida por drogas obtivemos perfis de metilação a partir de células HCT116 com níveis muito reduzidos de DNMT1 e perda completa da DNMT3B (células NSO). A análise dos dados revelou desmetilação pronunciada em células NSO com mais do que 85% de CGs metilados ser desmetilado (Figura 3A). As células NSO também mostrou o maior grau de desmetilação representada por valores medianos dB de menos de -0,55 em relação às células de controlo (Figura 3B). Em comparação, observou-se significativamente (

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-16, Wilcoxon rank sum). Menores graus de desmetilação para AZA e DAC (Figura 3B)

A , células NSO mostram diferenças substanciais células HCT116 em seu padrão de metilação; pontos azuis e números representam desmetilado ou hypermethylated CGs (DB≤-0,2 ou ≥0.2). B, Boxplots mostrar a desmetilação (DB) em células HCT16 tratados com a droga e as células NSO; linhas pretas indicam medianas, entalhes os erros padrão, caixas do intervalo interquartil, e os bigodes percentis 2,5 e 97,5. C, Comparação de metilação média relativa de células tratadas com a droga e as células NSO, como determinado por análise global genómico metilação (CE) e a análise de metilação Infinium. D, diagramas de Venn indicam CGs desmetilados sobreposição entre as células tratadas com a droga e as células NSO.

A seguir, comparou o nível de metilação média de CGs associada a genes derivados da matriz Infinium a metilação global, medido por eletroforese capilar (CE) (Figura 3C). Em adição à análise de metilação Infinium, CE também interroga CGs nos elementos repetitivos que compreendem a maioria do ADN metilado do genoma humano [34]. Interessantemente, o grau de desmetilação de ADN genómico total foi sempre maior do que a desmetilação específica para o gene. Isto sugere que os CGs nos elementos repetitivos tornou-se de forma mais eficiente que os GC associado desmetilado-gene. Quando comparamos os padrões de desmetilação de linhas tratados com a droga e celulares knockout, descobrimos que 92% dos CGs desmetilados por AZA e 90% das CGs desmetilados pelo DAC também foram desmetilado em células NSO (Figura 3D). No entanto, os nossos resultados indicam que a desmetilação induzida por drogas de genes específicos é relativamente ineficiente quando comparado com a totalidade do genoma e a DNMT deficientes em células.

desmetilação induzida por drogas de genes supressores de tumores bona fide relacionadas com o cancro e

a seguir, analisadas desmetilação induzida por drogas em um painel de genes associados ao câncer (adaptado a partir do painel de Câncer I GoldenGate metilação, Illumina). Fora de 807 genes associados ao câncer neste painel, 784 (representado por 2.125 CGs) também estavam presentes no chip metilação Infinium. A análise dos nossos dados de metilação revelou que os genes relacionados com o cancro eram mais altamente metilada de genes não relacionadas com o cancro, que estão presentes na plataforma Infinium mas não em GoldenGate (Figura 4A). Além disso, a metilação relacionada ao câncer foi fortemente reduzida em células NSO (Figura 4A)

, os níveis de metilação mediana de CGs relacionadas ao câncer e não-relacionados com o câncer em células não tratadas (CO), as células tratadas com a droga. (AZA, DAC) e as células NSO. B, Heatmap de CG metilação em genes associados ao câncer. C, Heatmap de hypermethylated bona fide tumorais supressores-genes em células tratadas com drogas e DNMT knockout.

Uma análise detalhada revelou que, dos 2.125 CGs associado a um cancro, um conjunto de 906 CGs foi hipermetilado ( AVB≥0.8) em células de controlo HCT116. DAC desmetilado estes genes associados ao cancro hipermetilado com uma eficiência semelhante como AZA (Figura 4B). Curiosamente, observou-se que quase todos os genes foram fortemente desmetilado em células NSO. Resultados semelhantes também foram obtidos por um conjunto de genes hypermethylated bona fide supressores de tumor (Figura 4C). Estes dados ilustram ainda mais a capacidade de DAC e AZA para desmetilar genes supressores de tumor, e sugerem que desmetilação específica do gene global induzida por drogas é comparativamente fraco.

ilhas não-CG e CGs altamente metilados são preferencialmente desmetilado

Para refinar ainda mais nossa análise, a distinção entre CGI e CGs não CGI-associado. Como esperado [35], [36], em CGs não-CGI eram predominantemente metilado (3667 de 7513, AVB≥0.8), enquanto que aqueles em CGI foram principalmente não metilado (12782 de 20.002, AVB≤0.2) (Figura 5A). Além disso, observamos também uma fração proeminente do CGs altamente metilados que foram associados com CGIs (4.527 de 20.002, AVB≥0.8), o que é consistente com a hipermetilação CGI no câncer [6]. Curiosamente, os nossos resultados mostram que ambos, AZA e DAC, desmetilao, uma proporção mais elevada de CGs não metilados localizados em CGI. Especificamente, em células HCT116, AZA desmetilado 3,0% (219 de 7.224) de dinucle�idos metilados CG em CGIs mas 9,5% (633 de 6.687) CGs metilados em não-CGIs (Figura 5B); DAC desmetilado 6,6% (474 ​​de 7.224) de dinucle�idos CG em CGIs mas CGs em não-CGIs (Figura 5C) 15,2% (1.013 de 6.687). Concluímos, portanto, que dinucle�idos CG dentro CGIs tornou-se preferencialmente remetilada após desmetilação passiva induzida por drogas (

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-16, teste exato de Fisher).

A, Boxplots indicam diferenças na metilação entre CGIs e não CGIs. B, Boxplots eficiência show de desmetilação indicado pelos valores DB em aza e DAC-tratados células HCT116 dependentes da associação CG com CGIs. Para A e B, as linhas pretas indicam medianas, entalhes os erros padrão, caixas do intervalo interquartil, e os bigodes percentis 2,5 e 97,5. C, Boxplots mostrar eficiência de desmetilação como uma função do grau de metilação de CG-aza- em células HCT116 e tratados com DAC. níveis de metilação foram agrupados em intervalos de 10% de 0 a 100% de metilação; marcas pretas indicam medianas, caixas do intervalo interquartil, e bigodes do percentis 2,5 e 97,5.

Para analisar se a eficiência desmetilação é uma função do grau de metilação CG, agrupamos CGs por sua metilação nível em 10 intervalos de 10% a 100% de metilação e determinada a que CGS medida em intervalos diferentes foram desmetilado. Os nossos resultados mostram que a desmetilação-aza- induzida DAC e foi mais eficiente para CGs altamente metilados (intervalos de metilação de 60% a 100% de metilação). O significado deste efeito foi ainda ilustrado por uma análise de eficiência análoga desmetilação em células NSO. Aqui, CGs de todos os níveis de metilação foram desmetilado igualmente bem, como foi demonstrado pelo aumento da distância constante das suas medianas para a linha de base (Figura 5D). Concluímos, portanto, que a AZA e DAC preferencialmente levar a desmetilação de dinucle�idos CG altamente metilados.

Desde CGs não-associado-CGI mostrar níveis de metilação mais elevados do que associada à CGI CGs (Figura 5A), que posteriormente analisado se o diferencial metilação de ambos os grupos resultou na diferença observada na eficácia entre a desmetilação cgi e CGS não-CGI-associado (Figura 5B, C). Para este fim, agrupamos CGs, de acordo com o seu nível de metilação em células não tratadas, em intervalos de igual metilação e determinou desmetilação do CGs em CGIs e não CGIs (Figuras S3, S4). Esta análise confirmou que, para os níveis de metilação superiores a 50-60% em células HCT116 (superior a 20-30% para células HL60, ver abaixo), CGS em não-CGI-se significativamente mais do que CGS desmetilado em CGI.

desmetilação induzida por drogas em células de leucemia mielóide

Nós procurado para confirmar nossas descobertas anteriores em um modelo mais intimamente relacionado com a indicação aprovada de DAC e AZA. Para este fim, tratadas células HL-60 de leucemia mielóide durante 24 h com concentrações de fármaco que induzidas na resposta mais forte desmetilação (0,5 uM ou DAC AZA) e perfis de metilação de novo obtidos por análise Infinium. Os resultados mostraram que o tratamento com AZA resultou em forte desmetilação (DB≤-0.2), de 16% (1,839 de 11406) de CGS metilado nas células de controlo (Figura 6A). tratamento de DAC induzida desmetilação de 8% (941 de 11.406) destes locais CG (Figura 6B). níveis de metilação entre as células tratadas com a droga diferiram significativamente (

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-16, Wilcoxon rank sum), como descrito acima para as células HCT116, e nós novamente observada uma forte sobreposição das CGs desmetilado por AZA e DAC (Figura S5E). A comparação das CGs associada ao CGI e CGs não CGI-associado mostrou que CGs em CGIs eram menos metilado do que os não-CGIs, que está de acordo com os nossos achados em células HCT116. Além disso, como já foi observado em células HCT116, AZA e DAC desmetilado CGs em não-CGIs de forma mais eficiente do que os CGIs em células HL60 (Figura 6C, D) (

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– 16, Wilcoxon rank sum). Consistente com os nossos achados em células HCT116, desmetilação induzida por drogas também foi mais eficiente para CGs altamente metilados nas células HL60 (Figura 6E, F).

mudanças de metilação em células HL60 tratadas durante 24 h com AZA (A) ou DAC (B); pontos azuis e números representam desmetilado CGs (DB≤-0,2). C, D, Boxplots eficiência show de desmetilação indicado pelos valores DB em aza e células HCT116 tratados com DAC dependentes da associação CG com CGIs; linhas pretas indicam medianas, entalhes os erros padrão, caixas do intervalo interquartil, e os bigodes percentis 2,5 e 97,5. Boxplots mostrar eficiência de desmetilação como uma função do grau de metilação de CG em E, e F aza-, células HL60 tratadas com DAC. níveis de metilação foram agrupados em intervalos de 10% de 0 a 100% de metilação; marcas pretas indicam medianas, caixas do intervalo interquartil, e bigodes os 2.5th e 97,5 percentis.

Resistência a desmetilação correlaciona com ocupação PRC2 e fator de transcrição de ligação

Nós finalmente considerada potencial mecanismos moleculares que podem modular a eficiência desmetilação induzida por drogas. Estudos anteriores sugeriram que a ligação específica dos complexos Polycomb (PRC2) pode induzir a hipermetilação dos promotores de genes durante a tumorigénese [37], [38]. Por conseguinte, as regiões associadas a PRC2 pode estar predisposto à remetilação rápida após a replicação. Assim, atribuído de dados de associação do genoma para SUZ12, EED e H3K27 trimethylation [39] para os CGs correspondentes no chip Infinium. A análise revelou que CGS associados com os componentes PRC2 interrogados mostram metilação superior mediana que os GC não associada com PRC2 (Figura 7A). Curiosamente, CGs associada à PRC2 foram significativamente mais resistentes a desmetilação por AZA e DAC (Figura 7B, C).

A, Boxplots mostram a distribuição de CG metilação em CGs associada à PRC2 e CGs não-associado-PRC2 em células HL60. B, C, Boxplots eficiência show de desmetilação indicado pelos valores DB em aza e em células HL60 tratadas com DAC dependentes de associação com componentes PRC2. Para A, B e C linhas pretas indicam medianas, entalhes os erros padrão, caixas do intervalo interquartil, e bigodes do percentis 2,5 e 97,5. D, diagramas de Venn indicam CGs que não se tornou desmetilado (AVB≥0.8) em drogas tratados HCT116 e células HL60 e em células NSO, respectivamente. E, Percentagem de CGs desmetilação resistente associados com componentes PRC2 em HCT116 e células HL60, e por sobreposição CGs de ambas as linhas celulares (HCT116 HL60). F, a significação do enriquecimento do fator de transcrição sites em genes com CGs desmetilação resistente em HCT116 e células HL60 e com CGs que se tornaram desmetilados por AZA e DAC em HCT116 e células HL60 (sensível à desmetilação) vinculativo. colunas heatmap representam log (

valores P

) para o enriquecimento de 130 fatores de transcrição.

Para refinar essa análise, posteriormente focado em CGs desmetilação-resistente. Nós identificamos um conjunto de 1129 CGs associada a genes que eram resistentes a desmetilação por AZA e DAC em células HL60 (AVB≥0.8). Curiosamente, 75% destes CGs também eram resistentes a desmetilação induzida por fármacos em células HCT116 (Figura 7D). Uma análise detalhada mostrou que os componentes PRC2 foram fortemente enriquecida em regiões promotoras de CGs resistentes a desmetilação em HCT116 e células HL60, bem como em sobreposição CGs resistentes de ambas as linhas celulares (Figura 7E). Para identificar as características mais distintivas de CGS-desmetilação sensíveis e resistentes ao, também analisamos se os genes que albergam CGs desmetilação-resistente são caracterizados por diferentes conjuntos de factor de transcrição motivos de ligação em comparação com genes que tornam desmetilado. Usando a ferramenta de software Pscan [29], analisou-se a presença de locais de ligação para 130 factores de transcrição em 644 genes (851 CGS) que eram resistentes a desmetilação no HCT16 e células HL-60 e 121 genes (128 CGS) que se tornou desmetilados em ambas as linhas celulares após tratamento com medicamentos. A análise revelou que sensíveis-desmetilação e resistentes ao CGs estão associadas com os genes que apresentam um enriquecimento complementar de locais de ligação do factor de transcrição (Figura 7F, Figura S8). Curiosamente, os factores de transcrição correspondentes também pertencem a diferentes famílias de factor de transcrição (ver Figura S9). Por exemplo, os sites forkhead box de ligação de fatores (Fox) de transcrição são enriquecidas em genes sensíveis desmetilação enquanto básico fator de transcrição Helix-Loop-Helix (bHLH) sítios de ligação são enriquecidas em genes resistentes desmetilação. Estes resultados confirmam a noção de que mecanismos moleculares específicos, com base no contexto de sequência e configuração da cromatina, estão envolvidos na regulação da desmetilação do DNA induzido por drogas.

Discussão

O papel da metilação do DNA no tumor biologia celular tem sido sistematicamente analisada em células HCT116 e células knockout DNMT em dois estudos anteriores [16], [17]. Estes estudos utilizaram a abordagem indireta de desmascaramento farmacológico [40] para identificar genes metilados por meio de mudanças no seu perfil transcricional. Curiosamente, os dados recentes mostram que a AZA e DAC induzir diferentes conjuntos de genes, com apenas pouca sobreposição [41].