Abstract

resistência à cisplatina é um dos principais motivos que levam à alta taxa de mortalidade de câncer de ovário. sequenciamento metil-Capture (MethylCap-seq), que combina precipitação de DNA metilado pelo domínio de ligação a metil-CpG recombinante de proteína MBD2 com NGS, a análise global e imparcial dos padrões globais de metilação do DNA. Nós aplicamos MethylCap-seq para analisar o perfil de metilação do DNA do genoma da cisplatina sensível A2780 linha de células de cancro do ovário e seu derivado isogênico linha resistente A2780CP. Obtivemos 21.763.035 cru lê para o resistente A2780CP linha de células de drogas e 18,821,061reads para a linha celular A2780 sensível. Foram identificados 1.224 hiper-metilado e 1216 DMRs hypomethylated (diferencialmente região metilado) em A2780CP comparação com A2780. Nossos dados MethylCap-seq sobre este modelo resistente à cisplatina cancro do ovário fornecido um bom recurso para a comunidade de pesquisa. Nós também descobrimos que A2780CP, em comparação com A2780, observou inferior para rácios de CpG metilados esperados, sugerindo uma menor metilação global de CpG em células A2780CP. PCR específica para a metilação e a sequenciação confirmaram a hipermetilação bissulfito de PTK6, PRKCE e BCL2L1 A2780 em comparação com A2780CP. Além disso, o tratamento com o reagente de desmetilação 5-aza-dC em células A2780 desmetilado os promotores e restaurou a expressão de PTK6, PRKCE e BCL2L1

citação:. Yu W, Jin C, Lou X, Han X, Li L, Ele Y, et al. (2011) Análise global de metilação de DNA por Metil-Capture Sequencing revela Controle epigenética da Resistência cisplatina em células do cancro do ovário. PLoS ONE 6 (12): e29450. doi: 10.1371 /journal.pone.0029450

editor: Matteo Pellegrini, Instituto UCLA-DOE para genômica e proteômica, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de outubro de 2011; Aceito: 29 de novembro de 2011; Publicação: 22 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelos fundos para BL pelo Ministério da Ciência e Tecnologia da China [2006AA02A303, 2006AA02Z4A2, 2006DFA32950, ​​2007DFC30360]. Este trabalho é apoiado pelos fundos para JZ da National Science Foundation (30921140312), Programa Nacional de Pesquisa para Pesquisa Básica (2009CB825606, 2009CB825607 e 2010CB912802) e Grant Colaboração Internacional (2009DFA31010) para XD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a resistência às drogas é a principal razão que leva à alta taxa de mortalidade de câncer de ovário. O agente quimioterapêutico cisplatina (cis-diamminedi-chloroplatinum (II)) é particularmente eficaz contra o carcinoma do ovário com uma taxa de resposta inicial de cerca de 70% [1]. No entanto, o câncer de ovário, eventualmente, desenvolve resistentes à cisplatina, ea taxa de sobrevivência de 5 anos para os pacientes é apenas 15-20% [2]. A cisplatina medeia as suas acções através da formação de aductos de ADN em primeiro lugar-aductos de reticulação intra-cadeia [3] e activa várias vias de transdução de sinal incluem os ATR, p53, p73, e MAPK, resultando em apoptose [3], [4].

metilação de ADN é muitas vezes associada com a repressão transcricional da expressão do gene [5] e com respostas a quimioterapia [6], [7]. Um exemplo clássico é que a metilação do MGMT (metiltransferase O6-metilguanina-ADN) promotor em gliomas é um bom preditor da capacidade de resposta dos tumores para agente de alquilação carmustina [1,3-bis (2-cloroetil) -1-nitrosoureia] , bem como de sobrevivência global e livre de doença em gliomas [6]. Em cancros do ovário, Taniguchi et al. propor um modelo para a progressão do tumor do ovário em que a metilação inicial de FANCF é seguido por desmetilação FANCF e, finalmente, resulta em resistência a cisplatina [7]. A metilação do DNA de vários genes em cancros do ovário, incluindo HSulf-1 [8], ABCG2 [9], EZH2 [10], foram encontrados para ser associada com resistência à droga. Boettcher et ai. analisados ​​de alta definição de perfis de metilação do DNA de 800 ilhas CpG (CGI) de genes selecionados e identificou que a hiper-metilação no CGIs de BRCA1, CDH1, DNAJC15 e SULF2, bem como hipo-metilação de CGIs para ABCB1, genes APC e HIC1 mostraram aumento tolerância doxorrubicina [11]. Chang et ai. expressão gênica global usada profiling para analisar as células cancerosas antes e depois do tratamento de DNA metiltransferase inhibitor5-aza-2′-desoxicitidina, que re-activa metilação gene silenciado [12]. Eles identificaram várias centenas de genes que foram regulados negativamente em células de cancro resistente a cisplatina e reactivadas por o inibidor da metiltransferase de ADN 5-aza-2′-desoxicitidina [12]. Li et al. compararam o padrão de metilação de A2780 e sua linha de células resistentes à deriva depois de vários ciclos de seleções de drogas usando matrizes CGI metilação global e microarrays de expressão de mRNA [13].

Aproveitando o sequenciamento da próxima geração de tecnologias

(NGS) , a fração metilado do genoma capturado por MEDIP-seq [14], methylCap-seq [15] e methylcap-seq [16] foram perfilado em uma profundidade maior do que a plataforma baseada em array, revelando muitas novas regiões que são diferencialmente metilado com o conteúdo biológicos. Aqui relatamos a comparação dos padrões de metilação do DNA globais de ciplatin sensível (A2780) e (A2780CP) linhas celulares resistentes do ovário para os controlos epigenética principais responsáveis ​​pela resistência à cisplatina. Foram identificados 1.224 hiper-metilado e 1216 DMRs hypomethylated (diferencialmente região metilado) em A2780CP comparação com A2780. Nós também descobrimos que A2780CP, em comparação com A2780, tem uma metilação CpG globais mais baixos. Vários genes foram confirmados para ter tanto metilação do promotor e de expressão correspondente muda incluindo PTK6, PRKCE e BCL2L1, e o tratamento com o reagente de desmetilação 5-aza-dC em células A2780 desmetilado os promotores e restaurado a sua expressão.

Resultados

análise Methylomic do A2780CP resistentes a cisplatina e sua linha sensível de células A2780 cisplatina isogênico

linha de células de carcinoma de ovário A2780CP Humano (cisplatina-resistente) foi obtido a partir A2780 linha de células (sensível à cisplatina), mas mostram aumento da resistência à cisplatina [17]. A2780CP e A2780 são (mesmo DNA genómico) isogénica. Para confirmar que o A2780CP linha de células que ainda mantinha a resistência a cisplatina, foi realizado ensaio de MTT para avaliar as respostas da droga cisplatina de células A2780CP e A2780. Verificou-se que o IC50 de A2780CP (5,0 ug /ml) é cerca de três vezes mais elevada do que a de A2780 (1.8 ug /ml) (Fig. 1). Nossos dados são consistentes com o anterior reportado perfis de resposta cisplatina A2780CP de [17], indicando que as linhas de células que tinham no laboratório mantém a diferença de resistência à cisplatina.

Ambos A2780 e A2780CP foram tratados com cisplatina em diferentes doses de 0 ug /ml a 16 ng /ml durante 72 horas.

Temos, portanto, aplicado MethylCap-seq para analisar os perfis methylomic de ambas as células A2780 e A2780CP. Obtivemos 21.763.035 cru lê para o resistente A2780CP linha de células de drogas e 18,821,061reads para a linha celular A2780 sensível. 13.950.202 (64,1%) e 13.671.899 (72,6%) Lê foram mapeados de forma única para genoma humano para A2780CP e A2780 respectivamente

Nós anotou o lê em relação às ilhas CpG no genoma humano (http: //. Genoma .ucsc.edu /) e descobriu que cerca de 1,4% e 2,5% das leituras localizar dentro de ilhas CpG, respectivamente, para A2780CP e A2780.The profundidade sequência média para as ilhas CpG cobertas é de cerca de 16 e 24,5 vezes. Cerca de 68% e 66% das ilhas CpG humanos estavam cobertos de nossa análise para A2780CP e A2780 respectivamente (Tabela 1). A cobertura CpG e profundidade obtivemos em nosso MethylCap-seq é semelhante ao que publicado anteriormente [18].

Para detectar regiões de metilação diferenciais (DMRS) no genoma humano entre as células sensíveis e resistentes, usamos MEDIPS, uma ferramenta de software recentemente desenvolvido especializada para analisar análise de metilação imunoprecipitação base (por exemplo MEDIP-seq e MethylCap-seq) [19]. Nós definir os critérios para DMRs significativas: o comprimento de picos foi definido para 500 pares de bases e picos com 20 rpm (lê por milhão), valor-p inferior a 0,001 e proporção de rpm entre duas linhas de células 20. Obtivemos 1224 DMRs que é hiper-metilado em A2780CP comparado ao A2780 (Tabela S1) e 1216 DMRs que é hiper-metilados em A2780 comparação com A2780CP (Tabela S2). Estes DMRs foram anotados com suas localizações genômicas e genes associados dentro de -5 a +5 K bp bp K para os locais de início da transcrição (Tabela S3 e 4).

Quase metade dos DMRs foram localizados dentro de bp 5 k de transcrição locais de início (SST) de genes. 190 e 270 DMRs foram localizados a montante da TSS, respectivamente, em A2780 e A2780CP (Tabela 1). O resto mapeado para outras regiões do genoma humano, incluindo intrões, exões, regiões intergénicas e repete (ENSEMBL anotações genoma humano) (Fig. 2A). hipermetilado em regiões promotoras de genes são conhecidos por diminuir a expressão do gene [17], mas o efeito de regiões hipermetilação noutro local dentro da região do gene permanece inconclusivo. A hipermetilação das sequências genómicas repetitivas pode evitar a instabilidade cromossômica, translocações e ruptura do gene causado por reativação de sequências de ADN de transposição [17], [20].

A. Percentagem de picos hypermethylated com base em suas características genômicas localizadas. B. Distribuição de CpG

o /e para picos hypermethylated com base em suas características genômicas localizadas.

Li et al. em comparação A2780 isogénico e a sua linha de células resistentes seleccionadas utilizando o microarray de oligo 60-mero contendo 40.000 fragmentos ricos em CpG de 12.000 promotores conhecidos dos genes (Agilent, Santa Clara, CA) [13]. Usando um valor de corte de 1,5 vezes, eles identificaram 595, 870 e 1.176 genes hypermethylated para as sublinhas resistentes Round1, Round3 e round5 comparando com os pais ( “Round0”), as células A2780 [13]. A tecnologia que é utilizada a hibridação diferencial de metilação (DMH) [21], em que o ADN metilado foi separado do não metilado por metilação diagestion enzima sensível para sondar a matriz das regiões de oligonucleótido CpG island humanos. DMH é diferente do MDB-SEQ, em que metilado ADN foi precipitado por domínio de ligação recombinante metil-CpG de proteína MBD2, e, em seguida, sequenciada. Em DMH, o DNA isolado foi digerido com a enzima de restrição metilação-insensível BfaI (C∧TAG), ligado a ligantes, e digerido novamente com as enzimas sensível à metilação HinP1I (G∧CGC) e Hpall (C∧CGG). Os produtos da digestão foram então amplificados utilizando ligantes e marcadas com corantes Cy3 ou Cy5 para hibridações comparativos [21]. Apesar das diferentes tecnologias utilizadas, comparamos os nossos dados MDB-seq com Li et al. Dados DMH. Descobrimos que 221 (de 1224, 18,1%) e 142 (de 1216, 11,68%) dos genes e hipermetilado em hypomethylated A2780CP em comparação com A2780 foram também na matriz que Li et al. utilizado (Tabela S3, S4). Descobrimos que as regiões 15 (correspondendo a 13 genes) e 23 regiões (21 genes) que são comuns entre os dois conjuntos de dados (Tabela 2), que são sobreposições altamente significativas com probabilidades de hipergeométricas 1.11E-5 4.22E-20 e, respectivamente, . Os genes comumente hypermethylated nas células resistentes incluem ligação retinoblastoma proteína 8 (RBBP8), SRY-box 1 (SOX1), do tipo sem asas MMTV local de integração familiar (WNT9A), transcrição geral fator IIIA (GTF3), e os genes comumente hypomethylated em as células resistentes incluem soluto família transportador 22 (monoamina transportador extraneuronal) (SLC22A3), aldeído desidrogenase 1 família (ALDH1A3), ácido hialurônico sintase 3 (HAS3) e do domínio CUB contendo proteína 1 (CDCP1) (Tabela 2).

Há 410 DMRs hypermethylated (Tabela S3) e 316 hypomethylated (Tabela S4) em A2780CP em comparação com A2780, que não estavam na matriz que Li et al. utilizada, e não foram identificados pela abordagem DMH. Estes novos DMRs revelou o poder de MDB-SEQ em identificar novos DMRs sem conhecimento prévio de promotores candidatos para ser colocado em matrizes para ser usado em DMH. Além disso, estas novas DMRs pode ser devido a diferenças nas linhas celulares resistentes a derivados que foram utilizados por Li et al. e nós.

A metilação CpG globais mais baixos nas células A2780CP resistentes cisplatina em comparação com as células A2780 sensíveis cisplatina

Para entender o padrão global de CpG metilação em ambas as linhas celulares, foram analisadas as características de CpGs hipermetilado ao longo de todo o genoma através da contagem do número de CpGs vizinhas dentro das regiões de 500 pb na proximidade dos sítios hipermetilado e calculou-se a observada proporção de CpG /esperada (CPG

o /e) para cada um de CpG utilizando o método descrito por Ruike et ai . [22]. Descobrimos que, em geral, tem A2780CP inferior CpG

O /E do que a de A2780, sugerindo uma menor metilação CpG global em comparação com A2780CP A2780 (Fig. 2B, painel superior esquerdo). As diferenças foram manifesta principalmente na maior CpG

O /E no intrão e sequências de repetição A2780 comparada com a de A2780CP. Comparando CpG

O /E em diferentes categorias região genómica (Fig. 2B), o CpG

O /E superior a 0,6 nos exões e promotores para ambas as linhas de células resistentes e sensíveis, mas menos do que 0,6 na outra genómico Regiões (repetições, íntrons e regiões intergênicas) (Fig. 2B).

anotações funcionais e análise de enriquecimento caminho para os genes DMR

Foram realizadas análises GO para genes hypermethylated em ambos os resistentes (Tabela S5) e a linha celular sensível (Tabela S6). Descobrimos que genes hypermethylated na linha de células sensíveis foram enriquecidos por termos GO: anti-apoptose (GO: 0.006.916), a regulação negativa da morte celular (GO: 0.060.548), e regulação do intracelular cascata proteína quinase (GO: 0.010.627). Os genes hypermethylated na linha de células resistentes tem vários termos enriquecidos relacionados à regulação do fator de transcrição, como GO: atividade e regulador 0030528 transcrição GO: vinculativo 0003677 DNA

Nós também realizadas análises via de KEGG para os genes de DRM e encontrou. que os genes com promotores hypermethylated foram enriquecidos nas seguintes vias KEGG incluindo 11 genes em hsa04010 (MAPK via de sinalização), 18 genes em hsa05200 (Pathways no cancro), 5 genes em hsa04310 (via de sinalização Wnt), 5 genes em hsa00982 (metabolismo da droga ) e 5 genes em hsa04115 (via de sinalização p53) (Tabela 3).

Curiosamente, muitas proteínas relacionadas ECM-e canal de membrana foram hipermetilado. Por exemplo, KCNS1 e KCNA1, proteína de canal voltagem-dois potássio e SLC15A4 (soluto transportadora família 15, membro 4) são hipermetilado em células A2780CP enquanto SLC4A11 (soluto transportadora família 4, transportador de borato de sódio, membro 11) é hipermetilado em A2780 células. COL18A1 (colágeno, tipo XVIII, alpha 1) é hipermetilado em células A2780, enquanto KRTAP10-6 (queratina proteína associada 10-6) e LRFN5 (rich repeat leucina e de fibronectina de tipo III de domínio contendo 5) são hipermetilado em células A2780CP. Também identificamos hipermetilação em vários loci microRNA incluindo hipermetilação do MI6A2, MIR129-2, MIR124-1, MIR124-3 e MIR10A em A2780CP e hipermetilação de MIR185, MIR548Q, MIR642A e MIR661 em A2780 (Tabela 4).

Validação de genes com DMRs por MS-PCR e bissulfito sequenciamento

a expressão de genes com o promotor hypermethylated foi verificada por RT-qPCR, se a expressão foi alterada significativa, em seguida, a metilação específicas de PCR (MS- PCR) foi usada para validar o estado de metilação de regiões DMR entre duas linhas de células. Foram identificados os seguintes genes BCL2L1 (BCL2-like 1), PPKCE (proteína quinase C, epsilon), PTK6 (PTK6 proteína tirosina quinase 6), Rac2 (C3 toxina botulínica substrato ras relacionados 2), SECTM1 (secretadas e transmembranares 1) e DDIT3 (ADN-danos transcrição indutível 3) que alterada em ambos os metilação do promotor e de expressão. Figura 3A mostrou as alterações de expressão destes genes, e a Figura 3B mostram os padrões de metilação do promotor destes genes. DDIT3 foi hypomethylated em células A2780 em comparação com A2780CP, enquanto o resto apresentou a frente (Fig. 3B). Para confirmar ainda mais DMRs entre A2780 e A2780CP, usamos seqüenciamento bissulfito para sequenciar as regiões promotoras de três gene escolhido aleatoriamente a partir dos 6 genes. Figura 3C mostrou que todas as regiões promotoras do PTK6 gene escolhido, PRKCE e BCL2L1 foram hypomethylated em A2780CP comparação com A2780.

A. PCR em tempo real mostra a expressão diferencial de genes seleccionados entre o A2780 sensíveis a cisplatina e as células resistentes à cisplatina A2780CP. B. Dados MS-PCR que mostram estados de metilação diferenciais em regiões promotoras dos genes seleccionados entre as células A2780 e A2780CP. resultado sequenciamento C. Bissulfito de regiões promotoras dos PTK6 gene selecionado, PRKCE e BCL2L1 (ciclo de branco: não metilado CpG, ciclo Black: metilado CPG).

Restauração da expressão gênica de genes afetados DMR por treatmentwith 5 reagente de desmetilação -aza-dc

para confirmar ainda mais nossos dados, foi utilizado 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC) para ver se podemos re-ativar os genes silenciados-metilação que identificamos. 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC) é um análogo da citosina. Quando incorporada no ADN, ele liga-se de forma irreversível as enzimas metiltransferase, resultando em passiva reactivação de-methylationand de genes silenciados epigeneticamente [23]. Utilizou-se 5-aza-dC para tratar tanto as células A2780 e A2780CP em doses diferentes de 0 uM a 10 uM. A expressão de genes tratados com o menor (0 ^ M) foi comparada com a tratada com o mais alto (10 uM), a dose de reagente de desmetilação.

mostrou que fomos capazes de desmetilar os promotores da PRKCE hipermetilado, BCL2L1, Rac2, PTK6, SECTM1 (Fig. 4A, B), e restaurado a sua expressão após o tratamento com 5-aza-dC em células A2780. Da mesma forma, fomos capazes de desmetilar os promotores do gene DDIT3 hypermethylated, e restaurado a sua expressão após o tratamento com 5-aza-dC em células A2780CP (Fig. 4A, B).

A. Validação das mudanças de estado de metilação por MS-PCR para os seis genes em tratamento com 0 mM e 10 mM 5-aza-DC. mudanças B. Expressão Gênica (eixo Y, mudanças vezes relativamente) dos seis genes selecionados após o tratamento com diferentes concentrações (eixo X) de reagente de desmetilação 5-aza-DC.

Discussão

descrevemos aqui pela primeira vez que uma análise MDB-SEQ de um modelo de resposta cisplatina de células de cancro do ovário. As mudanças epigenéticas entre o par isogênico do A2780 sensíveis a cisplatina e suas células A2780CP derivados resistentes sugerem um mecanismo de controle epigenético para a resistência à cisplatina. O conjunto de dados MDB-seq global gerada para este par de células isog�nicas será um recurso útil para a comunidade de pesquisa interessados ​​em resistência à cisplatina e epigenética, e no cancro do ovário em geral. metilação do DNA global muda durante a carcinogênese e muitas vezes é um preditor de respostas de terapia. Por exemplo, Anisowicz et ai. mostrou que, mesmo a parte normal do pulmão de um paciente de cancro já experimentaram uma perda de metilação global do DNA em comparação com um indivíduo normal [24]. Kim et al. mostrou que a metilação de CpG mundial desempenha um papel no controlo da radiossensibilidade epigenética em linhas celulares de cancro do pulmão [25]. Em gliomas, LINE-1 metilação, um marcador global de metilação do DNA, é proporcional à metilação do promotor MGMT e superior LINE-1 metilação é um fator prognóstico favorável na GBMs primários, mesmo em comparação com o promotor MGMT metilação [26]. Aqui observamos uma metilação CpG globais mais baixos nas células A2780CP resistentes cisplatina em comparação com as células sensíveis a cisplatina A2780, sugerindo que os padrões de metilação global do DNA pode ser capaz de prever a resistência a cisplatina para cancros do ovário. Outras experiências é necessário avaliar essa hipótese.

Foram obtidos 1.224 e 1.216 DMRs que é hiper-metilado ou A2780CP comparação com células A2780 (Tabela S1, S2)-metilado hipoglicemia. Descobrimos que genes hypermethylated na linha de células sensíveis foram enriquecidos para termos de ir para anti-apoptose (GO: 0.006.916) e a regulação negativa da morte celular (GO: 0.060.548), sugerindo um possível mecanismo geral de silenciamento epigenético de genes anti-apoptose, resultando em sensibilidade ao cisplatino. Nós também descobrimos que os DMRs são enriquecidas em várias vias de sinalização, incluindo a hsa04010 (via de sinalização MAPK), hsa04310 (via de sinalização Wnt), eo hsa04115 (via de sinalização p53) vias (Tabela 3). A via de sinalização Wnt tem sido implicada na progressão do cancro do ovário e quimiorresistência [27]. A activação da MAPK JNK /p38 em resposta a cisplatina pode levar à indução de ligando Fas e morte celular em células de carcinoma do ovário [4]. P53 e a sua via de sinalização foram também sido implicada na resistência à cisplatina em células de cancro do ovário [28], [29]. Nossos dados sugerem que a regulação epigenética destas vias de sinalização é um dos mecanismos para a participação destas vias na resistência a cisplatina em células de cancro do ovário.

Também hipermetilação identificados em vários loci microRNA incluindo hipermetilação do MI6A2, MIR129- 2, MIR124-1, MIR124-3, e MIR10A em A2780CP e hipermetilação de MIR185, MIR548Q, MIR642A e MIR661 em A2780 (Tabela 4). MicroRNAs foram implicados na resistência à cisplatina em cancro do ovário [30]. Por exemplo, Yang et al. mostrou que muitos miRNAs são desregulamentado no cancro do ovário humano, incluindo miR-214, miR-199 *, miR-200a, miR-100, miR-125b, e deixe-7 cluster, e que miR-214 induz a sobrevivência da célula e resistência à cisplatina segmentação de PTEN [30]. microARNs epigeneticamente silenciados têm sido implicados em cancros [31], [32]. No entanto, a metilação do locus de miARN não foi relatada anteriormente para cancros do ovário; nem os relatórios sobre a relação entre miRNA metilação e resistência à cisplatina. Nossos dados podem apontar para uma nova direção para o estudo da metilação do microRNA loci e cisplatina resistência.

Nós descobrimos que BCL2L1 (BCL2-like 1), PPKCE (proteína quinase C, epsilon), PTK6 (proteína PTK6 tirosina quinase 6), Rac2 (C3 toxina botulínica substrato relacionadas com ras 2), SECTM1 (secretadas e transmembranares 1) está hipermetilado em células A2780 sensíveis a cisplatina e DDIT3 (transcrição de ADN-dano-indutível 3) é hipermetilado na A2780CP resistente à cisplatina células. A sua expressão também também foram alterados em conformidade com a hipótese de que seria hipermetilação silenciar a expressão do gene. Nós confirmou o padrão de metilação desses genes por MS-PCR, e também foram capazes de desmetilar os promotores destes genes e restaurar a sua expressão após o tratamento com 5-aza-dC, um agente que anulações de Metila e reativa de genes epigenetically silenciados [ ,,,0],23].

Encontramos BCL2L1 é hipermetilado nas células A2780 sensíveis. BCL2L1 (Bcl-XL) codifica uma proteína que pertence à família de proteínas Bcl-2, cujos membros proteína actuar como reguladores anti ou pró-apoptóticos [33]. A sobre-expressão da proteína Bcl-XL é conhecido para conferir resistência a uma vasta gama de estímulos potencialmente apoptóticas em processos carcinogénese, incluindo a activação de oncogenes, hipoxia e descolamento da matriz [34] – [37]. O nosso resultado revela que a hipometilação de BCL2L1 nas células resistentes (isto é, a hipermetilação do BCL2L1 nas células sensíveis) iria resultar num aumento da expressão BCL2L1, e assim conferir resistência a cisplatina. Nossos dados são consistentes com a observação por Williams et ai. que a expressão de Bcl-xL no carcinoma do ovário está associada com a doença recorrente quimiorresistência e [38]. Em conjunto, isso sugere que a modulação da expressão de BCL2L1 (Bcl-XL) por meio epigenéticas pode ser uma forma de superar a resistência a cisplatina em células de cancro do ovário.

Também identificamos PTK6 (tirosina cinase de proteína 6) como hipermetilado nas células A2780 sensíveis a cisplatina em comparação com células A2780CP. PTK6 fosforila directamente AKT e promove a activação AKT em resposta ao factor de crescimento epidérmico [39]. A relação de PTK6 com a cisplatina não foi estudado anteriormente. Além disso análise funcional do papel da PTK6 na modulação da resistência a cisplatina é garantido. PPKCE (proteína-quinase C, épsilon) é um outro gene que está hipermetilado em células A2780 sensíveis a cisplatina em comparação com células A2780CP. PPKCE é um membro da família da proteína cinase C (PKC), cujos membros fosforila uma grande variedade de alvos de proteína e estão envolvidas em diversas vias de sinalização celular [40]. Curiosamente, a cisplatina foi capaz de induzir a fosforilação e a translocação de PPKCE a partir da membrana plasmática para a membrana nuclear e para a fracção citosólica [41]. A hipermetilação de PPKCE nas células sensíveis reduziria a sua expressão, o que resulta em menos translocação para a membrana nuclear ou fracção citosólica com a adição de cisplatina. No entanto, se a expressão reduzida de PPKCE confere sensibilidade a cisplatina, em células de cancro do ovário continua a ser estudada.

Finalmente, foram identificados DDIT3 (transcrição-ADN-danos indutível 3) como hipermetilado em células resistentes a cisplatina A2780CP comparação com células A2780. Também chamado GADD153 (paragem do crescimento e dano do ADN de proteína indutível 153), DDIT3 codifica um membro do /proteína de ligação de intensificador CCAAT (C /EBP) a família de factores de transcrição, e é activada pelo stress retículo endoplasmático, e promove a apoptose. DDIT3 expressão (GADD153) pode ser induzida por cisplatina [42]. Observou-se que é hipermetilação nas células resistentes, o que resultaria na expressão reduzida de DDIT3. É possível que a cisplatina actua através DDIT3 para promover a paragem do crescimento e apoptose, e redução da expressão de DDIT3 nas células iria torná-los mais resistentes a cisplatina. No entanto, o mecanismo detalhado permaneceu a ser investigado.

Em resumo, geramos um conjunto de dados global para um modelo de resistência à cisplatina cancro do ovário e identificaram vários genes que foram submetidos a controle epigenético para modular resistência à cisplatina. Estes genes podem serve como alvos para superar chemoresistance à cisplatina no cancro do ovário.

Métodos

As linhas celulares

A2780 e A2780CP foi cultivada em meio RPMI 1640 (Invitrogen) contendo 10 % de soro Fetal bovino (10099-141) a 37 ° C e 5% de CO

2. As células foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Stephen Collins da UC San Diego (CA, EUA).

A citotoxicidade análise

ambas as células resistentes e sensíveis foram semeadas em placas de 96 poços a uma concentração de 4000 células /poço em cinco repetições, com meio de cultura completo. Em seguida, as células foram tratadas com cisplatina em dose diferente de 0 ug /ml a 16 ug /ml. Após 72 horas de incubação, as células tanto viáveis ​​e mortas foram contadas usando ensaio de MTT, e apenas as células viáveis ​​foram incluídos na análise de dados.

sequenciamento e DNA bissulfito modificado metilação-Specific PCR

Nós preparado ADN genómico a partir de células cultivadas utilizando o DNeasy Blood Kit de tecido (Qiagen). Aproximadamente 200 ng de ADN com bissulfito foi tratado com o kit de metilação de ADN-ouro EZ (Zymo Research) de acordo com o protocolo do fabricante. ZymoTaq pré-mistura foi usada para PCR-metilação específico (MSP) e de acordo com estes iniciadores (Tabela S7). PCR específicos de metilação foi executado em um volume total de 25 ul usando ZymoTaq Premix (investigação Zymo). MSP reacções foram submetidas a incubação inicial a 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, e de recozimento à temperatura apropriada durante 35 segundos e 72 ° C durante 40 segundos. extensão final foi realizado por incubação a 72 ° C durante 7 minutos. produtos MSP foram separados em géis de agarose a 2% e visualizadas por coloração com brometo de etídio

Os primers para sequenciamento modificado com bissulfito (Tabela S7) e MSP foram desenhados por ferramentas de web MethPrimer (http:. //www.urogene. org /methprimer /index1.html) [43]. As condições para a reacção de sequenciação modificado com bissulfito são os mesmos que MSP. Os produtos foram purificados utilizando o kit de purificação de PCR MinElute, clonado no vector de T-18 PMD (Takara) e sequenciado.

isolamento do ARN e em tempo real de RT-PCR

O ARN foi extraído utilizando o protocolo de reagente de Trizol (Invitrogen). 2 RNA ug em primeiro lugar foi reversamente transcrito em 25 mL com um Kit Archive (Applied Biosystems) e 2 mL foram amplificados por PCR em Tempo Real (Bio-Rad CFX96 Rea-Time System). As amostras de ADNc foram amplificados com SYBR® Pré-misturar Ex Taq ™. O perfil de ciclos térmicos consistiu de uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 30 segundos e 40 ciclos a 95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 15 segundos e 72 ° C durante 30 segundos. Cada amostra foi processada em triplicado.

Tratamento

5-aza-2′-desoxicitidina

células de carcinoma do ovário humano A2780 e A2780CP foram cultivadas durante 5 dias na presença de várias concentrações de 5-aza -DC (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, e 10 uM). droga fresca foi adicionado a cada 24 h.

ADN metilado Binding sequenciação de proteínas (MethylCap-SEQ)

3 ^ g de DNA genómico isolado tal como descrito acima foi fragmentado por sonicação com Bioruptor (Diagenode, Bélgica) e extremidade-reparado, a-cauda, ​​e ligado a adaptadores de 2,5 mmol de “emparelhado-end” (IDT Inc.) seguintes recomendar o protocolo do fabricante (Illumina Inc.). 1,2 ug do ADN foi fraccionado sobre uma resina GST-MBD feito em casa com um tampão de um aumento da concentração de sal gradual [16]. A fracção de alto teor salino foi directamente amplificados por PCR de 12-ciclo [18]. A fracção de 350-450 pb com os produtos de PCR foi purificado em gel e quantificadas usando um DNA Agilent 1000.

As fracções de ADN 250-400 pb foram excisadas e purificadas como descrito acima. Os produtos foram avaliados e quantificados usando um ensaio de ADN Agilent 1000 Series II e Qubitfluorometer (Invitrogen), respectivamente. Cada biblioteca foi diluída a 8 nM para a sequenciação de um Illumina Genome Analyzer II seguindo o protocolo recomendado do fabricante. imagens obtidas foram analisadas e base chamada usando Illumina fornecida software gasoduto GA OLB 1.6.0 com a configuração padrão. A matéria-lê a partir MethylCap-seq foram submetidos a GEO base de dados que o número de acesso isGSE31418.

A fração de DNA 250-400 bp da fração amplificada era distribuição do gel purificada. Cada biblioteca foi diluída a 8 nM para a sequenciação por Illumina Genome Analyzer II seguindo o protocolo recomendado do fabricante. imagens obtidas foram analisadas e-base chamada usando Illumina fornecida software gasoduto GA OLB 1.6.0 com a configuração padrão. A matéria-lê a partir MethylCap-seq foram submetidos a base de dados GEO (número de acesso GSE31418).

Mapeamento de Sequência Lê

sequência do genoma humano e informações de mapeamento (fevereiro 2009, GRCh37 /hg19) foi