Abstract

Neuropilinas, inicialmente caracterizado como receptores neuronais, como co-receptores para fatores de crescimento relacionados com o cancro e foram recentemente envolvido em várias vias de sinalização que conduzem a organização do citoesqueleto, angiogênese e progressão do câncer. Em seguida, procurou-se investigar a capacidade de neuropilina-2 para orquestrar a transição epitelial-mesenquimal em células de cancro colorrectal. Usando siRNA específico para direcionar a expressão neuropilina-2, ou a transferência genética, observou-se pela primeira vez que a neuropilina-2 e HT29 expressão dota Colo320 para a formação de xenoenxerto. Além disso, neuropilina-2 conferida uma forma de fibroblastos-like às células cancerosas, o que sugere um envolvimento de neuropilina-2 em transição epitelial-mesenquimal. Com efeito, a presença de neuropilina-2 em linhas celulares de carcinoma colorrectal correlacionou-se com a perda de marcadores epiteliais, tais como a citoqueratina-20 e E-caderina e com aquisição de moléculas de mesenquimais, tais como vimentina. Além disso, mostrámos pela superfície experiências de ressonância de plasmão que a neuropilina-2 é um receptor para o factor de crescimento transformante-β1-. A expressão de neuropilina-2 em linhas celulares de cancro de cólon foi de facto demonstrado promover crescimento transformante-a sinalização do factor de β1, conduzindo a uma fosforilação constitutiva do complexo de Smad2 /3. O tratamento com inibidores da quinase do receptor de TGFp-tipo1 específicos restabeleceu os níveis de E-caderina e inibida, em parte, a neuropilina-2 induzida por expressão de vimentina, sugerindo que coopera neuropilina-2 com o receptor de TGF-tipo1 para promover a transição epitelial-mesenquimal em células de cancro colorrectal. Nossos resultados sugerem um papel direto da NRP2 em transição epitelial-mesenquimal e destacar um cross-talk entre neuropilina-2 e sinalização TGF-β1 para promover a progressão do câncer. Estes resultados sugerem que neuropilina-2 preenche todos os critérios de um alvo terapêutico para interromper múltiplas funções oncogênicos em tumores sólidos

Citation:. Grandclement C, Pallandre JR, Valmary Degano S, Viel E, Bouard A, Balland J , et ai. (2011) Neuropilin-2 Expressão Promove TGF-β1-Mediated epitelial para mesenquimal Transição em células de câncer colorretal. PLoS ONE 6 (7): e20444. doi: 10.1371 /journal.pone.0020444

editor: Pendure Thi Thu Nguyen, da Universidade Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de novembro de 2010; Aceito: 03 de maio de 2011; Publicação: 01 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Grandclement et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. API Grant -chū 2008, do Hospital Universitário de Besançon; CG recebeu uma bolsa do francês “nationale Agence pour la recherche technologique”; JRP recebeu uma bolsa do Conselho Regional de Franche Comté; uma concessão do “ligue contre le cancer du Doubs” apoiaram este trabalho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Neuropilinas (PNR) são glicoproteínas quinase não-tirosina transmembranares inicialmente descritas no sistema nervoso. Neuropilin (NRP) família consiste de dois genes, neuropilina-1 (NRP1) e neuropilina-2 (NRP2). Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, NRP1 e NRP2 desempenhar um papel crítico na retração e orientação axônio por classe de ligação III Semaforinas [1]. Inicialmente caracteriza-se como receptores neuronais, PNR também foram encontrados para ser expresso em células endoteliais e, subsequentemente, foram mostradas para desempenhar um papel no desenvolvimento do sistema vascular [2].

PNR exibir uma cauda intracitoplasmática curto e que não faz contêm um domínio de cinase. As investigações iniciais de vias moleculares dependentes de NEUROPILINA sugeriu que Neuropilinas não pode transmitir directamente sinais intracelulares. Isto levou à proposta de que hetero-dimerização com outros receptores são necessários para mediar a sinalização neuropilina-jusante. Um destes complexos de co-receptor descritos até agora envolve o receptor do factor de crescimento endotelial vascular (VEGFR) [3], [4], [5]. Além da amplificação de sinalização VEGFR, PNR pode interagir com as plexinas para mediar a classe 3 semaforina transdução de sinal através de proteínas G ligadas-Ró, modulando a organização do citoesqueleto [6].

No entanto, uma sequência de amino-ácido altamente conservada promover PNR intracelular ligação ao domínio de PDZ-GAIP terminal C interagindo proteína-1 da cauda (GIPC-1), foi recentemente relatado que sugere a possibilidade de que o PNR pode regular funções biológicas alternativas [7].

as várias funções de PNR foram recentemente, com destaque para a identificação do papel NRP na oncogênese. Além da presença de PNR em vasos associados ao tumor, PNR foram expressas por uma ampla variedade de tumores, sugerindo um papel potencial desta glicoproteína na progressão do cancro. Na verdade, a expressão NRP2 foi encontrado em osteosarcoma [8], melanoma [9], cancros do pulmão [10], [11], tumores cerebrais [12], [13] cancros do cólon [14], cancros pancreáticos [15], [16 ], [17], os cancros da mama [18], leucemia mielóide [19], carcinoma adenóide cístico salivar [20], hemangioma infantil [21], as neoplasias de ovário [22] e cancros da bexiga [23]. No carcinoma do cólon, NRP2 promove diretamente a progressão do tumor de forma autónoma celular (veja o comentário de expressão NRP2 sobre as células cancerosas da Tabela S1). Sugeriu-se que as propriedades oncogénicas NRP2 contar com um aumento da fosforilação VEGFR1 e uma activação da sinalização VEGFR1 /via PI3K /Akt. [14] No entanto, as vias moleculares precisas e accionadas por NRP2 envolvidos na oncogénese permanecem em grande parte desconhecida.

epitelial-mesenquimal transição (EMT) é um dos principais mecanismos moleculares realizados durante oncogénese para promover a progressão do cancro. EMT caracteriza-se por uma repartição das junções celulares, a perda de características epiteliais e da polaridade celular, que contribuem para a progressão do carcinoma. Além do ganho de marcadores mesenquimais, EMT dota célula cancerosa para a migração, invasão e subsequente formação de metástases [24]. Despites vários estudos relativos ao papel de NRP2 na progressão do cancro, há evidência substancial estabelecido um envolvimento desta via molecular na EMT.

Aqui, utilizou-se linhas celulares de cancro do cólon transfectadas com NRP2 transgene ou siRNA para investigar o envolvimento NRP2 na EMT. Esses experimentos forneceram evidências de que NRP2 dota linhas celulares de cancro do cólon para a formação de colónias e de xenotransplante. Além disso, uma conversão da forma epitelial de tipo fibroblasto foi desencadeada pela expressão NRP2, bem como a aquisição de factores de transcrição específicos vimentina e EMT. Em seguida, foi examinada a influência de NRP2 em transformar β1 do factor de crescimento (TGF-p 1) de sinalização que se crê contribuir para o carcinoma de fase tardia através da indução de EMT. Nós mostramos que NRP2 promove uma constitutiva fosforilação Smad2 /3 em linhas celulares de cancro do cólon. Além disso, siRNA alvejando NRP2 específico ou tratamento com inibidores farmacológicos de TGFp-1 do receptor de tipo 1 (TGFβRI) impediu a fosforilação de Smad2 3 /e o EMT NRP2-mediada de células de cancro colorrectal. Colectivamente, estes resultados sugerem que NRP2 coopera com TGFβRI para promover EMT no carcinoma colorectal.

Materiais e Métodos

cultura celular

linhas de células humanas HT29, Colo320, SW620, MCF7 , Caki, A498, HEK293 foram adquiridos a partir da American Type Cultura celular Recolha e foram cultivadas em RPMI 1640 ou DMEM (Lonza, Paris, França) suplementado com 10% de calor endotoxina inactivado isento de soro fetal de vitelo (FCS), (Invitrogen, Cergy-Pontoise , França). Bes-PAC01, Bes-PAC03, Bes-PAC04 e Bes-PAC05 linhas celulares (pâncreas adeno-Carcinoma) foram originalmente isoladas a partir de fluidos de ascites derivados de quatro pacientes com adenocarcinomas pancreáticos, em nosso hospital universitário. linha de células R3III foi gentilmente cedido por Nathalie Labarriere, Inserm (Nantes, França). linhas de células Jijoye e Raji (linfoma de Burkitt humano) foram fornecidos por Diaclone (Besançon, França). As linhas celulares utilizadas neste estudo foram autenticado usando perfis de DNA (breve análise repetições em tandem), em linha com as recomendações do ATCC (ver Tabela 1). análise Curto repetição em tandem (STR) é um método de biologia molecular recomendado para identificação da linha de células. As linhas de células utilizadas neste estudo foram genotipados antes da congelação e de dois em dois meses. STR análise foi realizada com o Kit AmpFISTR Identifiler Amplificação por PCR (Applied Biosystems). foram analisados ​​loci específicos Altura incluindo repetições em cadeia no ADN a partir de linhas celulares de cancro. STR análise mede o número exacto de unidades de repetição para cada alelo (D7S820 8,20 significa que 8 e 20 repetições são identificados em cada alelo do locus D7S820 para a linha celular Jijoye). Se uma variante aparece que contém uma repetição parcial, que unidade de repetição parcial é designado por um decimal seguido pelo número de bases na repetição parcial.

plasmídeos pcDNA Expressão

A influência de NRP2 sobre a progressão de células de cancro de cólon foi avaliada por transferência de gene NRP2 na linha de células HT29. Geramos HT29

linhas celulares NRP2 utilizando dois plasmídeos de expressão que codificam hNRP2 (pcDNA3.1-NRP2, gentilmente cedidas por M. Klagsbrun) e pCMV6-XL5-NRP2 (adquirido a partir de Origene (Rockville, MD, EUA). As células de controlo HT29 foram gerados utilizando os vectores ou pcDNA3.1-pCMV6 XL5. 1,5 × 10

6 HT29 células foram semeadas em placas de 60 mm a

3 balão em 4 ml de meio e incubou-se durante 24 h. em seguida, as células foram transfectadas de forma estável com um ug de pcDNA3.1-NRP2 ou pCMV6-XL5-NRP2 vectores de expressão ou vectores de controlo utilizando o kit de Effectene (Qiagen, Courtaboeuf, França) de acordo com as instruções do fabricante. as células transfectadas com pcDNA3.1 vectores foram seleccionados com 0,8 mg /mL de geneticina (Invitrogen, Cergy-Pontoise, França), 48 h após a transfecção.

pequeno RNA de interferência

Usando a ferramenta de web design Ambion siRNA, identificamos uma sequência potencial alvo específico-NRP2. específica NRP2 siRNA (sentido 5′-AAA GGC TGG AAG TCA GCA CTA ATT T-3 ‘e anti-sentido 5′-AAA AAT TAG TGC TGA CTT CCA GCT T-3′) e corrida siRNA (sentido 5’-AAAGGAGGGGCATGCCACGTTGG- ) sequências 3 ‘e anti-sentido 5′-AAAACCAACGTGGCATGCCCCTC-3’ foram recozidos e clonados no local Bbsl da LTR 3 ‘do vector de pFIV-H1 /U6 de acordo com as instruções do fabricante (Sistema de Biosciences, mountain View, CA). As sequências foram confirmadas por análise BLAST NIH para não têm homologia substancial com as sequências de outros genes de vertebrados. produção sobrenadante Lentivirus e infecção subsequente de células foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante (Sistema de Biosciences, Mountain View, CA). Colo320 estavelmente transfectadas foram seleccionadas com 3 ug /mL de puromicina (Invitrogen, Cergy-Pontoise, França), 48 h após a transfecção.

A citometria de fluxo

Anti-NRP2, anti-NRP1, anti-pSMAD2 /3, anti-TGF-p1, anti-TGFβR1 eram de Santa Cruz Biotechnology-(Heidelberg, Alemanha). Anti-Smad2 /3 e anti-TGFRII, eram de sistema de RD (Lille, França). anticorpos secundários Alexafluor488-marcados foram adquiridos à Fluoprobes (Interchim, Montlucon, França). Dez mil células de cada amostra foram avaliados para a detecção de fluorescência utilizando BD FACSCanto citómetro. (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, França) para a coloração intracelular, as células foram fixadas durante 20 min a 4 ° C em paraformaldeído a 2%. A coloração foi realizada em seguida à temperatura ambiente durante 30 minutos num tampão contendo 0,4% de saponina e 5% de FCS. O tampão de lavagem continha 0,1% de saponina, 5% de FCS. Para análise de citometria de fluxo, foi calculada a intensidade da fluorescência relativa (RFI).

Ensaio de Proliferação Celular

proliferação celular in vitro foi analisada com o sal de tetrazólio 3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5 difeniltetrazólio (MTT). Resumidamente, 4000 células por poço foram semeadas em placas de 96 poços de micro-placas contendo 100 ul de meio por poço. Por análise, 10 ul de substrato de MTT (de uma solução mãe a 5 mg /ml em solução salina tamponada com fosfato) foi adicionado a cada poço, e as placas foram deixadas a condições de incubadora de tecidos normais por um período adicional de 2 horas. As células foram solubilizadas em 200 mL de sulfóxido de dimetilo, e as análises da cor foram realizadas (comprimento de onda, 570 nm). As placas foram ensaiadas a cada 24 horas durante os próximos 3 dias consecutivos.

ensaio ELISA

As células foram incubadas em meio RPMI ou DMEM-FCS a 1% durante 24 h. Em seguida, as células foram contadas e 10000 células por poço, foram semeadas em microplacas de 96 em 200 mL de DMEM-FCS a 0,1% durante 24 h. produção de VEGF foi avaliada em sobrenadantes utilizando kit de VEGF humano Elisa (Strathmann Biotec, Hamburgo, Alemanha).

Análise por Citometria de Fluxo de ADN conteúdo

As células foram recolhidas por tripsinização, lavadas com PBS arrefecido em gelo , fixados em 70% de etanol. Antes da análise do ADN, as células foram coradas com 50 ug /mL de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich, Lyon, França) e 2 ug /RNase ml de DNase-livre (Sigma-Aldrich, Lyon, França) durante 15 min a 37 ° C em o escuro. teor de ADN foi medido usando um citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, França) e analisados ​​com o programa CellQuest.

experiências Xenoenxerto

ratinhos nus foram obtidos a partir de Janvier (Le Genest St Isle, França), e mantida em nossa instalação de animais de acordo com as Diretrizes experimentais comitê de ética animal. 1 × 10

6 células HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

subcutaneamente si-RNA-NRP2 e Colo320

linhas celulares de siRNA-ctrl novamente suspensas em 100 ul de PBS foram inoculadas em ratinhos nus e o crescimento tumoral foi monitorizado a cada duas semanas em cada grupo. O volume do tumor foi calculado pela fórmula

V

= 1/2

a

×

b

2, onde

a

é o tumor mais longo eixo, e

b

é o eixo tumor mais curto. Quando os tumores atingiram um diâmetro de 1 cm, os murganhos foram sacrificados e os tumores foram fixados em formol para análise imuno-histoquímica subsequente.

Colónia ensaio de formação de

Efeito de expressão NRP2 na formação de colónias in vitro foi avaliada por suave ensaio de colónias de formação de agar. 5000 células por poço foram semeadas em 500 ul de meio de agarose a 2% em uma placa de 24 poços. As células foram incubadas a 37 ° C, 5% de CO2 e fotos foram tiradas após 10 dias de cultura.

ensaio de invasão

invasão foi avaliada usando 96W QCM Invasão Ensaio (Millipore, EUA). Resumidamente, igual número (100,000) de células de controlo (HT29

ctrl) ou células que expressam NRP2 (HT29

NRP2) ressuspensas em meio isento de soro, foram colocadas no topo do compartimento de um padrão 8 de poro de câmara de Boyden. poços bandeja de alimentação continha meio sem soro ou meio FCS 10%. Após 16 horas invasão (37 ° C, 5% de CO2), as células invasivas foram incubadas com tampão de separação celular, lisadas e marcadas com corante de CyQUANT GR. (QCM 96W Ensaio, Millipore, Internacional). A fluorescência foi então avaliada com um leitor de placas de fluorescência (Cell Lab Quanta, Beckman-Coulter), utilizando um conjunto de filtros 480-520 nm.

Os tratamentos com células

sinalização TGF-β1 foi inibida usando DP- 208 ou SB-431542 (inibidor de cinase TGFRI) diluído em DMSO (Sigma-Aldrich, Lyon, França). DMSO serviu como meio de controlo em todas as experiências. Em algumas experiências Avastin (Farmácia de Chu Jean Minjoz, Besanç, França) foi utilizada para inibir o VEGF-A. TGF-β1 foi adquirido a partir de RD do sistema (Lille, França).

análise de Western Blot

Resumidamente, após dois passos de lavagem, as células foram recolhidas e solubilizadas em tampão de lise containing1 EDTA mM, 1 mM NaF, Vanadate 1 mM e uma completa Cocktail Tablet Mini Inibidor de protease (completo Mini EDTA gratuito, por 10 ml de tampão de lise, Roche, França). 30? G de lisados ​​de células inteiras foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato de sódio duodecyl e transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno por electrotransferência. As membranas foram em seguida bloqueadas durante 1 h em 5% de leite antes da incubação com os anticorpos específicos como se segue: anti-NRP2 e anti-TWIST1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha), anti-Smad2 /3 (R amp; D System, Lille, França), anti-vimentina, anti-Ecadherin, anti-TGF-p1, anti-Smad2 /3, anti-pSMAD2, anti-caracol (todos da Cell Signaling Technology, Danvers, EUA). Todos os anticorpos foram diluídos em solução salina Trisbuffered e 0,1% (v /v) de Tween-20, que contêm leite seco. proteínas apagados foram detectados e quantificados em um imager bioluminescência e software avançado BIO-1D (Wilber-Lourmat, Marne-la-Vallée, França), após incubação de borrões com um rábano peroxidaseconjugated anticorpo secundário apropriado (Beckman Coulter, Paris). Para algumas experiências, citoplasmáticas e nucleares fracções subcelulares foram recolhidas após centrifugação diferencial em tampões adaptados; a presença ou ausência de proteínas específicas (subcelulares tais como β-actina ou histona H1) atestada separação subcelular.

Co-imunoprecipitação análise

As células foram lisadas em PBS contendo 200 mM de tris- HCl pH 7,4, 100 mM de NaCl, 1% v /v tritonX100, DTT 1 mM, EGTA 15 mM, NaF 1 mM, 1 mM de vanadato e uma completa cocktail Tablet Mini inibidor de protease (completo Mini EDTA livre, por 10 ml de tampão de lise , Roche, França). Os anticorpos de coelho anti-TGFRI policlonais (Santa Cruz Biotechnology), e anticorpos de coelho policlonais IgG foram adicionados aos lisados ​​a uma diluição final de 1/100 e incubadas durante a noite a 4 ° C. Proteína-G esferas magnéticas (Invitrogen, Cergy-Pontoise, França) foram adicionados à mistura e incubou-se durante duas horas adicionais a 4 ° C. As proteínas foram então eluídas por separação magnética e desnaturado. Ocidental-Blot foi então realizada utilizando anticorpo-NRP2 anti (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha).

A análise histopatológica e imuno-histoquímico de coloração de tecidos

As amostras de tecido, obtido a partir de xenoenxertos foram fixados em 4 % de formalina e embebido em parafina. Em seguida, os blocos foram cortados em série com uma espessura de 4 ^ m. HES (hematoxilina Eosina Safran) coloração foi utilizado para avaliar a morfologia. Uma técnica de imuno-histoquímica padrão foi realizada utilizando um Ventana BenchMark XT (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona) imunohistoquímica com os seguintes anticorpos primários: anti E-caderina (Zymed, San Francisco-, EUA), anti-citoqueratina-20 ( Zymed, San-Francisco, EUA).

Superfície Plasmon Resonance análise

projeto e fabricação de chips compatíveis com SPR (Surface Plasmon Resonance) foram realizadas como publicado anteriormente com a ajuda do MIMENTO plataforma tecnológica, Besançon, França [25]. Os chips NRP2 fabricadas neste estudo consistem no enxerto covalente de entidades Fc-NRP2 em monocamada auto-montada quimicamente activado, seguindo o procedimento de construção de chips de proteína recentemente publicada [26]. Fc-NRP2 eram de Sistema RD (Lille, França). Este procedimento leva a uma cobertura de 7,4 +/- 0,1 femtomole /mm

2 de NRP2. As injecções de BSA (controlo -), VEGF (controlo +) e TGF-p1 são realizados a 250 nM em PBS-Tween a 0,05%, pH 7,4. experiências de Biacore foram efectuadas com o aparelho Biacore 2000 a 25 ° C com uma taxa de fluxo compreender entre 2 e 30? l /min.

Tempo real-quantitativa por PCR (RT-qPCR)

O ARN total foram extraídos utilizando o estojo RNeasy Mini (Qiagen, Courtaboeuf, França) e reversamente transcrito utilizando hexâmeros aleatórios e Moloney vírus da leucemia murina de transcriptase reversa (Life Technologies, Rockville, MD, EUA). Amostras em duplicado foram sujeitos a RT-qPCR. ARNm foram quantificados utilizando os iniciadores listados abaixo:. NRP2 (Hs00187290_m1), Snail1 (Hs001955991_m1), TGF-β1 (Hs00171257_m1), Gli1 (Hs00171790_m1), TWIST1 (Hs00361186_m1) (Applied Biosystems)

ARNm de cada amostra ABL foi quantificada como um controlo de RNA endógeno interna. expressão de mRNA relativo foi calculado usando o método Delta-Delta-Ct e células não tratadas foram utilizados como calibrador.

preparação da lâmina e microscopia confocal

As células foram espalhadas em lâminas de câmara Labteck (Sigma-Aldrich, Lyon, França) e subsequentemente tratados com os reagentes apropriados. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% e permeabilizadas com 0,1% de Triton X100. Após 20 minutos de bloqueio em soro bovino fetal a 20% e lavagem, as células foram coradas com anticorpos apropriados Pilhas de imagens confocais foram recolhidos com um Olympus FV1000 de varrimento laser microscópio confocal. os núcleos das células foram contrastadas com DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole). Para a quantificação de fluorescência, a relação da intensidade de fluorescência foi calculada para cada condição. Proporção de intensidade de fluorescência foi calculada dividindo a fluorescência em nuclear pela fluorescência citoplasma à membrana. A intensidade da fluorescência de 50 células foi analisado em cada condição.

Smad ensaio de repórter

Temos utilizado o ensaio de repórter de TGF-β de SABiosciences (Qiagen, Courtaboeuf, França) para a quantificação de TGF -β induzida por sinalização Smad2 /3. Quantificação da luciferase do pirilampo foi realizado utilizando um sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla (Promega Co., Madison, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Todas as transfecções foram realizadas em triplicado utilizando o kit de Lipofectamina. (Invitrogen, Cergy-Pontoise, França). Após 24 h de transfeco, o meio foi mudado e as células foram tratadas com 50 ng /mL de TGF-β1 durante mais 24 horas. Os resultados são apresentados como a razão entre o

atividade

firefly luciferase e

Renilla luciferase

atividade (Ren /Luc) para cada condições. Em seguida, os valores foram relatados para os valores do controlo negativo.

A análise estatística

Os resultados são expressos como a média mais ou menos o erro padrão da média (SEM). comparações entre os grupos foram realizadas usando Student

t

teste. As diferenças foram consideradas significativas para

p

. 0,05

Resultados

expressão NRP2 em linhas celulares de cancro humano

Em primeiro lugar, procurou examinar a expressão de NRP2 glicoproteína em várias linhas celulares de cancro. Análise por imunofluorescência confirmou que NRP2 é expresso na membrana das várias linhas de células de cancro humano (Figura 1A). As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), isoladas a partir da veia umbilical humana normal, foram usadas como controlo positivo para a expressão NRP2. Observou-se expressão NRP2 na membrana de 2 de 3 linhas de células de cancro do cólon (SW620, Colo320, mas não HT29). NRP2 também foi expressa em todas as linhas celulares de cancro renal testados (HEK 293, Caki, R3III e A498), em duas das quatro linhas celulares de cancro do pâncreas (Bes-PAC03 e Bes-PAC04, derivado do líquido ascítico do paciente no nosso instituto), em NCIH441 pulmão linha de células de cancro e em 5637 linha de células de cancro da bexiga (Figura 1A). linha de células de câncer MDAMB231 materno NRP2 enquanto que nenhuma coloração NRP2 foi encontrado em células de linfoma de Burkitt linhas (Raji, Jijoye) (Figura 1A).

A,

citometria de fluxo análise da expressão NRP2 em linhas celulares de cancro humano.

B, coloração imuno-histoquímica

de NRP2 nos tecidos do cólon humano e tecidos mamários (marrom). tecidos embebidos em parafina e fixados em formalina foram incubadas durante a noite à temperatura ambiente com anticorpo anti-humano NRP2. micrografias representativas foram tomadas em um x1000 ampliação original; NRP2 é expressa na membrana de cólon e da mama carcinomas humanos, enquanto que não é expresso em tecidos saudáveis.

Estudos Imuno-histoquímica foram então realizados para determinar se NRP2 é expressa na membrana de diferentes embebido em parafina-humano amostra de cancro. NRP2 foi expressa em 3º de 10 carcinoma do cólon, em 5 de carcinoma de mama e 15 com 4 de 12 carcinoma pancreático. e linfoma de células B de nota, NRP2 não foi detectada em cancros da próstata (n = 10) (N = 10) (dados não mostrados). Além disso, a coloração imuno-histoquímica mostrou que NRP2 é expressa na membrana de carcinoma do cólon humano e carcinoma da mama ao mesmo tempo que não é expresso em tecidos malignos não (Figura 1B). Nossos resultados estão de acordo com relatórios publicados anteriores. De facto, num estudo recente, Gray et ai observaram que NRP2 não era detectável em mucosa colónica não maligna, mas foi evidente em 10 (83%) de 12 de adenocarcinoma do cólon adjacente e em cinco (71%) dos sete metástases do fígado por coloração IHC. Além disso, em outro estudo, a expressão NRP2 foi encontrado em 5 de 6 (83%) linhas de células pancreáticas comumente utilizados [15] e em 7 dos 11 (64%) espécimes cirúrgicos de adenocarcinoma do pâncreas por coloração IHC [14]. Finalmente, no cancro da mama, Yasuoka et al relataram expressão NRP2 em 60 de 113 carcinoma invasivo de mama (53,1%) [18]. A partir destes vários estudos, parece que NRP2 parece ser específica de vários tecidos de tumor, enquanto que nenhuma expressão desta glicoproteína é vulgarmente observado em tecidos saudáveis, confirmando que NRP2 é um alvo atractivo para terapêuticas inovadoras anti-tumorais (ver Tabela S1 para avaliação de expressão NRP2 em cancros).

para estudar o papel preciso de NRP2 na progressão do cancro, decidimos para gerar linhas celulares de cancro do cólon expressando ou não NRP2, utilizando a transferência de gene NRP2 ou NRP2 siRNA específico. Assim, NRP2 foi transfectado em HT29 e um siRNA específica foi usada para knockdown expressão NRP2 em Colo320. A citometria de fluxo experiências foram realizadas para confirmar a modulação da expressão NRP2 em HT29 e Colo320 (Figura 2A). Nenhuma modulação da expressão NRP1 foi observada em células HT29 ou Colo320 transfectadas. células de câncer renal Caki-1 foram usados ​​como controle positivo para a coloração NRP1. presença NRP2 em HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

siRNA-ctrl, Colo320

siRNA-NRP2 foi controlado por western blot (Figura 2B).

As células transfectadas foram analisados para a expressão NRP1 e NRP2 por citometria de fluxo de análise (

a

) ou por western blot (

B

). Para análise de citometria de fluxo, foi calculada a intensidade da fluorescência relativa (RFI). células Caki1 e HUVEC foram utilizados como controle positivo para NRP1 e coloração NRP2 respectivamente.

C,

proliferação de células HT29 e Colo320, segundo a expressão NRP2 foi avaliada utilizando ensaios MTT. 4000 células foram deixados em cultura durante 24, 48 ou 72 horas antes da análise. NRP2 expressão está associada a uma proliferação aumentada das células de cancro do cólon. Os dados representam as médias de triplicados mais ou menos o erro padrão (SE) de uma experiência representativa de entre três realizadas. (

**, P 0,01). D,

experiências similares MTT foram reproduzidas na presença de bevacizumab (0,25 e 1 mg /mL, 72 h). HMEC-1 de células endoteliais microvasculares foram usadas como controlo positivo para a bioactividade de bevacizumab. Na verdade, bevacizumab diminui significativamente HMEC-1 proliferação enquanto que nenhuma diminuição da proliferação celular é observado com

NRP2 e Colo320 células cancerígenas HT29. A experiência foi feita 3 vezes, e para cada vez em triplicado.

E,

citometria de fluxo e conteúdo de DNA de células de cancro do cólon transfectadas. expressão NRP2 está associado com um número aumentada de células em fase S. Os dados representam os resultados de uma experiência representativa de entre três expressos como a média de ensaios duplicados (*,

P 0,05; **, P 0,01, ** * P . 0.001)

NRP2 promove a proliferação do tumor

Nós levou vantagem de as linhas de células anteriores para estudar o papel da NRP2 na proliferação do câncer crescimento in vitro e tumor na Vivo. A proliferação foi monitorizada utilizando ensaios MTT. HT29

células NRP2 mostrou uma taxa de proliferação superior a 24, 48 e 72 h comparado com HT29

ctrl (Figura 2C). Por outro lado, NRP2 knockdown utilizando siRNA específica, modulada de forma negativa a proliferação da linha celular tumoral Colo320 (Figura 2C). Estas experiências mostraram que a expressão NRP2 aumenta a proliferação de linha celular de cancro do cólon in vitro (a significativity em cada ponto de tempo destes ensaios MTT é indicada na Tabela S2). Para confirmar a influência de NRP2 sobre a proliferação celular, temos avaliada em dois experimentos adicionais a duplicação dos tempos de HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

siRNA-ctrl e Colo320

siRNA-NRP2 câncer células. NRP2 células que expressam HT29

NRP2 e Colo320

siRNA-ctrl teve um tempo de duplicação de 8 e 11 horas, respectivamente, enquanto que tempos de duplicação de NRP2 células sem HT29

ctrl e Colo320

siRNA-NRP2 foram 13 e 14 horas. Desde PNR são co-receptores VEGF, acompanhámos VEGF-A produção na HT29 e culturas Colo320 pelo teste Elisa. Estas células produziram níveis baixos de VEGF-A. expressão NRP2 não influenciou a produção de VEGF (Figura S1). Além disso, o bevacizumab mAb neutralizante, conhecido para inibir a proliferação de células endoteliais microvasculares linha HMEC-1 [27], foi usada para tratar o papel potencial de VEGFA no crescimento de células de tumor NRP2-mediada. Estas experiências mostraram que VEGFA neutralização não influenciou HT29 NRP2 mediada ou proliferação Colo320. (Figura 2D)

Além disso, NRP2 é um receptor funcional para 3F semaforina, que foi descrito como um inibidor de angiogénese, progressão de tumores e metástase [28]. experiências de transferência de Western mostrou que HT29

Ctrl e HT29

NRP2 expressar o mesmo nível de 3F semaforina, ao passo que nenhum semaforina 3F foi encontrado em células Colo320, sugerindo que a proliferação do tumor NRP2 mediada não envolve semaforina 3F (Figura S2) . Em seguida, a distribuição do conteúdo de DNA nuclear foi estudada por citometria de fluxo em HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

Colo320

células cancerosas siRNA-NRP2 siRNA-ctrl e. NRP2 expressão foi associada com um número aumentada de células em fase S (Figura 2E). privação de soro no meio de cultura induziram um aumento na fracção subG1 apenas em condições NRP2 negativas (dados não apresentados). Colectivamente, estes resultados mostraram que a expressão NRP2 no carcinoma colorectal promove a proliferação de células de câncer e sobrevivência.

NRP2 ablação usando siRNA inibe a formação de xenotransplante

O papel preciso de NRP2 na progressão do câncer foi caracterizado primeira

in vivo

. Para examinar o efeito de expressão NRP2 em

in vivo

o crescimento do tumor, nós inoculados números iguais (1,10

6 células por rato) de HT29

NRP2 ou HT29

ctrl subcutaneamente em ratinhos nus. incidência de tumores e de volume foram avaliados quinzenalmente. Tumores apareceu em todos os camundongos inoculados com HT29

ctrl e HT29

NRP2. NRP2 aumentou significativamente o crescimento do tumor in vivo (Figura 3A). Para confirmar estes resultados, decidimos investigar se NRP2 segmentação usando siRNA específico poderia inibir a formação de tumores. Enquanto 1.10

6 Colo320

células de siRNA-ctrl injectadas subcutaneamente em ratinhos induzida por enxerto de tumor nu em todos os ratinhos, a inibição NRP2 utilizando siRNA específico impedido Colo320 enxerto em todos os animais, sugerindo um papel crítico de NRP2 nos primeiros eventos contribuindo para tumoral formação (Figura 3B) .A influência da inibição NRP2 usando siRNA específico sobre Colo320 tumorigenicidade foi confirmado

in vitro

. Para este fim, as células foram tratadas com Colo320 NRP2 siRNA ou Ctrl siRNA e cultivadas num ensaio em agar mole. NRP2 knockdown no Colo320 diminuiu o número de colónias observadas em experiências de agar mole (Figura 3C). Desde HT29 não formam colônias em culturas de agar mole, decidimos investigar a influência da NRP2 na invasão HT29 e migração.