Abstract

condroitina E sulfato (CS-E), um glicosaminoglicano altamente sulfatada, é conhecido por promover a invasão pelo tumor e metástases. Uma vez que a presença de CS-E é detectado em células tumorais e do estroma no adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), o envolvimento de vários estágios de CS-E no desenvolvimento de PDAC tem sido considerada. No entanto, o seu envolvimento na fase inicial da progressão PDAC ainda não é totalmente compreendido. Neste estudo, para esclarecer o papel direto do CS-E no tumor, mas não estroma, células do PDAC, nós nos concentramos em carboidratos sulfotransferase 15 (CHST15), uma enzima específica que biosynthesizes CS-E, e investigou os efeitos da CHST15 siRNA sobre a proliferação de células tumorais

in vitro

e crescimento

in vivo

. ARNm CHST15 é altamente expresso em linhas celulares de cancro pancreático humano PANC-1, MIA PACA-2, Capan-1 e Capan-2. CHST15 siRNA inibiu significativamente a expressão de mRNA CHST15 nestes quatro células

in vitro

. O silenciamento do gene CHST15 nas células foi associada com uma redução significativa da proliferação e aumento da regulação do ciclo celular p21 gene relacionado com inibidor

CIP1 /WAF1. Num modelo de tumor de xenoenxerto subcutâneo de PANC-1 em ratinhos nus, uma única injecção intratumoral de CHST15 siARN quase completamente suprimido o crescimento do tumor. sinais de proteína CHST15 reduzidos associados com necrose de tumor foram observados com o tratamento com siRNA CHST15. Estes resultados fornecem evidências da ação direta de CHST15 sobre a proliferação de células tumorais pancreáticas em parte através da p21

CIP1 /WAF1 via. proliferação de células de tumor Assim, CHST15-CS-E-mediada eixo poderia ser um novo alvo terapêutico na fase precoce da progressão PDAC

citação:. K Takakura, Shibazaki Y, Yoneyama H, Fujii H, t Hashiguchi, Ito Z, et al. (2015) inibição da proliferação celular e crescimento do câncer de pâncreas pelo silenciamento de Carboidratos sulfotransferase 15

In Vitro Comprar e num modelo de xenoenxerto. PLoS ONE 10 (12): e0142981. doi: 10.1371 /journal.pone.0142981

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, United States |

Recebido: 07 de fevereiro de 2015; Aceito: 29 de outubro de 2015; Publicação: 07 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Takakura et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado, em parte, pela vida Assistência social Fundação Mitsui, número do auxílio N /a, SK. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Além disso, as despesas necessárias foram pagos a partir dos recursos financeiros de nosso escritório médico (Divisão de Gastroenterologia e Hepatologia, Departamento de Medicina Interna, a Escola de Medicina da Universidade de Jikei). Institute Co., Inc. forneceu apoio sob a forma de salários para os autores (YS, HY, MF, TH), mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito . Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições”

Conflito de interesses: Stelic Institute . Co., Inc. forneceu apoio sob a forma de salários para os autores (YS, HY, MF, TH). Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) tem firmemente se estabeleceu como um dos tumores humanos sólidos mais letais em todo o mundo [1]. casos de morbidade e mortalidade relacionadas com o PDAC, mostram estar aumentando. Investigação dos mecanismos subjacentes às características malignas do PDAC, incluindo o diagnóstico tardio, invasão agressivo, com disseminação precoce e quimio-resistência, é urgentemente necessária para estabelecer um tratamento eficaz e para melhorar o prognóstico. A progressão tumoral envolve um processo de vários passos, tais como a proliferação, invasão, metástase e angiogénese, ainda, estes processos permanecem pouco compreendidos no PDAC. Em células de cancro do pâncreas primários, sinais proliferativos são mantidos constitutivamente activa por genes mutantes, e a proliferação infinito de sub-clones geneticamente distintas é observada antes do processo de invasão. alterações genéticas podem ocorrer em locais distantes após a metástase [2-4]. Todas as fases de progressão do tumor também são afectadas pelo microambiente circundante onde glicano desempenha um papel central na modificação de células tumorais e em mutações genéticas. Os tumores contêm vários glicosaminoglicanos (GAGs), que regulam o comportamento de células interagindo com diferentes moléculas, tais como factores de crescimento, citocinas, quimiocinas, proteinases e seus inibidores [5]. GAGs incluem sulfato de condroitina (CS), sulfato de heparina, sulfato de queratam e ácido hialurônico. A espinha dorsal de açúcar do CS consiste em repetir unidades de dissacarídeos de D-glucurónico acidβ1-3

N

-acetil-D-galactosamina (GalNAc). Durante o prolongamento da cadeia na biossíntese de CS, as unidades de dissacárido são modificados por sulfotransferases específicos em C-2 do GlcA e C-4 e /ou C-6 de GalNAc em várias combinações e exibir enorme diversidade estrutural, produzindo padrões de sulfato de característica crítica para se ligar a uma variedade de proteínas funcionais. unidades de dissacarídeo altamente sulfatados como a E-unit, GlcAβ1-3GalNAc (4S, 6S), onde 4S e 6S representam 4-

O Restaurant – e 6-

O

-sulfate, respectivamente, e preparações CS e-rico-unit (CS-e) são sintetizados por uma enzima específica, carboidratos sulfotransferase 15 (CHST15), e mostrar atividades biológicas notáveis ​​[6-12]. Acumulando revelou evidência do envolvimento de CS-E na invasão de células de tumores e metástases no pulmão [6, 13], de ovário de [7, 14], da mama [15] e pele [16]. O papel de CS-E para iniciar a invasão da célula tumoral foi demonstrada, sugerindo o potencial de CS-E como uma molécula-chave no estabelecimento de novas terapias contra vários tumores sólidos, incluindo PDAC [17].

CS-E é expressa em ambas as células de tumor e células do estroma que rodeiam o tumor em tecidos de pacientes PDAC [17, 18]. Dado o padrão de distribuição de CS-E, o envolvimento de vários estágios e multicelular de CS-E na progressão PDAC foi considerado. Uma investigação gradual é, portanto, necessária para revelar os mecanismos precisos de CS-E nas características malignas subjacentes de PDAC. No entanto, o envolvimento de CS-E na progressão preliminar PDAC ainda não foi explorada. Neste estudo, para investigar se as funções de CS-E directamente na proliferação de PDAC ou não, conduzimos as experiências de bloqueio utilizando ARN interferente pequeno concebido para inibir a expressão de CHST15 (CHST15 siARN) que inibem selectivamente a biossíntese de CS-E. Em simples

in vitro

e

in vivo

experimentos de xenotransplante, demonstramos o efeito da CHST15 siRNA sobre a proliferação de PDAC e discutir o potencial do CS-E como um alvo terapêutico para PDAC.

Materiais e Métodos

Materiais e reagentes

CHST15 siRNA foi adquirido a Ambion, Inc. (TX, EUA). CS-E foi obtido a partir de Seikagaku CORPORATION (Tóquio, Japão), reconstituído em tampão fosfato salino, aliquotado e armazenado a -20 ° C. WST-1 foi obtido a partir de Roche Diagnostic GmbH (Mannheim, Alemanha). Lipofectamine

™ RNAiMAX reagente e Invivofectamine

® 2.0 Reagente foram adquiridos da Invitrogen (CA, EUA).

As linhas celulares e ratos

PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 e Capan-2, linhas celulares de cancro do pâncreas, foram adquiridos à ATCC (Rockville, MA, EUA). Depois de se verificar que as células estavam livres de infecções por micoplasma usando o kit de Mycoplasma ELISA de PCR (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), PANC-1 e MIA PaCa-2, as células foram cultivadas em DMEM (Sigma-Aldrich, CA) contendo soro de vitelo fetal a 10% (FCS) e 1% de antibióticos. células Capan-1 e Capan-2 foram cultivadas em IMDM (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japão) e meio de McCoy 5A modificado (Sigma-Aldrich, CA) contendo 10% de FCS e 1% antibióticos, respectivamente. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 /ar

A transfecção de siRNA

interferência de RNA (RNAi) foi realizada utilizando o método de transfecção reversa:. Antes da célula de galvanização , siARN (50 nmol), meios Lipofectamine 2000 e Opti-MEM (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) foram misturados e incubadas de acordo com as instruções do fabricante. Depois de transfecção durante 48 h, as células foram recolhidas e usadas para outras análises.

em tempo real de semi-quantitativo de RT-PCR

O ARN total foi extraído utilizando o sistema de isolamento de ARN total SV (Promega, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. rendimento e a pureza do RNA foram determinadas por espectrofotometria. A transcrição reversa foi realizada com o Vírus da Leucemia Murina de Moloney da Transcriptase Reversa (Invitrogen) e hexâmeros aleatórios (Promega, WI). Em tempo real de RT-PCR foi realizada utilizando SYBR Green usando o termociclador DICE de acordo com as instruções do fabricante (TAKARA BIO INC., Otsu, Japão). Todos os iniciadores de PCR foram concebidos e sintetizados por TAKARA BIO INC. Os níveis de expressão do gene foram normalizados para desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) e apresentadas como unidades arbitrárias. Os iniciadores de sentido e anti-sentido utilizados foram mostrados na Tabela 1. e as sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela 2. As experiências independentes foram repetidos três vezes para cada amostra, e os níveis de expressão relativa de genes foram analisados.

WST-1 a proliferação de células de ensaio

Para o ensaio de proliferação celular, PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 e células Capan-2 transfectadas com CHST15 siRNA ou negativo controle siRNA foram semeadas numa placa de 96 poços a uma concentração de 1 × 10

4 células /poço. A proliferação celular foi analisada após 60 minutos a partir do início da incubação com o reagente de proliferação celular WST-1 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha).

ensaio de proliferação celular com HGF e CS-E

PANC-1 de células (1000 células) foram semeadas em meio de cultura numa placa de 96 poços um dia antes de estimulação de HGF. As células foram estimuladas com 5 ng /mL de HGF com ou sem 100 ug /mL de CS-E, e proliferação de células foi determinada utilizando o ensaio de WST-1 durante 120 minutos a 37 ° C.

tratamento CHST15 siARN em um modelo de xenoenxerto PANC-1 |

ratinhos BALB /c nu (6 a 9 semanas de idade) foram adquiridos a Japan CLEA-(Tóquio, Japão) e foram mantidos sob condições específicas isentas de patogénios. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Jikei (número de autorização: 25-067). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. células PANC-1 (1 × 10

7 células) em 100 mL de Matrigel BD

™ Matrix (BD, NJ) foram injectados por via subcutânea em ambos os flancos de ratinhos nus [19]. injecção intratumoral de qualquer das 100 uL de controlo 250 nM de ARNsi ou CHST15 siARN complexado com Invivofectamine

® 2.0 reagentes (Life Technologies, CA) foi realizada 7 dias após a inoculação. O tamanho do tumor foi medido todos os dias. No dia 9 e dia 14, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram isolados, pesados ​​e utilizados para a expressão do gene ou análises histológicas.

A análise histológica

Os tecidos tumorais foram fixados em 10% de fosfato formol -buffered. Após a fixação, os tecidos foram embebidos em parafina e cortadas lâminas foram usados ​​para coloração de hematoxilina-eosina (HE) e coloração imuno-histoquímica, tal como descrito anteriormente [20] para CHST15 utilizando um anticorpo CHST15 anti-humana (Sigma-Aldrich) a uma diluição de 1:25. Como um anticorpo secundário, Dako EnVision

™ reagente de detecção flex /HRP (Dako, Dinamarca) foi usado. Nenhum sinal positivo foi detectado quando omissão do primeiro anticorpo, suportando a especificidade da coloração (dados não mostrados).

A análise estatística

Todos os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (SD). As análises estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA one-way seguido pela correção de Bonferroni ou Teste t de Student. A

valor p

inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

induzida por siRNA knockdown CHST15-alvo específico na linha de células de câncer pancreático

em primeiro lugar, confirmou a expressão abundante de ARNm CHST15 nas linhas celulares do cancro do pâncreas PANC-1, MIA PACA-2, Capan-1 e Capan-2, utilizando RT-PCR. Em seguida, estes quatro células foram transfectadas quer com duplexes específicos para o alvo ARNsi (CHST15 siRNA) ou um ARNsi de controlo não específico (ARNsi de controlo). silenciamento do gene foi medido pelo tempo real de RT-PCR, e a expressão CHST15 foi reduzida em células PANC-1, 1%, 85% e 87% em amostras tratadas com siRNA específico para o alvo durante 24 h, 48 h e 72 h, respectivamente . Às 48 horas após a transfecção, foi observada supressão dependente da dose dos níveis de expressão de mRNA CHST15 (dados não mostrados). Portanto, em estudos sucessivos, nós investigamos o efeito de ARNsi CHST15 48 h após a transfecção siRNA. CHST15 expressão foi reduzido em MIA PaCa-2, Capan-1 e Capan-2 células por 75%, 42% e 36% em amostras tratadas com siRNA específico para o alvo durante 48 h, respectivamente.

A inibição do pâncreas proliferação de células de cancro induzida por siARN CHST15

Para avaliar o efeito do knockdown CHST15 (Figura 1A), a proliferação de células foi examinada 48 horas após o início do siARN transfecção utilizando o ensaio de WST-1. Os resultados mostraram o efeito supressor significativo de CHST15 siARN sobre a proliferação celular em PANC-1, Mia PaCa-2, Capan-1 e Capan-2 (Figura 1B). Um aumento nos níveis de expressão do gene p21 foi detectada em células tratadas com siRNA CHST15 em comparação com as células tratadas com ARNsi de controlo em PANC-1 e Capan-2 (Figura 1C).

(A) As quantidades relativas de ARNm em CHST15 ARNsi de controlo tratados e tratados CHST15 siARN PANC-1, Mia PaCa-2, células Capan-1 e Capan-2 (n = 3, em cada uma) foram mostrados após a normalização utilizando GAPDH como um controlo interno. Em cada linhas celulares, houve diferenças significativas quanto à redução da expressão CHST15 em amostras tratadas com siRNA específico para o alvo durante 48 h. Os asteriscos (**, ***) p 0,01, P 0,001, respectivamente, entre o ARNsi de controlo e ARNsi CHST15. (B) Um ensaio de WST-1. A média do nível de proliferação em células tratadas siRNA de controlo (coluna preta) foi expresso como uma norma (1,0) e os dados foram mostradas em relação ao padrão como um índice de proliferação. Média ± DP (n = 3). Foram observados efeitos inibidores significativos de CHST15 siARN sobre a proliferação celular em PANC-1, Mia PaCa-2, Capan-1 e Capan-2. Asteriscos (*, **) p 0,05, P 0,01, respectivamente entre o controle de siRNA e CHST15 siRNA. (C) As quantidades relativas de ARNm de p21 em ARNsi de controlo tratadas e células tratadas com siRNA CHST15 PANC-1 (N = 3-5 em cada). Houve um ligeiro aumento e um aumento significativo de ARNm de p21 em células tratadas com siRNA CHST15 PANC-1 e células Capan-2, em comparação com ARNsi de controlo, respectivamente. Asterisco (*) p 0,05 entre CHST15 siRNA e ARNsi de controlo

Efeito do CHST15 siARN no crescimento do tumor pancreático num modelo de xenoenxerto

Após a confirmação de crescimento celular PANC-1 na. ratinhos nus no dia 7 após a inoculação, foi investigada a efeito supressor de CHST15 siARN sobre a proliferação celular PANC-1

in vivo

(Figura 2). Após a injecção de células PANC-1, em ambos os flancos de ratinhos nus, administrou CHST15 siARN em cada tumor no dia 7. O efeito anti-proliferativo de CHST15 siARN foi identificado contra ARNsi de controlo após dia 9. células PANC-1 tratadas com siRNA CHST15 cresceu mais lentamente do que células de controlo tratadas com siRNA e células não tratadas (Fig 2A). Estes resultados indicam que a proliferação de células PANC-1 foi suprimida após o knockdown de CHST15. em tempo real de RT-PCR foi realizada para avaliar o efeito do gene-supressiva, mas não houve nenhuma diferença significativa na expressão do gene entre CHST15 siRNA-tratados e os ratos de controlo tratados com ARNip quer no dia 9 (dados não mostrados) ou no dia 14 (Figura 2B ).

(A) A mudança do volume do tumor. Os dados foram expressos como média ± SD (não tratado, n = 6, ARNsi de controlo: n = 12, CHST15 siARN; n = 10). Os asteriscos (*, ***) p 0,05, P 0,001, respectivamente, entre o ARNsi de controlo e ARNsi CHST15. (B) As quantidades relativas de ARNm em CHST15 não tratada, ARNsi de controlo tratados e tratados xenoenxertos CHST15 ARNsi no dia 14. Os dados foram expressos como média ± SD (não tratado, n = 6, ARNsi de controlo: n = 12, CHST15 siARN; n = 10 ).

o exame patológico de tumor pancreático pela hematoxilina e eosina e imuno-histoquímica

a fim de demonstrar a eficácia de CHST15 siRNA, os tumores pancreáticos em ratinhos nus foram analisados ​​por HE coloração e coloração imuno-histoquímica CHST15 (Figura 3). Na coloração HE, necrose generalizada foi observada no grupo CHST15 siRNA (Fig 3A) em comparação com o grupo de controlo de siRNA (Fig 3B). Localização dos CHST15 no xenoenxerto foi avaliado por imunocoloração contra a proteína CHST15 humano. CHST15 foi altamente expressa por células tumorais localizadas na frente invasiva (figura 3A e 3C). Forte CHST15-coloração foi detectada no citoplasma das células com a morfologia mesenquimal semelhante (Figura 3E). No centro do tumor, a expressão de CHST15 era relativamente menor em comparação com a frente invasiva (figura 3A e 3C). localisation fraco de CHST15 foi detectável nas células do cabo de estrutura semelhante (Figura 3F). Em contraste, uma clara perda de coloração CHST15 nas regiões do tumor do grupo CHST15 siRNA (Fig 3D e 3G) foi revelado.

(A, B) tumores em ratinhos nus no dia 19, foram coradas com HE ( ampliação original x 100). imagens representativas foram mostrados. lesões de necrose disseminadas foram proeminente no CHST15 ARNsi murganhos tratados (A) em comparação com o ARNsi de controlo ratos tratados (B). (C, D, E, F, G) coloração imuno-histoquímica de CHST15 (Brown, ampliações originais × 100 para C, D, x400 para E, F, G) em xenoenxertos no dia 19. imagens representativas foram mostrados. Embora quase todas as células tumorais em xenoenxerto foram positivos para CHST15 em ARNsi de controlo ratos tratados (D), foi observada forte sinal positivo na frente invasiva, em vez de no centro do tumor. células tumorais morfologia CHST15-altamente positivo exibiram mesenquimais-like (E), enquanto CHST15 de baixa células positivas morfologia cabo-like exibiram (F), Em contraste, pequeno número de células tumorais remanescentes foi fracamente positivo para CHST15 em ratinhos tratados CHST15 siRNA (C ).

CS-E promoveu a proliferação de células PANC-1 na presença do HGF

o efeito da CS-E sobre a proliferação de células PANC-1 foi avaliada

in vitro

(Fig 4). Embora o HGF é conhecido para promover a proliferação de células de tumor, a dose mais baixa de HGF utilizado neste estudo não induz a proliferação de células de tumor significativa. No entanto, o índice de proliferação de PANC-1 foi significativamente aumentada com a mesma dose de HGF na presença de CS-E (Figura 4).

Um ensaio de WST-1 foi realizada utilizando PANC-1 de células. A média do nível de proliferação em células PANC-1, sem adição de CS-E e HGF (coluna branca) foi expresso como uma norma (1,0) e os dados foram mostradas em relação ao padrão como um índice de proliferação. O índice de proliferação em células PANC-1 tratadas com HGF dose baixa (coluna preto) não mostrou diferença estatística no sistema de cultura. Em contraste, o índice de proliferação em células tratadas com HGF PANC-1 aumentou significativamente durante a adição CS-E (coluna cinzenta). Os dados foram expressos como média ± SD (n = 6 em cada).

Discussão

O prognóstico para pacientes PDAC ainda é sombrio, e revolucionária opções terapêuticas são fortemente necessário. Sabe-se que a elevada mortalidade associada com PDAC é atribuída principalmente a sua agressividade Peerless devido à sua invasão e metástases distantes precoce. Estas características malignas são observados em outros tumores avançados, como câncer de ovário. No cancro do ovário, CA-E é detectada em ambas as células de tumor e de estroma e está envolvido na agressividade Peerless do cancro e correlaciona-se com prognóstico pobre [21]. Com base nos seus padrões de distribuição semelhantes, pensa-se que tanto células derivadas de tumores, bem como derivado de células do estroma CS-E desempenham um papel vital nas várias etapas de progressão do tumor em tumores mais avançados.

Para investigar o papel de CS-e no PDAC, utilizou-se CHST15 siARN, que inibe selectivamente a expressão do gene CHST15 e a síntese de CS-e. Nós escolhemos este método porque a inibição seletiva de CS-E usando uma quantidade suficiente de inibidores químicos ou anticorpos ainda é um desafio

in vivo

. Nós focada no efeito da CHST15 directamente no tumor, mas não estromal, proliferação celular, um passo principal de progressão tumoral, na linha celular de cancro pancreático humano PANC-1. Em proliferação do tumor, os GAG têm sido relatados para actuar como co-receptores para factores de crescimento tumoral solúvel. GAG facilitar a formação de complexos ligando-receptor e activação da sinalização do receptor.

Porque o HGF é um dos principais factores solúveis produzidos pelas células tumorais, bem como as células estromais em PDAC, testou-se a actividade do HGF poderia ser aumentada na presença de CS-E. Mesmo quando se utiliza uma menor concentração de HGF, que não conseguiu induzir a proliferação de células tumorais, um aumento significativo na proliferação foi confirmada na presença de CS-E (Figura 4). CS-E por si só não foi capaz de induzir a proliferação de células de tumor, na concentração testada, o que indica que a CS-E aumenta a sinalização do receptor para o HGF.

Inesperadamente, CHST15 siARN isoladamente inibiram directamente a proliferação de células PANC-1

In vitro

. Um mecanismo distinto de co-receptores também foi sugerida. Embora nós não examinar a cinética detalhada durante a cultura, os níveis da p21 do gene relacionados com o inibidor de ciclo celular

CIP1 /WAF1 aumentada em células PANC-1 [22], que demonstrou uma redução significativa nos níveis de ARNm CHST15 às 48 h, sugerindo que o gene modificado CHST15 silenciamentos vias a montante de p21. A este respeito, a regulação positiva de p21 tem sido relatada em algumas condições em células de cancro do pâncreas. Por exemplo, bloqueando a sinalização de Hedgehog induzida sobre-regulação de p21 [23, 24]. Porque a interacção de CS-GAG-Hedgehog foi relatado para aumentar a sinalização Hedgehog [25], uma possibilidade é que o bloqueio da síntese de CS-E poderia contribuir para inibir a sinalização de hedgehog, o que levaria a um aumento da regulação da proteína p21. É necessária mais investigação para compreender os mecanismos CHST15 mediadas que regulam a proliferação de células de câncer relacionado à via do p21.

Nós também testou o efeito do CHST15 siRNA no crescimento do tumor por injecção intratumoral em um modelo de xenotransplante. Após o estabelecimento do tumor, uma única injecção de CHST15 siARN suprimiu significativamente mais o crescimento do tumor (Fig 2A). Não foi observada redução significativa de níveis de ARNm humanos CHST15 uma semana após a injecção CHST15 siRNA, no momento de sacrifício, em comparação com ARNsi de controlo negativo. Em contraste, o exame histológico do xenoenxerto mostrou claramente a redução de células tumorais positivas de proteína-CHST15 humano por CHST15 siARN uma semana após a injecção única, o que indica que foi obtido inibição bem sucedida da CHST15. Uma possível explicação para o desequilíbrio de ARNm-proteína é que o nível de ARNm CHST15 humana derivada de tumor atingiu um pico a pontos de tempo anteriores e diminuiu depois para dias 9, após o que a eficácia no ARNm não podia ser detectado suficientemente. Outra possibilidade é que o nível crítico de ARNm CHST15 não é suficientemente detectada apenas pelo método de PCR. Como as células tumorais CHST15-altamente expressos só pode ser detectado na frente invasiva, mas não no centro do xenoenxerto, considera-se que

in vivo

CHST15 siARN actua principalmente sobre estas células tumorais localizadas na frente invasiva. O número destas células é limitado entre as células tumorais inteiras e os sinais de ARNm não pode ser suficientemente detectado por PCR que utilizou amostras de xenoenxerto de todo. Uma vez que o início do crescimento do tumor foi suprimido pela CHST15 siRNA, e, subsequentemente, a produção de proteína foi inibida, CHST15 mais sinais de crescimento fornecidos por factores de crescimento CHST15 mediadas poderia ter sido eficazmente suprimida. Novos estudos para avaliar a evolução temporal e /ou injeções de siRNA repetidas poderia esclarecer o

in vivo

mecanismo subjacente a relação mRNA em proteínas.

O presente estudo demonstrou, pela primeira vez, que CHST15 siARN podem suprimir o crescimento do tumor, o que é considerado como uma fase primária de progressão do tumor no sítio primário. No entanto, houve várias limitações no presente estudo. Primeiro, usamos apenas as células PANC-1 in vivo, embora, usamos três diferentes linhagens celulares in vitro e observados efeitos semelhantes de CHST15 siRNA na proliferação de células tumorais. Em segundo lugar, utilizou-se um modelo de xenoenxerto de pele para examinar o efeito de simplesmente CHST15 siARN sobre a proliferação e crescimento de células tumorais. modelos de xenoenxerto ortotrópicos irá proporcionar informação adicional sobre o papel de CHST15 siRNA na proliferação de células de tumor num microambiente do tumor. Vai valer a pena tentar esclarecer toda a imagem do papel da CHST15 e CS-E na progressão PDAC, analisando características específicas estágio específico de célula e.

A rota da entrega siRNA foi limitado a uma injecção intratumoral No presente estudo. No entanto, consideramos que a injecção local tem algumas vantagens quando se trata de tumores hipovasculares como no PDAC e para siRNA cuja entrega sistémica ainda é um desafio. Na verdade, a injeção intratumoral de siRNAs está atualmente disponível em ambientes clínicos. Um ultra-som endoscópico (EUS) não é apenas uma ferramenta de diagnóstico, mas também um procedimento intervencionista e terapêutico. A evidência de que EUS intervencionista é útil para o tratamento PDAC via terapia de injeção incluindo siRNAs tem vindo a acumular [26-30]. EUS intervencionista será uma parte essencial da abordagem multidisciplinar para o tratamento do câncer no futuro próximo. Esta técnica fornece a capacidade de tratar PDAC de forma direta e relativamente minimamente invasiva, com uma incidência muito baixa de complicações processuais-relacionados. Consideramos que a aplicação clínica de CHST15 siRNA usando a injeção da agulha EUS-fino para pacientes PDAC será viável em uma clínica real.

Em resumo, nosso estudo demonstrou que RNAi mediada por down-regulação da CHST15 efetivamente inibe a a proliferação e crescimento de células tumorais pancreáticas. A via de sinalização CHST15 desempenha um papel importante na proliferação e PDAC crescimento e pode servir como um alvo terapêutico potencial para PDAC. Mais estudos são necessários para esclarecer o efeito e risco de silenciamento de genes CHST15 por CHST15 siRNA no desenvolvimento PDAC e permitir a sua utilização em todas as aplicações clínicas.

Informações de Apoio

S1 base de dados. . Efeito gene-supressora de CHST15 ARNsi no dia 9-tumoral num modelo de xenoenxerto de

quantidades relativas de ARNm CHST15 em siRNA de controlo tratado e CHST15 siARN xenoenxertos tratados no dia 9. Os dados foram expressos como média ± DP (ARNsi de controlo: n = 7, CHST15 siRNA; n = 5)

doi: 10.1371 /journal.pone.0142981.s001

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