Abstract
Introdução
fisiologicamente relevantes pré-clínica
ex vivo
modelos recapitulando CNS tumor micro-ambiental complexidade vai ajudar o desenvolvimento de agentes biologicamente-alvo. Nós apresentamos a caracterização detalhada de agregados tumorais gerados usando o sistema de cultura celular 3D Rotary (RCCS).
Métodos
linhas celulares de cancro do SNC foram cultivadas em culturas 2D convencionais ea RCCS e comparação com uma coorte de 53 gliomas de alto grau pediátricos realizados pelo genoma ampla expressão dos genes e microRNA matrizes, juntamente com imuno-histoquímica,
ex vivo
magnéticos espectroscopia de ressonância e avaliação de sensibilidade às drogas usando o inibidor da histona deacetilase, Vorinostat.
Resultados
agregados macroscópica RCCS recapitulou a morfologia heterogêneo de tumores cerebrais com uma borda de proliferação distinta, núcleo necrótico e um gradiente de tensão de oxigênio. expressão gênica e microRNA análises revelaram diferenças significativas com expressão 3D intermediária para culturas 2D e tumores cerebrais primários. Caracterização metabólica revelou perfis diferenciais, com um aumento de metabólitos específicos de tumores em 3D. Para avaliar o potencial do RCCS como uma ferramenta de teste de drogas, determinou-se a eficácia da Vorinostat contra agregados de U87 e KNS42 células de glioblastoma. Ambas as linhas demonstrou marcadamente reduzida sensibilidade quando se examina em condições de cultura 3D em comparação com abordagens clássicas tela de drogas 2D.
Conclusões
A nossa caracterização completa demonstra que a cultura 3D RCCS de células tumorais do cérebro alto grau tem efeitos profundos sobre os perfis genéticos, epigenética e metabólicas das células cultivadas, com as células que residem como um fenotipo intermédio entre o de culturas 2D e tumores primários. Há uma discrepância entre a cultura 2D e perfis moleculares de tumores, e RCCS parcialmente re-capitula características específicas de tecidos, testes de drogas permitindo que em um
ex vivo
sistema mais relevante
Citation:. Smith SJ, Wilson M, Ward JH, Rahman CV, Peet AC, Macarthur DC, et al. (2012) recapitulação de Heterogeneidade do tumor e assinaturas moleculares em um modelo de cancro cerebral do 3D com diminuição da sensibilidade ao desacetilase de histona inibição. PLoS ONE 7 (12): e52335. doi: 10.1371 /journal.pone.0052335
editor: Daniel Monleon, Instituto de Investigación Sanitaria INCLIVA, Espanha |
Recebido: 16 de julho de 2012; Aceito: 16 de novembro de 2012; Publicação: 18 de dezembro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Smith et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela confiança tumor Samantha Dickson Cérebro, da Gentleman Night out Charity eo Joseph Foote tumor cerebral Trust. RR é uma Nottingham Advanced Research Fellow e SJS é um Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde /UON Fellow Clínica. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
os tumores cerebrais são a principal causa de morte relacionada com câncer em crianças e adultos de até 40 anos de idade, sendo responsável por 10.000 anos perdidos de vida esperada anualmente no Reino Unido. neoplasias cerebrais invasivas alto grau de recorrência apesar da terapia multimodal; portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas estratégias de tratamento para melhorar o resultado. O desequilíbrio na eficácias compostos entre
in vitro
e
in vivo
experimentos tem dificultado consideravelmente a descoberta e desenvolvimento de um armamento mais eficaz e diversificada de agentes quimioterapêuticos [1]. Como resultado, apenas ~ 5% da droga candidatos cancerosas que entrem em testes clínicos jamais receberá a aprovação de os EUA Food and Drug Administration, o que representa uma enorme carga financeira e clínica [2], [3]. A falta de modelos de tumores cerebrais em crianças, em particular, tem significado que as drogas de quimioterapia que são actualmente prescritos tinha sido inicialmente desenvolvida para o tratamento do sistema nervoso adulto Central (SNC) e outros tumores sólidos. Isso ignora o acúmulo de evidências que os tumores cerebrais adultos e pediátricos, embora histologicamente semelhantes são molecularmente distinta [4] e, portanto, abrigar mutações oncogênicas distintas que podem fornecer novos alvos terapêuticos. À medida que a terapia de próxima geração a alvos biológicos e relacionados com a via específica, a avaliação da eficácia do medicamento e um melhor tratamento será atingido não apenas através romance descoberta de medicamentos, mas também através de melhores
ex vivo
modelos pré-clínicos que melhores Recapitulando complexidade micro-ambiental [5]. Existe uma crescente apreciação da heterogeneidade de tumores cerebrais intra-tumoral de alto grau com a existência de diferentes populações de células dentro do mesmo tumor que cada exibir diferentes alterações moleculares [6]. Atuais modelos de testes de drogas pré-clínicos não replicar esses recursos-chave.
bidimensional (2D) culturas de células monocamada representam um modelo altamente reducionista de cancros, devido à perda de matriz extracelular fisiológica (ECM) no plástica artificial superfícies. Consequentemente, as células nessas condições se adaptar, alterando padrões de expressão gênica e sinalização redes, perdem propriedades relevantes, tais como a diferenciação, a polarização e comunicação célula-célula, e artificialmente promover a hiper-proliferação [1], [7]. A facilidade de absorção da droga em uma população de células homogênea em superfícies 2D aderentes, também resultados prováveis em uma superestimação da eficácia determinada a partir de
in vitro
telas citotóxicos, levando a ineficácia dos agentes candidatos
in vivo
[8]. Além disso, as culturas 2D falta complexa estrutura do tecido 3D e, portanto, prejudicar os esforços para testar a eficácia de certos compostos candidatos, tais como agentes anti-angiogénicos /vasculogênicos antes da
in vivo
estratégias [8]. De fato telas citotóxicos 2D identificar quase exclusivamente anti-proliferativa agentes candidatos [9], [10].
Há um crescente reconhecimento de que conceitualmente tridimensionais tecnologias de cultura (3D) podem refletir com mais precisão fisiopatologia do tumor e recapitular a
in vivo
tumor microambiente
in vitro
. Como respostas farmacológicas em estudos de xenotransplante não consistentemente se correlacionam com a resposta clínica, é imperativo que os melhores modelos preditivos específicos humano são desenvolvidas numa fase pré-clínica. Consequentemente, esses modelos devem informar melhor os estudos de xenotransplante e primeiros ensaios clínicos em termos de prever a resposta farmacológica aos compostos quimioterapêuticos [11], [12], [13], reduzindo assim, adicionalmente, a exigência de quantidades substanciais de animais para testes de drogas anti-câncer .
esferóides multicelulares são pequenos
in vitro
agregados que variam de 100-1000 m de diâmetro e comumente cultivadas em suspensão utilizando frascos spinner, géis de colágeno e líquidos-sobreposições [14]. O tamanho do esferóide cultivado é limitada a menos do que 1 milímetro por forças de cisalhamento no sistema de cultura e falta de coesão interna /ECM dentro do esferóide. A geometria do esferóide contribui para a formação de populações de células heterogéneas: a camada externa prolifera comparativamente a culturas de monocamada; a camada interna de células pode tornar-se em repouso; e o núcleo de esferóides podem desenvolver necrose [15]. A proliferação de células de tumor cultivadas em esferóides 3D é geralmente mais lenta do que a de culturas em monocamada, apresenta diferentes perfis metabólicos e, tipicamente, exibe sensibilidade reduzida à quimioterapia e à radioterapia [7], [16], [17], [18], [19] , [20]. Por exemplo, citosina-arabinósido (Ara-C) e Taxol que inibem a proliferação de linhas de células de glioblastoma em culturas 2D, mas falharam ensaios clínicos, mostram sensibilidade marcadamente reduzida em culturas em 3D; uma dose de Ara-C 10 vezes mais elevada do que a dose eficaz em culturas 2D foi necessária para reduzir a proliferação de células de tumor [21], [22], [23]. Um sistema de cultura 3D esferóide mais recente a partir do Eccles e colegas forneceu automatizado, capacidade de imagiologia quantitativa que é potencialmente compatível com estudos pré-clínicos de alto rendimento de segmentação e pode reduzir a necessidade de estudos com animais. Além disso ensaios funcionais de migração e invasão do tumor são permitidas neste sistema, facilitando, assim, a seleção da droga, que abrange uma ampla gama de compostos [24]. Consistentemente, assinaturas de culturas de células primárias de expressão de genes são mantidas em culturas de esferóide, tal como glioblastoma [25], [26].
géis biológicos, tais como Matrigel também têm sido usadas como um substrato para crescimento de esferóides. Matrigel é um extracto de membrana basal derivado do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm que contém uma matriz diversificada de componentes, incluindo o colagénio tipo IV, laminina e outras moléculas de ECM, em adição aos sinais solúveis, tais como citoquinas e factores de crescimento [27]. LaBarbera e colaboradores demonstraram que os fenómenos relacionados com o tumor, tais como a transição epitelial-mesenquimal em tumores da mama metastático pode ser recapitulado em cultura esferóide à base de Matrigel 3D, um sistema adicionalmente utilizado como uma ferramenta de rastreio de alto rendimento para os inibidores de moléculas pequenas para o carcinoma da mama [28 ]. No entanto, como uma mistura de Matrigel é bastante indefinido e variável de proteínas, não tem sido amplamente utilizada para fins de rastreio de drogas. Porosas de colágeno /andaimes hialurônico fornecer um
in vitro
modelo mais fisiologicamente relevante que permite que as interações entre os diferentes tipos de células e ECM como descrito recentemente para epiteliais e adipócitos co-culturas mamárias [29]. Outros modelos 3D mama canceroso foram descritas recentemente em que as células de cancro da mama malignos são incorporados na membrana basal reconstituída com a co-cultura directa de células endoteliais, que permite uma investigação dos efeitos estimuladores do último tipo de célula [30]. culturas em suspensão, tais como frascos rotativos foram investigadas, mas são muitas vezes prejudicada pela tensão de cisalhamento e turbulência [31] efeitos experimentados pelas células.
Um método de gerar agregados 3D em um ambiente não-turbulento e onde as células secretam endógena ECM e fatores de crescimento é o Rotary sistema de cultura celular (RCCS ™), originalmente desenvolvido pela National Aeronautics and Space Administration (NASA) para estudar os efeitos da microgravidade sobre células e tecidos [32]. O sistema tem sido utilizado com sucesso em engenharia de tecidos [33], a biologia do desenvolvimento [34] e microbiologia [35]. O método RCCS foi estendido para a propagação das células tumorais (por exemplo, no cancro da próstata [36] e cancro colorectal [37]), onde mínima força de cisalhamento e continuamente suspensa cultura ‘queda livre’ incentiva a agregação celular. Isso permite que os processos biológicos /bioquímicos para desenvolver sob condições ambientais e operacionais monitorados de perto e estimula as células para formar 3D agregados de tecido semelhante que mostrar fisiologicamente fenótipos relevantes, tais como menor taxa de proliferação, as regiões de hipóxia e vasculatura [1]. Não há publicações anteriores examinaram especificamente o crescimento do tumor cerebral no RCCS ou feita a comparação entre a cultura 2D, 3D e cultura amostras de tumor cerebral reais. Análise da expressão de genes, e microARN perfis metabólicos demonstra que os agregados RCCS (em comparação com as culturas de monocamada 2D) exibir um genótipo significativamente mais semelhante para tumores cerebrais reais e podem assim replicar o comportamento do tumor (por exemplo, resposta a agentes terapêuticos) mais fielmente. Além disso, os agregados em 3D podem ser cultivadas durante, pelo menos, até 4 semanas, em comparação com cerca de uma semana em cultura em monocamada 2D (devido à confluência celular), proporcionando um meio para avaliar a eficácia da droga e doses repetidas ao longo de um período de tempo mais longo. Nenhum dos componentes da matriz ou ECM artificiais são introduzidos, permitindo que as células para produzir suas próprias estruturas e sem barreiras artificiais à difusão de drogas. O aumento do tamanho e heterogeneidade de RCCS agregados em comparação com outros métodos de cultura e.g. neurospheres ou esferóides multicelulares, aumenta a sua relevância fisiológica, permitindo testes de drogas contra uma simulação de todo um tumor em vez de uma linha de células sub-clone selecionado como em 2D ou neurospheres. Criticamente, a RCCS agrega exibição marcada heterogeneidade interna com populações distintas de células proliferativas, senescentes e necróticas, influenciados em parte pela concentração de oxigênio mudando de borda para o núcleo do agregado. Este recapitula exclusivamente a variedade de
in vivo
nichos ambientais dentro do qual as células cancerosas residem e que são pensados agora fundamental para o desenvolvimento e progressão tumoral.
No presente estudo, buscou-se comparar a histologia neoplásica , morfologia, taxas de proliferação, expressão gênica e microRNA, perfis metabólicos e sensibilidade inibidor da histona deacetilase entre culturas em monocamada em 2D e agregados de células tumorais 3D gerados usando o RCCS ™, a fim de avaliar a sua relevância para a modelagem e doença do cancro cerebral de medicamentos básicos pré-clínica descoberta. Para nosso conhecimento, esta é a primeira caracterização molecular abrangente de agregados de tumor cerebral cultivadas utilizando o RCCS, demonstrando semelhança considerável nos níveis de chave genes neoplásicos a tumores reais e o primeiro relato de RCCS sensibilidade aos medicamentos em comparação com culturas 2D expressão.
Materiais e Métodos
linhas celulares – dois e três Cultura Dimensional
as seguintes linhas celulares estabelecidas foram utilizados no estudo – KNS42 (pediátrica GBM, um presente amável de C. Jones , Institute of Cancer Research, Londres [38], [39]), U87MG (adulto GBM) [40], [41], PFSK-1 (pediátrica sistema nervoso central primitivo tumor neuro-ectodérmica, adquirido a partir de ATCC [42]) , DAOY (meduloblastoma pediátrica, adquirido a partir de ATCC [42], [43]), GB1 (in-house derivado pediátrica gliomas de alto grau [42]), SF188 (glioblastoma pediátrica, [44], [45]) e HBMEC (humano celular microvascular cerebral endotelial, um presente amável de Naveed Khan, da Universidade de Nottingham, [46], [47]). KNS42 foram mantidas em meio modificado de Dulbecco de Eagle (DMEM) /F12, U87MG, DAOY, C6 e GB1 em DMEM, PFSK-1 e HBMEC no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) médias 1640. Todos os meios foram suplementados com 10% (
v /v
) de soro fetal de bovino (excepto HBMEC que estavam em 20% (
v /v
) de soro fetal bovino), 100 UI /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. Os mesmos meios foram utilizados para cada linha de células em cultura de 2D e 3D e toda a cultura teve lugar numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO
2 atmosfera, excepto os controlos hipóxicos para o estudo Hypoxyprobe que foram levadas a cabo numa câmara hipóxica em um 1% O
2 ambiente. cultura 3D utilizou o celular Rotary Sistema de Cultura (RCCS) (Synthecon, Luxemburgo), situado dentro de uma incubadora de cultura de células. A cultura foi iniciada pela introdução de um × 10
6 células como uma suspensão de células individuais para um recipiente de cultura de 10 ml e inicialmente rodado a 15 rotações por minuto (rpm). Uma vez formado um agregado visível, velocidade de rotação foi ajustada para equilibrar a força de Coriolis contra a gravidade para manter o agregado em queda livre estacionária. Agregados foram colhidas em três semanas com a mídia que está sendo mudadas duas vezes por semana (50:50). Uma vez colhido, agregados ou foram fixadas em 4% (
w /v
) PFA ou armazenado congelado a -80 ° C até serem necessárias para análise posterior.
Preparação de RNA e PCR em tempo real
o ARN total foi isolado a partir dos sedimentos celulares ou agregados usando o
mir
Vana kit de isolamento de ARN (Ambion, Austin, TX). A transcrição reversa para ADNc (incluindo a eliminação de ADN genómico) foi realizada utilizando a RT
2 kit First Strand (SA Biosciences, Frederick, MD). Matriz de PCR em tempo real foi realizado utilizando a moléculas da matriz e de adesão extracelulares PCR array SA Biosciences (HAP-013A), analisando 84 relacionada ECM genes, 5 genes de controlo e os poços de controlo positivo e negativo (Tabela S1), usando um CFX96-PCR em tempo real máquina (BioRad, Hercules, CA). Validação de PCR em tempo real para os dados de todo o genoma foi realizada contra os genes listados na Tabela S2. eficiência iniciador foi calculada e a expressão de cada gene calculadas em relação ao ARN adulto normal do cérebro (FirstChoice, Ambion) usando o modificado equação Pfaffl R = E
ΔCT alvo (CT controlo-CT gene alvo amostra gene alvo) /E
controle ΔCT (CT gene controle de exemplo controle- gene controle CT) com GAPDH como gene controle.
pacientes e amostras de Tecido
o grupo de amostras de pacientes (n = 53) analisados no matriz expressão do gene eram um grupo previamente publicado [4] com os dados disponíveis on-line (número de acesso GEO GSE19578). Todas as amostras foram
De Novo
pediátricos gliomas de alto grau obtidos
ante mortem
no Reino Unido Neurosurgical centros com todos os diagnósticos confirmados por avaliação patológica central. A coorte de amostras analisadas quanto à expressão microARN (n = 77, 72 indivíduos) consistiu em 21 amostras também analisados na coorte de expressão de genes, com as outras amostras também avaliação central e todos os gliomas de alto grau pediátricos primários. pleno consentimento e aprovação ética foi obtida para a sua utilização neste estudo, do Grupo de Câncer e Leucemia infantil no Reino Unido e aprovação MREC ética e Trent local (06 /MRE04 /86).
Gene Expression e da Matriz MicroRNA matriz
análise de expressão gênica foi realizada no Affymetrix U133 Plus2 plataforma, com triplicados repetições experimentais para as culturas em 3D. análise MicroRNA foi realizada utilizando a plataforma Nanostring (Nanostring Technologies, Seattle, WA) contra 747 espécies de microRNA humanos e virais (lista completa das sondas e alvos na Tabela S3).
Espectroscopia de Ressonância Magnética (MRS)
agregados tumor de três semanas foram colhidas, lavadas com PBS e flash congelado em nitrogênio líquido assegurar nenhum traço de PBS ou mídia permaneceu. Antes da análise por RMN, os agregados celulares foram descongeladas à temperatura ambiente antes de ser colocada em 4 mm de rotores de zircónia com 12 ou 50 inserções ul dependendo do volume da amostra. Qualquer volume restante no rotor foi preenchido com D
2O contendo um vestígio de trimethylsilylproprionate-D4 para auxiliar a calibração de desvio químico. A análise por RMN foi realizada num Bruker HCD sonda HR-MAS com gradientes pulsados disponíveis na direcção z. A sonda operado a uma força de campo magnético de 500 MHz gerados por um ímã blindado ativamente Oxford Instruments com um console de 3 canais Bruker Avance II. fiação da amostra foi ajustado a uma taxa de 4800 Hz e sonda de temperatura foi ajustada para 278 Kelvin para minimizar a actividade metabólica. A sequência NOESY-PRESAT foi usada para suprimir o sinal de água e de 16 K pontos de dados foram obtidos com uma largura espectral de 16 ppm após um pulso de 90 graus. médias de sinal (256 ou 512) foram adquiridas, dependendo da relação sinal-ruído da amostra, tendo 14 ou 28 minutos, respectivamente. Os dados de RMN Raw foi processado usando o algoritmo Tarquin [48] para extrair quantidades para os seguintes metabólitos: Acetato (Ace); alanina (Ala); colina (Cho); creatina (Cr); glutationa (Glth); glutamina (Gln); glutamato (Glu); glicina (Gly); guanidinoacetato (Gua); glicerofosfocolina (GPC); hypotaurine (H-Tau); mio-inositol (Ins-m); lactato (Lac); lipídios (LIP); N-acetilaspartato (NAA); fosfocolina (PCH); cilo-inositol (Ins-s); succinato (Suc) e taurina (tau). Lac foi retirado da análise posterior, devido à sua elevada dependência de retirada meios de cultura celular. perfis de metabólitos foram normalizados para a sua soma e quantidades foram escalados para dar igualdade de variância. A trama heatmap foi gerado com dendrogramas em ambos os eixos calculados utilizando o método de ligação completa.
Drug Testing e Alamar Blue Viabilidade Ensaio
Para 2D ensaios de proliferação monocamada, U87 e KNS42 células foram semeadas em poços de uma placa de 24 poços a uma densidade de 5 x 10
4 células por poço. ensaio de proliferação Alamar Blue foi conduzido primeiras 24 horas pós-semeadura (designado Dia 1) e conduzido em três dias sucessivos posteriormente. Resumidamente, o meio foi removido dos poços e as células lavadas duas vezes com PBS para garantir que nenhum vestígio de vermelho de fenol permaneceu. PBS fresco (1 ml) foi adicionado a cada poço contendo as células tumorais, seguida pela adição de 100 ul de corante indicador azul de Alamar (Invitrogen, UK). Após a incubação durante 2 horas a 37 ° C, 100 mL alíquotas foram transferidas para poços individuais de uma placa de 96 poços de fundo em negro-de emissão triplicado e fluorescência medida a 585 nm utilizando um leitor de placas (Tecan, Suíça). Os poços contendo células 2D foram substituídos com meio fresco e este procedimento foi repetido nos dias 2, 3 e 4, a fim de monitorizar a proliferação de cada população de células ao longo de três dias. Para 3D ensaios de proliferação cultura, U87 e KNS42 células foram cultivadas como RCCS agrega a 10-15 rpm durante 1 semana. No dia seguinte foi designado dia 1 de análise de proliferação e todas as leituras subsequentes de proliferação (unidades de fluorescência arbitrárias) foram calculadas em relação à leitura de base Dia 1, representando, assim, as variações na dimensão do agregado, após 1 semana de cultura. 3D agregados foram removidos a partir dos vasos RCCs e colocados em poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços e lavadas duas vezes com PBS. Tal como referido acima, 1 ml de PBS fresco foi adicionado a cada poço contendo um agregado seguido pela adição de 100 ul de corante indicador azul de Alamar (Invitrogen, UK). Após a incubação durante 2 horas a 37 ° C, 100 mL alíquotas foram transferidas para poços individuais de uma placa de 96 poços de fundo em negro-de emissão triplicado e fluorescência medida a 585 nm utilizando um leitor de placas (Tecan, Suíça). agregados de tumor foram posteriormente devolvidas aos navios RCCS irradiadas com UV e cultura 3D reiniciada. Este procedimento foi repetido nos dias 2, 3 e 4, a fim de monitorizar a proliferação em tempo real de agregados ao longo de três dias. Os dados para todas as análises de proliferação é apresentada como a percentagem de viabilidade celular média de três experiências independentes com barras de erro indicando o erro padrão da média (SEM). Para análises de citotoxicidade 2D monocamadas, as células foram semeadas 24 horas antes do tratamento droga numa gama de concentrações de 0-10 uM e o ensaio de azul de Alamar realizado após a exposição ao fármaco de 72 horas. Para análises de citotoxicidade de culturas em 3D, as células foram cultivadas na RCCS durante 1 semana para permitir agregados para formar, seguido por remoção dos agregados de vasos RCCs e colocando em poços individuais de uma placa de 24 poços. O ensaio de azul de Alamar foi realizada como anteriormente descrito e o estado de proliferação nesta fase designada como linha de base. Os agregados foram devolvidos aos navios RCCS esterilizada por UV e cultivadas em meios contendo Vorinostat (Selleck Chemicals, 5 mM) a uma gama de concentrações de 0-30 uM. análises de proliferação foram repetidas após a exposição e os dados normalizados para leituras de linha de base da droga 72 horas para ter em conta os tamanhos de agregação variadas devido à variação estocástica na cultura RCCS 3D.
Imunohistoquímica
A imuno-histoquímica foi realizada de acordo com a protocolos publicados anteriormente [49]. Agregados foram formalina fixo e cera incorporado antes do corte. A recuperação de antígenos foi realizada por tratamento com vapor em tampão citrato, durante 40 minutos. Anti-Ki67 (Dako, antigénio Ki67 de ratinho anti-humano monoclonal, clone MIB-1) foi aplicada durante 30 minutos à temperatura ambiente a concentração de 1:50. Anti-beta-galactosidase (Abcam, rato monoclonal 4C7 DC1) e anti-CDKN2A /p16INK4a (Abcam, monoclonal de ratinho 2D9A12) foram utilizadas na 1:1000 e 1:800 concentrações, respectivamente, durante uma hora à temperatura ambiente. Aplicou-se anticorpo secundário (100 ul Dako peroxidase de rábano conjugada coelho anti-rato) durante trinta minutos à temperatura ambiente antes da aplicação de 3,3′-diaminobenzidina cromogénio. tecidos de controlo positivo foram amígdalas (Ki67) e carcinoma do cólon (beta-galactosidase e p16). A imuno-histoquímica para Ki67, p16 e beta-galactosidase foi marcado por contagem dos núcleos positivos como uma percentagem de núcleos totais dentro de vários campos de alta potência (de pelo menos três para cada amostra). Para amostras de tumor na microarrays de tecido, a área mais positivo ( “hot-spot ‘) para cada núcleo foi marcado. Para culturas de células submetidas a análise hypoxyprobe (Hypoxyprobe Inc., Burlington, MA), o reagente hypoxyprobe (pimonidazole) foi aplicado duas horas antes da colheita em 200 uM de concentração. As amostras foram, em seguida, fixado como padrão e imuno-histoquímica realizada utilizando o anticorpo primário fornecido com o kit hypoxyprobe em 1:200 concentração. Os controlos positivos foram realizadas utilizando culturas de células em 2D cultivadas numa câmara hipóxica em 1% de oxigénio atmosférico. Os controlos negativos foram realizados por omitindo o anticorpo primário e também com as células em monocamada cultivadas em 21% de oxigénio, 5% de CO
2 condições atmosféricas.
Imunofluorescência
células em monocamada ou agregados 3D foram RCCS fixado em 0,4% de paraformaldeído e bloqueadas em soro de cabra normal a 5% /0,1% de Triton-X durante 1 hora à temperatura ambiente. Para imunomarcação, as células foram incubadas com anticorpo anti-beta-galactosidase (Abcam, rato monoclonal 4C7 DC1) utilizando uma diluição 1:1000 durante a noite a 4 ° C numa câmara humidificada. As células foram lavadas e incubadas com o anti-rato Alexa Fluor-555 (Dako) utilizando uma diluição 1:300 no escuro à temperatura ambiente. Os núcleos foram visualizadas utilizando DAPI e sinais de fluorescência foram registadas utilizando um microscópio de fluorescência Leica DMRB vertical.
Microscopia Electrónica de Varrimento
três agregados tumorais dimensionais foram lavadas três vezes em PBS fresco e fixados em glutaraldeído a 3% durante 12 horas. As amostras fixadas foram, então, lavadas três vezes em PBS e desidratadas durante mais 12 horas de exposição ao ar à temperatura ambiente. Fixo e agregados desidratados foram montadas em bases de alumínio e foram revestida por borrifamento com ouro a uma taxa de corrente de árgon, de 30 mA durante 3 minutos. A morfologia celular e organização dos agregados foi visualizada usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV) (JEOL JSM-6060LV) a 10 kV.
Análise Biostatistical
Análise da expressão gênica e dados da matriz de microRNA foi realizados utilizando o pacote GeneSpring (Agilent, Reino Unido), com comparação entre os grupos realizada pelo teste t bicaudal não pareado com Benjamini-Hochberg correção múltipla teste. Análise dos dados de PCR de matriz foi realizada utilizando o pacote estatístico com base de acompanhamento Excel (SABiosciences). análise de caminho foi realizada utilizando o pacote Ingenuity IPA (Ingenuity Systems). software SPSS foi utilizado para realizar teste t de Student e valores de p foram considerados significativos em menos de 0,05 por toda parte.
Resultados
macroscópicas Agregados RCCS 3D recapitular a Heterogêneo Morfologia dos tumores cerebrais primários
foram observadas
agregados celulares macroscópicas visíveis após 24-48 horas após o início da cultura e alcançou tamanho máximo após uma semana de cultura. Diâmetro de agregados foi amplamente consistente para cada linha celular utilizada, mas variou entre diferentes linhas celulares. Os agregados maiores resultou quando se utiliza a linha de células PFSK-1 a até 9 mm de diâmetro e KNS42 (até 5 mm). U87 múltiplo formado (5-10) agregados mais pequenos cada 1-3 mm de diâmetro. agregados foram mantidas em cultura viável em cultura durante até seis semanas, mas foram tipicamente colhidas em três semanas para a caracterização molecular e celular.
Agregados de todas as linhas celulares tinha morfologia global semelhante reprodutível com um aro altamente celular (tipicamente 100 -200 mm de espessura) de células viáveis, uma zona de transição intermédia de células saudáveis e moribundos mistos e um núcleo central de baixa celularidade com a maioria das células necrótico ou apoptótico (Figura 1 a-H). Para a linha celular GB-1 derivada, a comparação foi possível com o tumor primário original e este demonstrou morfologia muito similar e a densidade de crescimento celular com uma média de 424 células por campo de alta motorizado (HPF) para o tumor primário e 398 células por HPF para o agregado 3D (não houve diferença estatisticamente significativa, p = 0,452) (Figura 1 I-J). O 3D agregados também se assemelhava tumores em sua re-capitulação de heterogeneidade com regiões de alta e baixa celularidade. A borda alta celularidade e núcleo de baixa celularidade também foi visualizado com microscopia eletrônica de varredura com elementos da matriz extracelular secretados observados como os agregados 3D começou a estabelecer ECM endógena (Figura 1 K-L). Em contraste, as células em monocamada GB-1 2D exibir uma morfologia mais homogénea em todo o vaso de cultura sem regiões distintas espacialmente (Figura 1M).
vistas de energia A-D -Baixa de secções de parafina fixadas com formalina embebido GB1, U87, DAOY e PFSK-1 agregados respectivamente, demonstrando baixa celularidade núcleo necrótico e rim proliferativa densamente celular. E-H – vistas alto poder de GB1, U87, KNS42 e PFSK-1, respectivamente, demonstrando a heterogeneidade celular na interface RIM /núcleo e tecido necrótico com figuras apoptóticas no núcleo. I J – agregado GB1 e amostra de tumor primário a partir do qual linha celular foi derivada respectivamente demonstrando semelhança na morfologia celular e densidade de crescimento. K L – microscopia eletrônica de varredura de GB-1 RCCS agrega com borda denso e núcleo exposto no K e alta superfície vista alimentado em L. M – Morfologia do GB-1 células monocamada 2D. Barras de escala 100 um de A-D e 25 um em E-J e M. Ampliação × 500 em K e × 2000 em L.
RCCS Agregados Mostrar Heterogeneidade e proliferação celular Taxas reduzidas
a imuno-histoquímica para Ki67 revelou a grande maioria das células proliferativas em 3D agrega-se no interior da jante, ou zona de transição, com nenhum ou muito poucas células positivas no núcleo central (Figura 2 a-C). O padrão exato de coloração variou pouco entre as linhas de células, mas todas as linhas exibiu estas características gerais. A coloração para p16 e beta-galactosidase, marcadores de senescência celular, apresentaram resultados semelhantes, em que ambos os anticorpos corados uma proporção muito mais elevada de células no interior do núcleo em relação ao aro. Para a linha de KNS42, P16 coradas 90% de células no núcleo e 40% de células no aro, enquanto o beta-galactosidase coradas 47% no núcleo e 1% no aro. Este padrão foi repetido para todas as outras linhas de células (dados não apresentados). Ambos P16 e beta-galactosidase mostrou uma proporção semelhante de coloração positiva no núcleo dos tumores primários em comparação com o núcleo de 3D agregados (Figura 2 D-I). Imunohistoquímica dessas metas também foi realizada contra a nossa coorte (n = 150) de espécimes glioma de arquivamento de alto grau pediátricos em microarrays de tecido. Encontramos uma associação estatisticamente significativa entre a coloração Ki67 em áreas perivasculares e sobrevida do paciente conforme relatado anteriormente [49].