Humana
Abstract
SnoN é um regulador negativo da sinalização TGF-β e também um activador do supressor de tumor p53 em resposta ao stress celular. O seu papel no câncer humano é complexo e controverso com ambas as actividades pró-oncogênicos e anti-oncogênicos relatados. Para esclarecer o seu papel no câncer humano e proporcionar relevância clínica às suas actividades de sinalização, examinamos a expressão SnoN nos tecidos do esôfago, ovário, pâncreas e de mama humanos normais e cancerosos. Em tecidos normais, SnoN é expresso no epitélio e estroma circundante a um nível moderado e é predominantemente citoplasmático. SnoN níveis em todos os epitélios tumorais examinadas são menores do que ou similar ao que nas amostras normais correspondentes, consistente com a sua actividade anti-tumorigénica em células epiteliais. Em contraste, a expressão SnoN no estroma é altamente regulada positivamente nas células inflamatórias que se infiltram em esofágica de alta qualidade e amostras de tumor de ovário, sugerindo que SnoN podem potencialmente promover a progressão maligna através modular o microambiente do tumor nestes tipos de tumores. Os níveis globais de expressão SnoN nestes tecidos de câncer não se correlacionam com o estado de p53. Contudo, em linhas celulares de cancro humano com a amplificação do
snoN
gene, foi detectada uma forte correlação entre o aumento do número de cópias SnoN e inactivação de p53, o que sugere que o supressor de tumor p53 via SnoN-deve ser inactivado, quer através regulação negativa de SnoN ou inactivação de p53, a fim de permitir que a célula cancerosa proliferar e sobreviver. Estes dados sugerem fortemente que SnoN pode funcionar como um supressor de tumores em estágios iniciais de tumorigênese em tecidos de câncer humanos
Citation:. Jahchan NS, Ouyang G, Luo K (2013) perfis de expressão de SnoN em normais e cancerosos Humano tecidos apoiar o seu papel supressor de tumor em Câncer Humano. PLoS ONE 8 (2): e55794. doi: 10.1371 /journal.pone.0055794
Autor: Christina Lynn Addison, Instituto de Pesquisa Hospital Ottawa, Canadá |
Recebido: 04 de novembro de 2012; Aceito: 30 de dezembro de 2012; Publicação: 13 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Jahchan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo é suportado pelo NIH RO1 CA101891 e SR1 DK090347 para K. Luo e DOD BCRP comunhão predoctoral a N. Jahchan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
SnoN (Ski-nova proteína) foi descoberto como um punho oncoproteína que pode induzir a transformação da galinha e de codorniz fibroblastos embrionários quando overexpressed [1] – [4]. Nos mamíferos, SnoN contém ambas as atividades pró-oncogênicos e anti-oncogênicos. A actividade pró-oncogénica de SnoN está dependente da sua capacidade para se ligarem às proteínas Smad e antagonizar as respostas citostáticos de TGF-β [5], [6]. Suppporting seu papel pró-oncogênicos, expressão SnoN é elevado na maioria das linhas celulares de cancro humano, e redução da expressão SnoN por shRNA no cancro da mama invasivo e linhas celulares de cancro do pulmão inibe o crescimento do tumor, tanto
in vitro
e
in vivo
[7]. Mais importante, a superexpressão de SnoN na glândula mamária do mouse acelera o desenvolvimento de câncer de mama e metástase pulmonar induzida pelo antígeno Polyoma meio T (PyVmT) [8], proporcionando o primeiro
in vivo
apoio para a atividade pró-oncogênico de SnoN. Nos últimos anos, no entanto, cada vez mais evidências indicando que surgiram SnoN também pode actuar como um supressor do tumor. camundongos heterozigotos faltando uma cópia do
snoN
show de gene de um aumento da susceptibilidade à tumorigênese cancerígena induzida, sugerindo que SnoN podem proteger camundongos de carcinogênese [9]. Temos demonstrado recentemente que níveis elevados de SnoN inibir a transformação induzida pelo oncogene do rato primária fibroblastos embrionárias
in vitro
e bloquear o desenvolvimento do tumor
in vivo
em um modelo de rato carcinogênese de pele de duas etapas [10 ]. Esta actividade anti-oncogénica de SnoN é independente da sua capacidade de reprimir a sinalização de TGF-β e provavelmente deriva da sua capacidade para induzir a estabilização de p53. Em resposta ao stress celular, níveis elevados de SnoN é recrutado para os corpos nulcear PML onde induz a estabilização de p53, levando ao aumento da senescência celular e apoptose [10]. Assim, níveis elevados de SnoN em células pode activar a via supressora de tumores p53-PML para inibir o crescimento do tumor. Finalmente, SnoN também pode inibir metástase de tumor já que a redução expressão SnoN aumenta epitelial para mesenquimal (EMT) de células do pulmão e cancro da mama
in vitro
e tumor metástase
in vivo
[7].
Dadas as funções complexas de SnoN na tumorigénese, é importante para determinar o seu padrão de expressão em tecidos humanos normais e monitorar como se altera durante a progressão maligna. SnoN é ubiquamente expressa em todos os tecidos embrionários e adultos. Sua expressão é regulada durante fases específicas da embriogênese e morfogênese órgão [11]. Em células não transformadas e tecidos normais, SnoN pode ser detectado tanto em citoplasma e no núcleo, enquanto que em linhas celulares de cancro, é em grande parte SnoN nuclear [8], [12], [13]. Além disso, a expressão SnoN pode ser regulada ao nível de amplificação do gene, a activação da transcrição e a estabilidade da proteína. A humana
snoN
gene está localizado no cromossoma 3q26.2, uma lócus frequentemente amplificada em muitos tipos de cancro, incluindo o do esófago, do ovário e muitos outros [5]. De acordo com este, expressão SnoN é regulada em muitas linhas celulares de cancro [6]. No entanto, se a expressão SnoN também está aumentada em tecidos de cancro humano permanece controverso. Uma série de estudos têm examinado esta questão [13] – [18], mas sem um padrão consistente emergiu. Enquanto alguns estudos relataram um aumento na SnoN RNA e proteína em alguns tecidos de câncer e que essa expressão SnoN maior correlação com pobre diferenciação, invasão mais profunda e sobrevida do paciente pobre [13], [14], [16], outros detectada uma diminuição na expressão SnoN em cancros semelhantes, particularmente em displásicos e câncer altamente invasivo [15], [17], [18]. A relação de potencial entre a localização de SnoN e estado maligno de câncer também variou de estudo para estudo. Esses dados conflitantes sugerem uma relação mais complexa entre a expressão SnoN e transformação maligna e justificar a necessidade de um exame mais amplo da expressão SnoN em tecidos normais e cancerosas de diferentes estágios malignas.
Neste relatório, examinamos a expressão SnoN em quatro tipos de tecidos humanos normais e tecidos de câncer de correspondência de vários estágios clínicos de malignidade para avaliar se alterações da expressão SnoN correlação com malignidade e /ou o estado de inactivação p53 tumor. Estes quatro tipos, esofágica, do ovário, da mama e os tecidos pancreáticos foram escolhidos porque SnoN tem sido implicada no desenvolvimento destes cancros e /ou nas funções normais destes tecidos. Esôfago e do ovário cancros muitas vezes envolvem amplificação do 3q26 amplicon, eo número de cópias do
gene SnoN
, bem como níveis de transcrição SnoN foram encontrados para aumentar nestes cancros [14], [16], [19 ], [20]. No entanto, o padrão de expressão da proteína em células de ovário SnoN normal e no adenocarcinoma do ovário não foram definidos. O câncer de pâncreas está intimamente associado com o TGF-β /Smad via e Smad4 é inativada em cerca de 60% de câncer pancreático [21]. Como um regulador negativo de Smad4, SnoN também podem desempenhar um papel no desenvolvimento do cancro do pâncreas. Por fim, os nossos estudos recentes utilizando vários modelos de ratos têm mostrado que a expressão é regulada SnoN dinamicamente durante o desenvolvimento da glândula mamária [8] e está implicada na progressão maligna do cancro da mama [7], [8], [12]. Ao examinar o local e os níveis de expressão SnoN nestes tecidos, esperamos obter uma melhor compreensão das funções que desempenham SnoN durante tumorigênese tanto no ambiente epitélio e estroma e como isso pode se correlacionar com inativação p53.
materiais e Métodos
Arrays tecido normal e cancro
Todas as matrizes foram adquiridos da Biomax (Cybrdi Inc). Estas matrizes vêm com informações sobre estágios clínicos, notas de patologia e TNM. A matriz de esôfago contém pares de amostras de biópsia do tumor e amostras normais correspondentes em 39 pacientes com diagnóstico histológico e adenocarcinoma clinicamente classificadas: 8. Pacientes com grau I, 19 pacientes com grau II e 11 pacientes com tumores de grau III
A matriz de tumor de ovário contém amostras de biópsia de tumor e 10 amostras pareadas normais de 69 mulheres com idades entre 50 +/- 10. Os tumores foram classificados para ser adenocarcinomas de ovário:. 3 pacientes com carcinoma clara ovário, 12 pacientes com grau I, 29 pacientes com grau II e 25 pacientes com adenocarcinomas grau III (todos com metástase ganglionar, mas a metástase não muito distante)
A matriz de tumor pancreático contém amostras de 90 pacientes e cinco amostras de tecidos normais do pâncreas. Os tipos de tumores nesta gama incluem adenocarcinoma ductal, adenocarcinoma mucinoso, carcinoma neuroendócrino, carcinoma adeno, carcinóide, e carcinoma papilar pseudo-sólida. Eles foram classificados em diferentes classes clínicas com base em avaliação histológica: 21 pacientes com grau I, 59 pacientes com grau II, 8 pacientes com grau III (muitos com metástase ganglionar), e 2 pacientes com tumor grau IV com metástases à distância
A matriz do cancro da mama contém amostras de biópsia do tumor duplicados de 31 pacientes, com seis amostras normais de seis pacientes correspondentes e 9 amostras metastáticos de 9 pacientes correspondentes. Estes tumores foram classificados clinicamente pela análise histológica a ser infiltrando carcinoma ductal: 9 pacientes com IIA grau, 4 pacientes com grau II B, 10 pacientes com grau IIIA, 5 pacientes com grau IIIC, 9 pacientes correspondentes com linfonodo metastático, e 1 paciente com adenocarcinoma metastático ao ovário. Como não foi detectada nenhuma diferença na expressão SnoN entre o grau IIA e IIB ou entre IIIA grau e tumores IIIC, agrupamos essas amostras juntos como grau II ou grau III tumores. Além disso, 24 pares de carcinoma ductal da mama in situ (CDIS) amostras com correspondentes tecidos normais foram obtidos a partir de centro de câncer UCSF.
A espessura de todas as matrizes é de 5 mm. A matriz do cancro da mama contém amostras duplicadas de cada paciente e de esôfago, matrizes ovário e pâncreas tem uma seção de cada paciente.
Imunohistoquímica
Para SnoN immuostaining.
parafina-embedded matrizes foram desparafinados em xileno em seguida, re-hidratadas numa série de gradiente de etanol. As secções foram imersos em NaCl a 0,85% durante 5 minutos, em seguida, em PBS, durante 5 minutos, e fixadas com paraformaldeído a 4% (PFA). Permeabilização das lâminas foi realizada com 20 ^ g /ml de proteinase K durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT), seguido por lavagem em PBS durante 5 minutos. As amostras foram fixadas uma segunda vez com PFA a 4%, e bloqueadas durante a noite em 1% de BSA /10% de soro de vitelo recém-nascido /0,02% de Triton X-100 em PBS numa câmara humidificada a 4 ° C. A coloração foi realizada com um anticorpo anti-SnoN que reconhece um péptido C-terminal de SnoN [12] a uma concentração de 1 ug /ml durante 2 horas, juntamente com um controlo de competição de péptidos e um controlo negativo sem anticorpo primário. Após 3 lavagens com tampão IF (10% de soro de vitelo recém-nascido /0,02% de Triton X-100 em PBS) durante 15 minutos cada, o anticorpo secundário conjugado fluorescente (anticorpo anti-coelho Alex488 1:400 diluição) foi adicionada às lâminas durante 1 hora à TA no escuro. As lâminas foram lavadas uma vez com tampão IF durante 15 minutos e duas vezes com PBS durante 10 minutos cada, seguido por adição de uma gota de meio de montagem Vectashield DAPI (H-1200; Vector Laboratories, Burlingame, CA).
A secções dos mesmos tipos de tecidos (normais e cancerosos) foram todos corados na mesma experiência, em condições idênticas, e as imagens foram tiradas sob o microscópio confocal de uma sessão. Além disso, o mesmo lote de anticorpo e as diluições foram usadas para todas as colorações descritos no presente documento. Em nenhum caso foi os anticorpos re-utilizado em qualquer das experiências.
para imuno-histoquímica de p53.
Secções
incluídos em parafina foram desparafinizadas em xileno, re-hidratadas em etanol, e incubou-se com 3% de H
2O
2 para 10 minutos para extinguir a actividade da peroxidase endógena. Em seguida, as secções foram micro-ondas a 95 ° C durante 30 minutos em tampão de citrato de sódio (pH 6) [22] e bloqueadas utilizando o Kit de Amplificação de Sinais Tyramide Biotina System (Perkin Elmer, Boston, MA) durante 30 minutos à TA. As lâminas foram tratadas durante 30 minutos com anti-p53 em 1:200 diluição (DO-7 clone; Abcam, Cambridge, Reino Unido). Depois de lavar 3 × 5 minutos em 0,05% de Triton X em PBS, as lâminas foram incubadas em anticorpo secundio biotinilado durante 30 min à TA. Todos os passos subsequentes foram realizados segundo o protocolo do fabricante. Para visualização, DAB foi usado como substrato de peroxidase (SK-4105; Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Captura de Imagem e Semi-Quantitativo Análise de Dados
Para cada amostra de tumor SnoN-manchado , pelo menos, três imagens foram capturadas utilizando o microscópio confocal LSM 510 sob a objectiva de 20x para certificar-se que as principais áreas para cada amostra são incluídos na quantificação. intensidade SnoN (o número de pixels /área) de cada uma das três áreas foi calculada utilizando o software de imagem J, e o tamanho da área foi mantida constante durante todo o processo de quantificação. Os números foram então calculada a média para cada amostra de tumor. Os sinais de fundo e de controlo de concorrência péptido negativos foram subtraídos de todos as amostras durante a quantificação. As imagens p53 são tomadas com o microscópio de fluorescência Zeiss AxioImager. intensidade do sinal p53 nuclear foi quantificada em um 0 (negativo) a 5 escala (coloração altamente intensa).
Para a análise do potencial associação de mutação TP53 e amplificação SKIL, foi realizada a mineração da enciclopédia linha de células Novartis dados ( CLE) que contém 947 linhas de células humanas de câncer [23], no qual copiar números e mutações de SnoN (SKIL) e genes p53 foram caracterizados usando Affymetrix SNP6 microarray ou RNA-Seq. Foram analisados 914 linhas de células, separando as linhas de células com base na freqüência de amplificação SnoN e examinando a frequência da mutação TP53 dentro de cada grupo.
A análise estatística foi realizada utilizando a função t-teste do estudante no pacote de R bioconductor como 2 de cauda t-testes assumindo variâncias desiguais. coeficiente de correlação de Pearson foi calculado usando o pacote de R, e o significado do coeficiente de correlação observada foi determinada utilizando uma amostra t-teste contra a população de coeficientes de correlação in-entre p53 e todos os genes Entrez no genoma humano. potencial correlação entre a expressão SnoN e inativação do p53 em tecidos de câncer foi avaliada utilizando o teste de Kruskal-Wallis.
Resultados
SnoN é expressa em normais de mamíferos tecidos
Para determinar a normalidade padrão de SnoN em vários tecidos humanos e estabelecer uma base para uma análise mais aprofundada de tecidos de câncer, examinamos primeiro expressão SnoN em 39 amostras normais de esôfago de tecido, 10 amostras normais da mama, 6 ovariana normal e 5 amostras de pâncreas normais por imuno-histoquímica com anti-SnoN. Este anticorpo purificado por afinidade foi criado contra um péptido C-terminal de SnoN humana e foi anteriormente caracterizado por estudos de imunofluorescência e de imuno-histoquímica [8], [12]
A mucosa do esófago contém três camadas:. O não-queratinizado epitélio escamoso estratificado, a lâmina que consiste em tecido conjuntivo frouxo, e a mucosa muscular consistindo de músculo liso. No epitélio escamoso estratificado esofágico, SnoN foi expresso em níveis moderados a elevados no citoplasma, com uma coloração mais forte na parte superior da superfície do epitélio achatado do que na camada inferior de células cubóides (Figura 1A). Na lâmina própria, SnoN era predominantemente localizada no citoplasma das células do tecido conjuntivo, mas também podem ser detectados no núcleo de alguns fibroblastos. Os vasos sanguíneos SnoN expresso a um nível elevado, e o músculo esquelético da mucosa muscularis teve a maior coloração SnoN (Figura 1A). Assim, SnoN é expresso tanto em células epiteliais e do estroma do compartimento, e dado o seu elevado nível de expressão no músculo, os vasos sanguíneos e fibroblastos, que podem desempenhar um papel importante na regulação do microambiente estromal.
na expressão SnoN o esófago normal, incluindo os suprabasais células escamosas epiteliais diferenciadas, a lâmina (estroma e do tecido conjuntivo), e mucosa muscular (músculo liso). E: células epiteliais; F: fibroblastos; B.V.; vaso sanguíneo. Controlo negativo: tecido coradas com anticorpo secundário conjugado sozinho e sem anticorpo primário. controle Peptide: tecido manchado com o controlo da concorrência peptídeo SnoN. Verde: SnoN; azul, DAPI. B, expressão representativas SnoN no tecido normal do ovário. E: folículo células epiteliais; S: estroma. O painel esquerdo é mancha DAPI sozinho (azul), o painel do meio é SnoN mancha sozinho (verde), e o painel direito é SnoN (verde) mais DAPI (azul) manchas. O mesmo é verdadeiro para os painéis figura em C-D. C, expressão representativas SnoN no pâncreas normal. E: células epiteliais acinares; S: células estromais da septos de tecido conjuntivo lobular. D, expressão Representante SnoN na mama normal. E: células epiteliais de dutos e lobuli; S:. Estroma
No tecido ovariano normal, SnoN foi predominantemente citoplasmática e expressos em níveis moderados nas células foliculares epiteliais primordiais e primários e células do estroma (Figura 1B). No pâncreas normais, SnoN estava presente no citoplasma das células epiteliais dos ácinos e ductos intralobulares em níveis moderados, e no septos de tecido conjuntivo lobular a um nível mais baixo (Figura 1C). Finalmente, em tecidos da mama normais, SnoN foi expressa no citoplasma das células epiteliais dos ductos lobuli e terminais (Figura 1D), semelhante ao que foi relatado antes de [8], [12]. Também foi detectada em estroma a um nível inferior. Assim, SnoN está presente em todas as camadas epiteliais e estromais destes quatro tipos de tecido normais em níveis diferentes. Nas células epiteliais de todos os tipos de tecidos, SnoN está predominantemente localizada no citoplasma. Isto é consistente com nossos resultados anteriores [8], [12].
SnoN expressão se reduz em grau inferior do esôfago Adenocarcinoma mas comparável ao de WT tecidos do tumor de alto grau Stroma
próxima examinou os níveis de expressão SnoN e padrões em 39 amostras de tecido adencarcinoma esofágicas por imunofluorescência seguido por imagem confocal, tanto 20X e 40X e os comparou com que nas amostras normais correspondentes. Estas amostras de adenocarcinoma de esôfago foram classificados clinicamente de grau I a III. Notavelmente, a estrutura do tecido multi-camadas visto no tecido esofágico normal, foi completamente perdida nestas amostras de adenocarcinoma e células do estroma do tumor são intercaladas com epitélio do tumor. A nossa análise semi-quantitativa mostrou que em comparação com o epitélio escamoso normal, SnoN expressão foi significativamente reduzida em grau I (p = 0,00016) e, em menor extensão, os tumores de grau II (p = 0,142) (Figura 2A e 2B). Curiosamente, tal como tumores progrediu para uma fase mais maligna (grau III), expressão SnoN recuperou gradualmente para um nível comparável ou maior do que em controlos normais (duas amostras representativas, uma semelhante ao normal e um mais elevado são apresentados na Figura 2A). SnoN expressão nas células do estroma e do tecido conjuntivo em tumores de grau I e II foram também diminuiu significativamente do que em tecidos normais. Grau III estroma do tumor, no entanto, mostraram uma regulação positiva significativa da expressão SnoN do que os tumores grau I (p = 0,0068), que atinge um nível semelhante ao e em 55% das amostras, mais elevada do que nos tecidos normais (último painel, Figura 2A) , especialmente à infiltração de células inflamatórias e fibroblastos (linfócitos, leucócitos e fagócitos) (Figura 2A e 2C). No entanto, devido às grandes variações entre amostras individuais de grau III, a variação média nos níveis de SnoN estroma mais que em tecidos WT não foi estatisticamente significativa. Notavelmente, SnoN permaneceu em grande parte citoplasmática nestas amostras tumorais. Nossos dados sugerem que a expressão SnoN é regulada negativamente em pacientes com baixo grau de adenocarcinoma de esôfago, mas sua expressão é restabelecida em tumores de alto grau, em particular no estroma (para números detalhados, ver Tabela 1). Isto sugere que a expressão SnoN pode variar em diferentes estágios de malignidade e que SnoN podem desempenhar diferentes papéis em diferentes estágios de tumorigênese.
A, Representante SnoN coloração de câncer de esôfago de vários tipos de 20X (em cima) ou 40X ( inferior) ampliações. Dois grau III amostras representativas de diferentes níveis de expressão SnoN foram mostrados. E: epitélio; S: estroma. Verde: SnoN; azul, DAPI. B, coloração SnoN em células epiteliais normais e tumorais foi quantificada usando o programa Image J e os números foram plotados no gráfico de caixa, que inclui amostras normais (n = 36, a intensidade média = 1,13) e amostras de tumores de esôfago de grau I (n = 8, média = 0,07), II (n = 19, média = 0,71) e III (n = 11, média = 1,26). A análise estatística comparando os controlos normais para cada grau do tumor mostraram que os níveis epitelial SnoN em adenocarcinoma esofágico são significativamente mais fraco (grau I: p = 0,0002) ou semelhante (grau II: p = 0,1425 e grau III: p = 0,3349) para que em a amostras normais de controlo. O aumento na expressão SnoN epitelial grau III em comparação com grau I foi estatisticamente significativa (p = 0,0013). C, quantificação da coloração estromal SnoN em amostras normais (n = 27, média = 1,69) e de tumores de esôfago amostras de grau I (n = 5, média = 0,23), II (n = 19, média = 1,09) e III ( n = 11, média = 1,78). A análise estatística comparando os controlos normais para cada grau do tumor esofágico é como se segue: p = 0,0023 para o grau I, p = 0,8565 para a II, e p = 0,1132 para a classe III. O aumento da expressão do estroma SnoN no grau II (p = 0,0287) e grau III (p = 0,0068) em comparação com tumores do estroma I tumor grau foi estatisticamente significativa.
SnoN Expression é reduzida na de grau inferior ovarianos adenocarcinoma tecidos, mas elevada em High Grade tumor Stroma
à semelhança do que tem sido observado em câncer de esôfago, expressão SnoN foi regulada negativamente no grau I e, em menor grau, II amostras de adenocarcinoma de ovário grau em ambos os epitélios tumor e estroma (Figura 3 e Tabela 1), mas de novo recuperado no grau III tumores. Grau III amostras de adenocarcinoma de ovário mostraram heterogeneidade na expressão SnoN, com 60% das amostras que exibem uma maior coloração SnoN (último painel, Figura 3A) do que os outros tecidos normais e exibem uma fraca coloração SnoN (painel # 4, Figura 3A). Como um resultado desta heterogeneidade, a análise estatística mostrou que não houve diferença na expressão global SnoN entre o tecido de ovário normal e grau III amostras tumorais. No entanto, quando comparado com as amostras de tumor de grau inferior, o compartimento estromal das amostras de tumores de grau III mostrou uma muito mais forte SnoN coloração (Figura 3A e 3C). Estas células estromais foram identificados por patologistas como infiltrantes fibroblastos e células inflamatórias. Mais uma vez, SnoN permaneceu em grande parte citoplasmática nestas amostras tumorais. Assim, semelhante ao que foi observado com o cancro esofágico, SnoN expressão em cancro do ovário também pareceu ser mais baixa nos estágios iniciais da progressão maligna.
A, expressão SnoN representativas em tecido de ovário normal e no adenocarcinoma do ovário de vários tipos de tumor em 20X 40X ampliações (inferior) (em cima) ou. Dois grau III amostras representativas de diferentes níveis de expressão SnoN foram mostrados. E: epitélio; S: estroma. Verde: SnoN; azul, DAPI. B, coloração SnoN em células epiteliais tumorais normais e de ovário foi quantificada utilizando o software Image J. e os números foram plotados no gráfico de caixa, que inclui amostras normais (n = 10, média = 1,28) e amostras de tumores ovarianos de grau I (n = 11, média = 0,55), fase II (n = 29, média = 1,05), e estágio III (n = 25, média = 2,04). A análise estatística comparando os controlos normais para cada grau do tumor mostraram que os níveis epitelial SnoN em adenocarcinoma de ovário são iguais ou mais fraca do que as amostras de tecido de controlo: p = 0,6139 para o grau I, p = 0,7984 para a II, e p = 0,1461 para III. Não se observou qualquer diferença significativa entre as amostras de tumor de ovário. C, coloração SnoN em células estromais em amostras normais (n = 10, média = 1,38) e de tumor de ovário amostras de grau I (n = 7, média = 0,61), II (n = 23, média = 0.81), e III ( n = 20, média = 2,00). A análise estatística comparando os controles normais a cada grau do tumor de ovário é como segue: p = 0,5997 para a classe I, p = 0,3633 para grau II e p = 0,1833 para grau III. O aumento da expressão do estroma SnoN no grau III em comparação com grau II (p = 0,0258) foi estatisticamente significativa.
SnoN Expression é diminuído em pancreáticas Adenocarcinoma amostras
A matriz de tecido do cancro do pâncreas contém vários tipos de adenocarcinoma de todos os três tipos clínicos (I-III), incluindo adenocalarcinoma ductal, adenocarcinoma mucinoso, carcinoma neuroendócrino, carcinoma adeno-escamoso, carcinóide, e carcinoma papilar pseudo-sólido. Em todas as amostras de cancro do pâncreas em todos os três tipos de tumor, foi SnoN citoplasmática e foi expressa a um nível inferior do que nas amostras normais da mesma idade (Figura 4A-4B e Tabela 1). Em todos os graus de tumor, expressão SnoN foi o mais elevado estágio III adenocarcinoma do pâncreas (Figura 4B). No entanto, este aumento não estava acima dos controlos de tecido normal. O compartimento estromal do tumor não têm uma coloração SnoN mais elevado do que o estroma normal (Figura 4A e 4C). Assim, em nenhum dos tecidos tumorais foi SnoN expresso a um nível mais elevado do que em tecidos normais, consistentes com um papel de supressor de tumor no cancro do pâncreas SnoN.
A, expressão representativas SnoN no pâncreas normal e no pâncreas adenocarcinoma de diferentes graus de 20X 40X ampliações (inferior) (em cima) ou. E: epitélio; S: estroma. Verde: SnoN; azul, DAPI. B, coloração SnoN em células epiteliais tumorais normais e pancreáticas foi quantificada usando o Image J, e os números foram plotados no gráfico de caixa, que inclui amostras normais (n = 5, média = 3,08) e as amostras de tumor pancreático de grau I (n = 21, média = 1,89), grau II (n = 59, média = 1,59), e grau III (n = 8, média = 2,09). expressão SnoN em amostras de tumor foi mais fraca do que em amostras de pâncreas normais (p = 0,0855 para a classe I, p = 0,0125 para a II e p = 0,0518 para a III). Não foi observada diferença significativa na coloração epitelial SnoN entre as amostras de tumor pancreático. C, coloração SnoN no normal (n = 2, média = 1,87) e as amostras do estroma tumor de grau I (n = 20, média = 2,10), II (n = 55, média = 1,70) e III (n = 8, média = 1,57). Não há nenhuma diferença estatisticamente significativa entre amostras tumorais e estroma normal.
SnoN Expression é significativamente reduzido na mama ductal Adenocarcinoma
A matriz de tecido de câncer de mama contém amostras de biópsia duplicados de pacientes com infiltração carcinoma ductal de mama de estágios II e III e carcinoma metastático para os gânglios linfáticos. Para nossa surpresa, os níveis SnoN não estavam elevados em qualquer uma das amostras de tumor (Figura 5A-5B e Tabela 1). Pelo contrário, os níveis de SnoN foram significativamente mais baixos do que as amostras de controlo e não foi observada correlação entre os níveis de expressão e a presença de metástases dos nódulos linfáticos (Figura 5B). SnoN foi expressa a níveis elevados em muito poucas amostras e foi predominantemente citoplasmático. Para a maioria das amostras de tumor, a expressão SnoN no estroma foi marcadamente mais baixa do que nas amostras de controlo normais (Figura 5A e 5C).
A, expressão representativas SnoN nas amostras normais e de adenocarcinoma ductal da mama em 20X (em cima) ou 40X ampliações (em baixo). E: epitélio; S: estroma. Verde: SnoN; azul, DAPI. B, coloração SnoN em condições normais (n = 6, média = 1,59) e de tumor da mama células epiteliais de grau II (n = 9 para IIA e n = 3 para IIB, significa = 0), grau III (n = 10 para IIIA e n = 5 para IIIC, média = 0), e as amostras metastáticos (n = 10, média = 0). A diminuição da expressão SnoN em amostras de tumores em comparação com tecidos normais, tem um valor de p de 0,0966 para o grau II, 0,0430 de grau III, e 0,0321 para as amostras metastáticas. C, coloração SnoN em células estromais de normal (n = 6, média = 1.35) e amostras de tumor de mama de grau II (n = 9 para IIA e n = 3 para IIB, significa = 0), grau III (n = 10 para IIIA e n = 5 para IIIC, média = 0,38), e as amostras metastáticos (n = 10, média = 0). Os valores de p para cada tumor comparação /normal foi de 0,3340 para grau II, 0,1647 para grau III, e 0,0695 para as amostras metastáticos. D, expressão SnoN representativas de uma secção de mama normal e carcinoma ductal in situ secção feita a partir do mesmo paciente. Verde: SnoN; azul, DAPI.
Para testar a possibilidade de que SnoN podem ser elevados durante os primeiros estágios de tumorigênese mas reduziu a fase tardia da progressão maligna, foram coletadas e coradas 24 amostras de DCIS humanos e suas correspondentes tecidos normais para expressão SnoN. Curiosamente, embora em qualquer célula individual nos tecidos DCIS, o nível de expressão SnoN foi semelhante ou em alguns casos, mais baixa do que em células em tecidos normais, devido a um marcadamente aumentou o teor epitelial em DCIS, o nível global SnoN em todo o tecido foi muito maior do que em tecidos normais (Figura 5D). Assim, o aumento global do nível SnoN em amostras de DCIS reflete o conteúdo epiteliais significativamente elevados nestes tecidos mas não a regulação positiva da expressão SnoN em células individuais.
No seu conjunto, ao contrário do proposto anteriormente, expressão SnoN é reduzido em menor tumores malignos grau de esófago, da mama, do pâncreas e dos ovários (Tabela 1). No esôfago e câncer de ovário, e em menor grau em câncer pancreático, expressão SnoN recuperou gradualmente nos tumores de grau III.