Abstract

Fundo

região cromossômica manutenção 1 (CRM1) é um exportador nuclear e do seu inibidor tem uma actividade anti-tumoral em vários tipos de cancro. Este estudo avaliou a eficácia terapêutica do romance inibidor CRM1 KPT-185 sobre o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC).

Métodos

linhagens de células NSCLC foram tratados com KPT-185 para avaliar as mudanças na viabilidade celular, ciclo celular, apoptose, e a expressão da proteína. camundongos NOD-SCID portadores de xenoenxertos de células NSCLC foram tratados por via oral com KPT-276, um análogo clínico de KPT-185, para examinar a eficácia e efeitos colaterais de KPT-276 in vivo.

Resultados

KPT-185 reduziu significativamente a viabilidade das seis linhas celulares de NSCLC em um tempo e modo dependente da dose, incluindo inibidores do factor de crescimento epidérmico receptor de tirosina-quinase (EGFR-TKI) H1975 -resistente e linhas celulares H1650GR. Além disso, KPT-185 induzida por estas células NSCLC para prender na fase G1 do ciclo celular e causou apoptose de um modo dependente da dose. tratamento KPT-185 também reduziu os níveis de proteína CRM1 em seis linhagens de células NSCLC, ea redução pode ser completamente abolida pelo bortezomib inibidor do proteassoma. KPT-185 activada caspase 3, 8, e 9, mas a expressão de survivina inibida em células NSCLC. Em um modelo de xenoenxerto de células de rato H1975, o crescimento do tumor foi significativamente inibido por administração oral KPT-276, e não havia nenhum rato significativa perda de peso corporal ou outros efeitos colaterais.

Conclusões

O presente estudo demonstraram os efeitos anti-tumorais de KPT-185 em células NSCLC, incluindo linhas celulares de NSCLC-resistentes EGFR-TKI. Mais estudos vão avaliar a actividade anti-tumoral de KPT-185 em um ensaio clínico para pacientes com NSCLC

Citation:. Wang S, Han X, Wang J, Yao J, Shi Y (2014) antitumorais Efeitos de um Novel cromossomo Região Manutenção 1 (CRM1) Inhibitor on Non-Small Cell Lung Cancer células in vitro e em xenoenxertos tumorais mouse. PLoS ONE 9 (3): e89848. doi: 10.1371 /journal.pone.0089848

editor: Jingwu Xie, da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Agosto, 2013; Aceito: 28 de janeiro de 2014; Publicação: 04 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer

pulmão é a principal causa de morte por câncer em. o mundo, sendo responsável por 1,3 milhões de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo a cada ano [1]. Histologicamente, aproximadamente 85% dos pacientes com cancros do pulmão são cancros de pulmão não pequenas células (CPNPC) [2], a maioria dos quais são diagnosticados em estágios avançados da doença e não elegíveis para a cirurgia curativa. O tratamento paliativo inclui quimioterapia e radioterapia e mais recentemente, a terapia de direccionamento, tal como o factor de crescimento epidérmico inibidores da quinase do receptor tirosina-(EGFR-TKI) gefitinib, erlotinib, e icotinib. Estas terapias têm aumentado a sobrevida de pacientes com NSCLC [3]; no entanto, os pacientes que inicialmente respondem aos tratamentos EGFR-TKI eventualmente desenvolver resistência adquirida. Assim, novos agentes terapêuticos com baixa toxicidade e melhores resultados são urgentemente necessários para pacientes com NSCLC.

Durante a carcinogênese humana ou progressão do câncer, as células malignas adquirem a capacidade de exportar proteínas nucleares fundamentais que podem influenciar a eficácia do tratamento. Estas proteínas incluem supressores de tumor e reguladores da apoptose das células, é necessária a localização nuclear das quais para a sua função apropriada [4]. Cromossomo manutenção região 1 proteína (CRM1 ou chamada XPO1) é um membro da importin β superfamília de receptores de exportação nuclear (carioferinas). Além disso, CRM1 é o mediador principal da exportação nuclear, pode interagir com sinais ricas em leucina nucleares exportação (Ness) e proteínas de transporte por meio de complexos de poro nuclear para o citoplasma [5] – [7], incluindo EGFR, p53 e do fator nuclear de kapa leve polipéptido estimulador do gene em células B Inhibitor, alfa (IkB-α) [8] – [10]. Se a actividade de exportação mediada por CRM1 está bloqueado, a função da proteína pode ser alterada. Assim, os inibidores CRM1 poderia ser utilizada como uma nova classe de segmentação terapia contra o cancro humano. De facto, até à data, muitos inibidores CRM1 pequenas moléculas foram desenvolvidas e com elevada actividade anti-tumor, tais como leptomycin B (LMB), ratjadone, goniothalamin, N-azolylacrylates, CBS9106 e [11] – [15]. Estes inibidores de moléculas pequenas ligam-se covalentemente ao resíduo de cisteína (Cys528) no sulco de ligação ao NES de proteína CRM1 [16] – [17]. Um ensaio clínico de fase I de LMB foi realizado, mas LMB não era recomendada para o desenvolvimento clínico, devido à elevada toxicidade e falta de eficácia [18]. Depois disso, um certo número de análogos de LMB foram relatados com toxicidade reduzida [19].

Mais recentemente, uma outra classe de inibidor CRM1 foi identificado, incluindo KPT-185 e KPT-276 (Karyopharm Therapeutics Inc .; Boston , MA, EUA). Estes inibidores são selectivamente inibidores de exportação nuclear (SINE), e foram mostrou ser eficaz no tratamento de certos tipos de cancros, incluindo cancro do pâncreas, leucemia mielóide aguda, linfoma das células do manto, resultando em inibição significativa do crescimento e apoptose de células tumorais sem grave toxicidade [20] – [22]. Enquanto isso, os níveis de proteína CRM1 são elevados em tecidos de cancro do pulmão, quando comparado com os tecidos pulmonares normais. Assim, neste estudo, nós exploramos a eficácia terapêutica destes inibidores CRM1 romance droga-like (ou seja, KPT-185 e KPT-276) em células NSCLC

in vitro

e

in vivo

esperançosamente proporcionar novos insights sobre essas drogas para o futuro da terapia alvo de NSCLC.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e reagentes

O humano NSCLC linhas de células A549, H1650, H1975 , H2228, e HCC827 foram obtidos a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). A linha de células resistentes à Gefitinib H1650 (H1650GR) foi estabelecido no nosso laboratório, expondo a célula a concentrações crescentes de gefitinib durante 10 meses. A linha celular resultante H1650GR foi resistente a gefitinib

in vitro

(IC

50 30 mM). As linhas celulares de NSCLC foram cultivadas em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /mL de penicilina, e 100 ug de estreptomicina /ml (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA).

KPT-185 e KPT-276 foram fornecidos pela Karyopharm Therapeutics. Bortezomib foi obtido a partir de Selleck Chemicals LLC (Houston, TX, EUA). O inibidor da pan-caspase Z-VAD-FMK foi adquirido de Calbiochem (San Diego, CA, EUA). Os anticorpos contra o EGFR, GAPDH, clivados por caspase-3,, clivado-caspase-9, poli- (ADP-ribose) polimerase (PARP), survivina, caspase-8 e de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) e contra IgG de coelho IgG de rato foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Além disso, os anticorpos contra CRM1, factor nuclear de leve kapa potenciador gene do polipéptido das células B (NF-kB), e IkB-α foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Todos os outros reagentes e produtos químicos foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

A viabilidade celular ensaio

células NSCLC foram plaqueadas a uma densidade de 6000 células por poço numa placa de 96 poços e cultivadas durante a noite. No dia seguinte, o meio de crescimento foi substituído com meio fresco contendo diluições em série de KPT-185 (até 10 uM) ou dimetilsulfóxido (DMSO) como um controlo. Em placas duplicadas, as células NSCLC foram expostos a KPT-185, gefitinib ou KPT-185 além de gefitinib. Após as células cresceram até três dias, a viabilidade celular foi medida utilizando um Cell Titer 96® Aqueous Non-Radioactive celular Ensaio de Proliferação (Promega, Fitchburg, WI, EUA). O reagente foi adicionado às células e incubadas durante mais 3 h. A absorvência foi então medida a 490 nm com um leitor de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Os dados foram resumidos da percentagem de células não tratadas (controlo DMSO).

Fluxo de ciclo celular por citometria e apoptose ensaio

Depois de tratar células NSCLC com KPT-185 durante 48 h, foram corados com propidio iodeto de tampão (PI) coloração (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA) durante 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, medida por citometria de FACS (BD Biosciences, NJ, EUA). Os histogramas de ADN foram analisadas utilizando software de análise de ciclo celular ModFit LT (Verificar Software House).

apoptose celular foi detectado com um 488 anexina V /Dead Cell Apoptosis Kit de Alexa Fluor (Invitrogen) de acordo com as instruções do kit. Resumidamente, após o tratamento com KPT-185 durante 48 h, as células de ambos suspensão e a adesão foram recolhidas e co-incubou-se com Anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC) e PI, em seguida, medida por citometria de FACS (BD Biosciences). A percentagem de anexina V e células negativas PI foi efectuada com base nos gráficos de pontos de FITC e PI.

isolamento do RNA e qRT-PCR

O ARN celular total foi isolado utilizando o Kit RNeasy Mini ( Qiagen, Hilden, NRW, Alemanha) e, em seguida, sujeitos a transcrição reversa em ADNc, utilizando o sistema de sobrescrito III da primeira cadeia de síntese para RT-PCR (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de ADNc foram ainda amplificados por PCR em tempo real com os seguintes iniciadores sintéticos (Invitrogen): CRM1, 5′-GCCTCACTGAGATTGCTGGT-3 ‘e 5′-TGAAGGGCCTCCATAAGAGT-3′; e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH), 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘e 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’. As condições de PCR foram fixados numa mistura reaccional de 20 ul contendo ADNc (2 mL), iniciadores (400 nM cada, 1 mL), e SYBR green Master Mix (2 ×, 10 mL) (Invitrogen). O ADNc foi amplificado num sistema em tempo real de PCR Lightcycler480 (Roche Applied Science, Penzberg, Alemanha) com os seguintes ciclos: 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 60 s. Todas as amostras foram analisadas em triplicado e repetidas três vezes. Os níveis de expressão relativos de CRM1 foram normalizadas para GAPDH utilizando o método 2-ΔΔCT.

Extracção de proteínas e de Western blot

Após o tratamento das células com KPT-185 durante 48 h, as células foram lavadas duas vezes com solução salina fria de tampão de fosfato (PBS) e lisadas com o tampão de NE-PER (Pierce Biotechnology, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O sobrenadante (lisado celular total) foi quantificada e, em seguida, a electroforese de sódio usando electroforese em gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo (SDS-PAGE). As proteínas foram então transferidas para uma membrana de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA) utilizando electrotransferência. Depois disso, as membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado em pó em solução salina tamponada com Tris mais Tween 20 (TBS-T) durante 1 h à temperatura ambiente e depois incubadas com um anticorpo primário, a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte, as membranas foram lavadas com TBS-T por três vezes e foram ainda incubadas com um conjugado anticorpo-HRP secundário à temperatura ambiente durante 1 h. Após a lavagem com TBS-T mais uma vez, as bandas de proteínas foram detectados com substrato de HRP Ocidental detecção Immobilon (Millipore). imagens positivos foram registados com um instrumento de quimiluminescência (ProteinSimple, Santa Clara, CA, EUA).

imunofluorescência microscopia

A localização e expressão de CRM1, EGFR, IkB-α, NF-kB e p53 foram detectadas na presença e ausência de KPT-185 por microscopia de imunofluorescência. células NSCLC foram tratados com KPT-185 durante 48 h e fixo durante 30 minutos com 4% paraformaldeído. Em seguida, as membranas celulares foram permeabilização por tratamento com Triton X-100 (0,1% w /v) em PBS durante 15 min. Após bloqueio com tampão composto por soro de cabra normal a 5% durante 1 h, o bloqueio, as células foram tratadas com anticorpo primário durante 1 h. Após lavagem com PBS, as células foram tratadas durante 1 h com um anticorpo secundário conjugado com FITC e DAPI. imagens fotomicrográficos foram registrados usando um microscópio de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão).

Mouse NSCLC ensaio de xenoenxerto de células

Quatro semanas de idade do sexo feminino não-obesos diabéticos grave imunodeficiência combinada (NOD -SCID ratos) foram adquiridos a partir do Instituto de Zoologia da Academia chinesa de Ciências, e inoculadas por via subcutânea na região do flanco com uma suspensão de H1975 células (5,0 x 10

6 células). Os volumes dos tumores foram medidos três vezes por semana e foram calculados usando a seguinte fórmula: Volume (mm

3) = (largura (mm))

2 × comprimento (mm) /2. Uma vez que o crescimento do tumor era estável (tamanho médio de 100 mm

3), os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos e tratados oralmente com veículo (Pluronic F-68 /PVP-K29 /32), gefitinib (100 mg /kg QD durante 3 semanas) ou KPT-276 (100 mg /kg, 3 vezes por semana durante 3 semanas) [22]. As curvas de crescimento de xenoenxertos de células de tumor foram gerados representando graficamente os tamanhos relativos dos tumores médios +/- SE. as modificações do peso do corpo (medidos três vezes por semana) foram expressos como uma razão em relação ao peso apenas antes do tratamento inicial. Os ratinhos foram sacrificados quando o diâmetro unidimensional do tumor atingiu 15 mm ou após a perda de 10% do seu peso corporal. O significado destas diferenças entre os diferentes grupos foi avaliada utilizando um teste ANOVA. Os níveis de proteína de CRM1, EGFR e survivina em tumores de xenoenxerto foram detectados por imuno-histoquímica. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal do Instituto de Câncer /Hospital, Academia Chinesa de Ciências Médicas.

Resultados

A inibição da viabilidade celular NSCLC pela KPT-185

Para avaliar a actividade anti-tumoral do inibidor CRM1 KPT-185, foram realizados ensaios de viabilidade celular em seis linhagens de células NSCLC humanas. As células foram tratadas com diluições em série de KPT-185 a partir de 1 nM a 10? M para 2 e 3 dias. Os dados mostraram que KPT-185 reduziu a viabilidade das células NSCLC numa dose e modo dependente do tempo, com um IC

50 a partir de 1,3 nM a 46 uM (Figura 1A-F). Neste estudo, cada linha de células NSCLC representado um subtipo molecular diferente do NSCLC. Curiosamente, KPT-185 também inibiu a viabilidade de H1975 e H1650GR células resistentes ao EGFR-TKI e células HCC827 EGFR-TKI-sensíveis, indicando que KPT-185 pode ser um bom candidato para o controlo eficaz dos cancros do pulmão resistentes EGFR-TKI . Além disso, os nossos dados mostraram que não houve nenhum efeito sinérgico entre o tratamento de EGFR-TKI (gefitinib) KPT-185 e sobre a inibição da viabilidade de células de tumor (Figura 1G H).

Seis linhagens de células foram tratadas com NSCLC KPT-185 durante 48 h ou 72 h. A viabilidade celular foi suprimida por KPT-185 de uma maneira dose e dependente do tempo (A~F). KPT-185 inibiu a viabilidade celular em H1975 (G) e as células HCC827 (H), quando comparado com o efeito do tratamento com gefitinib EGFR-TKI. (N = 3).

Indução de NSCLC parada do ciclo celular por KPT-185

Para determinar se a redução da viabilidade das células após o tratamento KPT-185 foi associado a alterações na célula a distribuição do ciclo de células NSCLC, analisamos os ciclos celulares em células NSCLC após 24 h de tratamento com KPT-185. Em comparação com as células de controlo, o tratamento KPT-185 preso células NSCLC na fase G1 do ciclo celular. No entanto, esta conclusão não ocorreu em células H2228 que não era sensível ao tratamento KPT-185 (Figura 2).

As células foram fixas durante a fase G1 do ciclo celular em células sensíveis KPT-185. (N = 3).

A indução de apoptose de células NSCLC por KPT-185

Uma vez que o tratamento KPT-185 induzida NSCLC paragem do ciclo celular na fase G1 do ciclo celular, nós determinou se KPT-185 induziu apoptose de células NSCLC. Com efeito, os nossos dados mostram que o tratamento KPT-185 durante 48 h aumentou os níveis de coloração Anexina V de uma forma dependente da dose, indicando apoptose celular (Figura 3A). Além disso, o tratamento KPT-185 induzida H1975 células em apoptose, mas gefitinib não ter um efeito. Entretanto, tanto KPT-185 e gefitinib induzida apoptose em células HCC827 (Figura 3B, 3C 3D). Além disso, o tratamento de células com KPT-185 e gefitinib não resultar em um efeito sinergético sobre a apoptose de células.

As seis linhas celulares de NSCLC foram tratados com KPT-185 e, em seguida, a apoptose de células de tumor foi avaliada por citometria de fluxo de ensaio . Os dados indicaram uma indução dependente da dose da apoptose das células após 48 h de tratamento (A). KPT-185 apoptose induzida em H1975 (B) e as células HCC827 (C) quando comparado com o tratamento com gefitinib EGFR-TKI. Um banco de dados representativos de ensaio de apoptose em células H1975 foi mostrado (D). (N = 3).

regulação negativa do CRM1 e outras proteínas em células NSCLC pela KPT-185

Em seguida, analisamos o efeito de KPT-185 sobre a regulamentação da CRM1expression em células NSCLC. O nível de proteína CRM1 foi marcadamente reduzida após tratamento com KPT-185 em todas as seis linhas celulares de NSCLC, quando comparado com células de controlo (Figura 4A). No entanto, os níveis de ARNm CRM1 foram maiores em H1975, células HCC827 e H1650GR após o tratamento com KPT-185 do que a das células de controlo (Figura 4B), indicando que a redução da proteína CRM1 por KPT-185 não estava ao nível da transcrição. Em seguida, investigou se KPT-185-expressão da proteína reduzida foi CRM1 devido à activação da via de ubiquitina /proteassoma. H1975, HCC827, e H1650GR células foram tratadas com KPT-185, na presença ou ausência de bortezomib (10 nM; inibidor de proteassoma) durante 48 h. Na presença de bortezomib, a redução de proteína CRM1 por KPT-185 foi praticamente bloqueado (Figura 4C), sugerindo que a depleção induzida por CRM1 KPT-185 requer a activação da via da ubiquitina /proteassoma. Em seguida, avaliou os níveis de várias proteínas que são mostrados a ser exportado por CRM1, tais como EGFR, p53, e IkB-α. tratamento KPT-185 também reduziu a expressão de EGFR em todas as seis linhas de NSCLC de células (Figura 4D Figura S1). No entanto, não houve alteração significativa nos níveis de NF-kB e IkB-α nessas células, mas IkB-α e NF-kB foi acumulado no núcleo no grupo de tratamento KPT-185 quando comparada com o grupo de controlo (Figura 4D, 4E Figura S1). Curiosamente, após o tratamento com KPT-185, o nível de p53 foi regulado positivamente em células A549, que têm um tipo de p53 selvagem, enquanto que a proteína p53 foi regulada negativamente e confinada ao núcleo em H1975 células, que têm uma proteína p53 mutante (Figura 4D 4E). Enquanto isso, não houve nenhuma alteração nos níveis de proteína p53, tanto na HCC827 e H2228 células, e proteína p53 não foi detectável em células H1650 e H1650GR (Figura 4D).

As seis linhas celulares de NSCLC foram tratados com KPT- 185 durante 48 h. A expressão da proteína CRM1 foi regulada para baixo (A E), enquanto que os níveis de mRNA CRM1 foram supra-regulados (B, N = 3). Na presença do bortezomib inibidor de proteassoma, a redução de proteína CRM1 após o tratamento KPT-185 foi praticamente bloqueado na H1975, células HCC827, e H1650GR (C). expressão de EGFR foi reprimidos após o tratamento KPT-185. Os níveis de proteínas NF-kB e IkB-alfa não foram afectados significativamente. KPT-185 upregulated p53 do tipo selvagem em células A549, regulada negativamente p53 mutante na célula de H1975, e não houve qualquer efeito na célula e HCC827 H2228. Além disso, o p53 não foi detectada em células H1650 e H1650GR (D E, 400 ×).

A indução da activação da caspase em células NSCLC por KPT-185

Para melhor elucidar os eventos moleculares subjacentes pelos quais KPT-185 induziu a apoptose em células NSCLC, foi analisada a activação e clivagem de caspases, a PARP e survivina após o tratamento as seis linhas celulares de NSCLC com KPT-185 durante 48 h. Os nossos dados mostraram que, quando em comparação com células de controlo, as caspases-8, -9 e -3 e PARP foram clivados ou activado, enquanto que a survivina, um inibidor da apoptose, foi regulada negativamente em células NSCLC tratados por KPT-185 (Figura 5A). Nós então tratado H1975 células com 100 mM do inibidor pan-caspase Z-VAD-FMK para 2 h antes do tratamento KPT-185. Verificou-se que a apoptose de células H1975 induzida por KPT-185 foi completamente inibida por Z-VAD-FMK (Figura 5B).

As seis linhas celulares de NSCLC foram tratados com KPT-185 durante 48 h. Caspases-8, -9 e -3 e PARP foram ativadas ou clivada, mas survivina foi regulada para baixo (A). Na presença do inibidor da pan-caspase Z-VAD-FMK, a apoptose induzida por KPT-185 foi completamente bloqueada em células H1975 (B, N = 3).

Efeito do KPT-276 em células NSCLC in vivo

em seguida, avaliou os efeitos da CRM1 inibidor KPT-276 (o equivalente clínico para KPT-185) em células NSCLC

in vivo

. O primeiro transplantadas células NSCLC H1975 com um TKI de EGFR-mutação de resistência em ratinhos NOD-SCID. Depois de xenotransplantes tumorais foram estabelecidos, os murganhos foram administrados oralmente com veículo, gefitinib, ou KPT-276 tratamentos. Nós descobrimos que o tratamento KPT-276 crescimento do tumor inibiu significativamente quando comparado ao grupo de xenotransplante tumoral tratados com gefitinib veículo ou (

P Art 0,05; Figura 6A). Os ratinhos toleraram o administrado oralmente KPT-276 (100 mg /kg) tratamentos, como indicado por uma média de perda de peso 6,64% (Figura 6B). Além disso, os efeitos colaterais de quimioterapia, como, tais como diarreia, não foram observadas. Os níveis de proteína de CRM1, EGFR e survivina em tumores de xenoenxerto foram detectados por imuno-histoquímica. A expressão de CRM1 foi regulada negativamente, e CRM1 foi confinada ao núcleo no grupo de tratamento KPT-276 quando comparada com o grupo de controlo e tratamento com gefitinib (Figura 6C). A expressão do EGFR e survivina foi regulada negativamente em grupo de tratamento KPT-276 quando comparada com o grupo de controlo e tratamento com gefitinib (Figura S2).

células NSCLC H1975 foram transplantadas em ratinhos NOD-SCID. Ratos com um xenoenxerto de células NSCLC estabelecidos foram administrados por via oral com veículo, gefitinib ou KPT-276. o crescimento de xenoenxertos de células de tumor foi avaliada durante 30 dias. As curvas de crescimento de tumor mostraram uma supressão significativa do crescimento de células H1975 in vivo quando comparado ao veículo ou gefitinib tratamento (

P

0,05; A). Os murganhos administrados por via oral KPT-276 (100 mg /kg, três vezes por semana durante três semanas) toleraram bem o tratamento (B). O nível de proteína de CRM1was detectada em tumores de xenoenxerto por imuno-histoquímica (C, 400 ×).

Discussão

Neste estudo, nós exploramos a eficiência terapêutica de novos inibidores CRM1 droga-like em NSCLC células

in vitro

e

in vivo

. Os resultados mostraram que o inibidor SINE CRM1 KPT-185 reduziu a viabilidade das células NSCLC e induziu-os a sofrer apoptose de um modo dependente da dose. KPT-185 também exibiram uma actividade anti-tumoral forte em linhas celulares de NSCLC-resistentes EGFR-TKI. Além disso, KPT-185 também induziu a paragem do ciclo celular em G1 /checkpoint S em linhas KPT-185-sensíveis de células NSCLC, níveis sub-regulada de CRM1 e proteína EGFR, p53 acumulada, IkB-α e NF-kB nos núcleos, e caspases-8 activada, 3, 9 e proteínas em células NSCLC. A administração oral de KPT-276 inibiu significativamente o crescimento do tumor de xenoenxerto em ratinhos NOD-SCID H1975-rolamento, que eram resistentes a tratamento de EGFR-TKI. Mais importante ainda, os ratos toleraram o tratamento KPT-276 com a perda de peso corporal mínimo e sem toxicidade grave. Mais estudos vão avaliar os mecanismos moleculares subjacentes à actividade anti-tumoral KPT-185 em um ensaio clínico para pacientes com NSCLC.

De fato, estudos recentes têm demonstrado que CRM1 superexpressão está associada com a progressão do tumor e da mortalidade em vários cancros humanos [23]. Por exemplo, mostrou que Zhang CRM1 siARN levou a CRM1 proteína knockdown e a viabilidade celular do linfoma de culas do manto reduzida (MCL), e a translocação da proteína induzida SINEs CRM1 para o núcleo, onde a sua expressão foi regulada para baixo [22]; Assim, estes dados parecia ser oposto aos inibidores ex CRM1 [13], [14], [24], [25]. No presente estudo, foi demonstrado que KPT-185 reduziu a viabilidade das células NSCLC, a apoptose induzida, e preso células NSCLC na fase G1 do ciclo celular. Estes dados são consistentes com estudos anteriores sobre inibidores CRM1 em diferentes cancros humanos [13], [14], [22] – [25]. Nossos dados atuais mostraram ainda que o inibidor SINE KPT-185 regulada para baixo os níveis de proteína CRM1 em células NSCLC através da degradação de proteassoma induzida KPT-185 da proteína CRM1. Assim, um mecanismo possível citotóxica dos inibidores CRM1 é através da via da ubiquitina /proteassoma, reduzindo a exportação de proteínas supressoras de tumor (TSP) a partir do núcleo para o citoplasma, tal como a p53, IkB-α e NF-kB. Etchin et ai. ainda demonstrado que os inibidores CRM1 poderia ligar-se ao sulco de proteína CRM1 que era normalmente ocupado pelo NES, e bloquear a exportação de proteína dirigida-CRM1 [21].

Um certo número de estudos demonstraram que a activação de NF-kB é essencial para manter a viabilidade de células tumorais, e a inibição da actividade de NF-kB por si só é suficiente para induzir a morte de células [26], [27]. No entanto, em nosso estudo, não observamos quaisquer alterações significativas nos níveis de expressão de IkB-a NF-kB e em células NSCLC após o tratamento KPT-185, mas IkB-α e NF-kB foi parcialmente acumulado no núcleo em KPT-185 grupo de tratamento. CRM1 é conhecido para exportar p53 do tipo selvagem a partir do núcleo para o citoplasma das células cancerosas através de seus NES C-terminais, permitindo a degradação eficientes do p53 por proteossomas. Em nosso estudo, descobrimos que a inibição da actividade CRM1 por KPT-185 p53 impedido de sair do núcleo, resultando na acumulação de p53 nuclear e estabilização no p53 ampla tipo células NSCLC A549. Em células H1975, que têm uma p53 mutante, KPT-185 tratamento regulada negativamente os níveis de p53 e p53 confinado ao núcleo. Além disso, os níveis de p53 foram estáveis ​​tanto nas células H2228 e HCC827, sugerindo que a apoptose nestas células é independente de p53. Surpreendentemente, o p53 não foi detectável em células H1650 e H1650GR. A linha celular H1650 foi previamente descrita como uma linha de células transportando tipo mutante de p53 [28].

EGFR regula processos tumorigénicas importantes, incluindo a proliferação, a resistência à apoptose, angiogénese e invasão, e é frequentemente sobre-expressa durante o desenvolvimento e progressão do NSCLC [29]. EGFR podem ser detectados no núcleo e exportados para o citoplasma por CRM1. Em nosso estudo, demonstramos que a expressão de EGFR foi reduzida seguinte expressão KPT-185-reduzida CRM1 em células NSCLC. Noske et ai. [30] mostraram a associação inversa de EGFR com expressão CRM1 em tecidos de cancro do ovário. Níveis de expressão de proteína de EGFR foram reduzidos após a exposição de células de cancro do ovário para leptomycin B (LMB), sugerindo que CRM1 desempenha um papel na transactivação intracelular de EGFR [30]. Em contraste, Lo et al. o aumento dos níveis de EGFR nuclear detectados após o tratamento LMB em células de carcinoma epidermóide A431 humano [31], indicando que o aumento de EGFR nuclear pela LMB fornece um mecanismo plausível pelo qual as células shuttle EGFR na superfície celular através do complexo do poro nuclear, e para dentro do compartimento nuclear.

Survivina é um membro da família dos inibidores de apoptose e protege contra apoptose por quer directamente ou indirectamente inibir a activação de caspases [32]. A PARP é um substrato da caspase e a sua activação leva a apoptose. Em nosso estudo, KPT-185 era capaz de ativar caspases-8, -9 e -3, PARP, mas inibir a survivina em todas as seis linhas celulares de NSCLC. Os nossos dados demonstraram que a corrente também KPT-185 foi capaz de induzir a apoptose tanto em células NSCLC EGFR-TKI-sensíveis e resistentes ao. Além disso, descobrimos que o inibidor pan-caspase Z-VAD-FMK impediu completamente a apoptose induzida por KPT-185 em H1975 células. Os nossos resultados mostraram que a apoptose induzida por SINE era dependente da activação da caspase em linhas celulares de NSCLC.

KPT-185 tem sido demonstrado que possuem propriedades farmacocinéticas inadequados

in vivo

, por via subcutânea ou por via oral. No entanto, KPT-276, estruturalmente relacionados com KPT-185, é adequada para terapia oral [22]. Mutka et ai. observou que LMB tem efeitos fora do alvo contra outros que CRM1 proteínas e que esses efeitos fora do alvo pode contribuir para os efeitos colaterais da LMB (perda de peso corporal ~ 20%) [33]. No nosso estudo, utilizou-se KPT-276 a uma dose de 100 mg /kg, três vezes por semana durante três semanas para o tratamento de ratinhos portadores de xenoenxertos de células de tumor de NSCLC. Verificou-se que estes ratinhos tolerada (menos do que 10% de perda de peso corporal) do tratamento. Além disso, KPT-276 exibiram elevada actividade anti-tumoral em xenoenxertos de células NSCLC-resistentes EGFR-TKI. Estes resultados indicam que KPT-276 pode ser um inibidor CRM1 úteis para o tratamento clínico de doentes com NSCLC, especialmente para pacientes EGFR-TKI-resistente.

Apoiando informação

Figura S1.

A localização e expressão de EGFR, IkB-α, e NF-kB foram detectados na presença e ausência de KPT-185 por microscopia de imunofluorescência. A expressão do EGFR foi regulada negativamente, e IkB-α e NF-kB foi acumulado no núcleo no grupo de tratamento KPT-185 quando comparada com o grupo de controlo (400 ×)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0089848.s001

(TIFF)

Figura S2.

Os níveis de proteína de EGFR e survivina foi detectada em tumores de xenoenxerto por imuno-histoquímica. A expressão de EGFR e survivin foi regulada negativamente no grupo de tratamento KPT-276 quando comparados com o grupo de tratamento e controle de gefitinib (400 ×)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0089848.s002

(TIF)

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer a empresa Karyopharm Therapeutics Incorporated para fornecer compostos SINE KPT, e Prof. Michael Wang e Zhang Liang, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, Houston Texas, EUA, para a crítica comentários.

O estudo foi apresentado como um cartaz na AACR 2013 reunião anual em Washington DC, EUA (Resumo # 3444).