Abstract

RNA pequeno não-codificadores de proteínas, microRNA (MIR), que regulam os níveis de RNA mensageiro, recentemente, foram identificados, e podem desempenhar papéis importantes na patogénese de várias doenças. O presente estudo se concentrou em miR-31 e investigou o seu envolvimento potencial na carcinogênese de pulmão. A expressão de miR-31 foi alterado em células de cancro de pulmão, quer através da amplificação ou perda do locus do gene do hospedeiro. A forte expressão de miR-31 em carcinomas de células grandes foi atribuído à amplificação do gene. Enquanto isso, a perda de expressão de miR-31 foi mais frequentemente observada em adenocarcinomas agressivos. Assim, o miR-31 pode desempenhar um papel pleiotrópicos no desenvolvimento dos cancros do pulmão entre os diferentes tipos histológicos. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a mostrar o potencial mecanismo causador da expressão alterada de miR-31 e sugerem sua importância potencialmente diverso nos diferentes tipos histológicos de câncer de pulmão

Citation:. Okudela K, Tateishi Y, Umeda S, Mitsui H, Suzuki T, Y Saito, et ai. (2014) Desequilíbrio Allelic no miR-31 Anfitrião Gene Locus em Câncer de Pulmão – seu potencial papel na carcinogênese. PLoS ONE 9 (6): e100581. doi: 10.1371 /journal.pone.0100581

editor: Salvatore Papa, Institute of Hepatology – Birkbeck, University of London, Reino Unido

Recebido: 23 Janeiro, 2014; Aceito: 26 de maio de 2014; Publicação: 30 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Okudela et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e (Tokyo Japão), japonês e por uma concessão do Yokohama Medical Facility (Yokohama, Japão). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é uma das causas mais comuns de morte relacionada ao câncer no mundo desenvolvido [1], [2]. Mesmo se o tumor primário é ressecado com sucesso, uma recorrência é observada numa grande percentagem de pacientes [1], [2]. Embora alguns tumores pulmonares são sensíveis aos agentes quimioterapêuticos convencionais ou certos agentes de direccionamento molecular, muitos não são [3], [4]. Deste modo, ainda mais a compreensão do mecanismo molecular subjacente a carcinogénese do pulmão é importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

pequeno ARN de codificação não-proteína, microARN, que regulam os níveis de RNA mensageiro, foram identificados recentemente, e possui foi demonstrado que desempenham papéis importantes na patogénese de várias doenças. Vários microARN (MIR), incluindo let-7, miR-21, o miR-30d, o miR-31, o miR-155 e miR-205, têm sido sugeridos para ser envolvidos na carcinogénese de diferentes tipos de doenças malignas [5]. Entre eles, o miR-31 foi relatada a ser mais fortemente expressa em tecido tumoral do que no tecido não-tumoral, e foi sugerido ter um papel na carcinogénese oncogénica pulmonar [6] – [12]. Além disso, um estudo recente demonstrou o valor prognóstico do miR-31, porque a maior expressão de miR-31 estava associada a um pior resultado em pacientes com cancro do pulmão [13]. Enquanto isso, uma diferença de miR-31 expressão entre os tipos histológicos de câncer de pulmão e o mecanismo potencial de uma expressão alterada de miR-31, não foram elucidados.

O presente estudo analisou a expressão de miR-31 e o status do seu locus do gene de acolhimento nos diferentes tipos histológicos de câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

as linhas celulares e cultura

Um imortalizado linha de células epiteliais das vias respiratórias humanas (16HBE14o , vírus símio 40 (SV40) células transformadas epiteliais brônquicas humanas) descrito por Cozens aL et al. (1994) [14] foi gentilmente cedido pelo Grunert DC (Medical Center Research Institute California Pacific). Um sub-clone de células 16HBE14o, descritos como NHBE-T neste estudo, foi utilizado. linhas de células epiteliais das vias aéreas imortalizadas (e HPL1D HPL1A, as células epiteliais das vias aéreas pequenas humanas transformadas com SV40) foram estabelecidas por Masuda A et al. (1997) [15]. linhas celulares de cancro de pulmão humano (A549, H322M, H358, H522, H820, H2087, H23, EKVX, H226, H827, H1819, H441, H4006, HOP62, H1299, e H460) e uma linha celular de rim embrionário humano (HEK293T) eram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). O LC2AD linha de células humanas de câncer de pulmão, Lu130, Lu135, Lu139 e Lu140, foi adquirido da Riken Cell Bank (Tsukuba, Japão). As linhas de células de câncer de pulmão humanos, PC9 e HARA, eram de Imuno-Biological Laboratories Co. (Gunma, Japão). O linhas celulares de cancro do pulmão humano, TKB1, TKB2, TKB4, TKB5, TKB6, TKB7, TKB8, TKB9, TKB12, TKB14, TKB15, TBK17 e TKB20, foram obtidas do Dr. Hiroshi Kamma via Dr. Takuya Yazawa (University School Kyorin de Medicina) [16]. pequenas células das vias aéreas primária epiteliais (SAEC) e células epiteliais brônquicas humanas normais (NHBE) foram adquiridos de SANKO Kagaku (Tóquio, Japão).

câncer de pulmão primário

Um total de 129 tumores primários de pulmão (71 adenocarcinomas, 38 carcinomas de células escamosas, 18 carcinomas de células grandes e 2 pequenos carcinomas de células) foram removidas por ressecção cirúrgica radical em Kanagawa cardiovasculares e respiratórias Center Hospital (Yokohama, Japão). Este estudo foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsinki [17], e foi aprovado pelos Comitês de Ética de Yokohama City University e da Prefeitura de Kanagawa cardiovasculares e respiratórias Centro Hospitalar [18]. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os assuntos que fornecem materiais.

RNA extração

As linhas celulares foram lavados com frio solução salina tampão fosfato e depois congeladas rapidamente. secções de tecido embebidas em parafina e fixado em formalina e foram examinados microscopicamente. peças tumorais e não tumorais foram dissecados com uma lâmina de barbear. O ARN total foi extraído utilizando o miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA).

RT-PCR quantitativo

Para detectar miARN, o ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de ARN total utilizando o Mir- Kit X miARN da primeira cadeia de síntese de acordo com os protocolos do fabricante (Takara, Quioto, Japão). O ADNc gerado foi utilizado como molde em PCR em tempo real SYBR com Premix ExTaq (Takara) e executado num sistema Thermal Cycler DICE-PCR em tempo real (Takara). O iniciador directo utilizado para a detecção de miR-31 foi 5′- AGGCAAGATGCTGGCATAGCT (amadurecer miR-31, MIMAT0000089). O iniciador inverso foi o iniciador 3 MRQ universal “(Takara). O conjunto de primers usado para detectar U6 snRNA foi comprado de Takara Bio Inc. miR-31 nível foi normalizada para níveis U6 snRNA. Para detectar o ARNm, ADNc de primeira cadeia foi sintetizado a partir de ARN total utilizando o SuperScript III Síntese da primeira cadeia do sistema (Invitrogen). O ADNc gerado foi utilizado como molde em PCR em tempo real com Gene Expression Assay sistema TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) e executado num sistema Thermal Cycler DICE-PCR em tempo real (Takara). As sondas TaqMan e conjunto de primers usado para detectar Applied Biosystems GAPDH [NM_002046.5], ITGA5 [NM_002205.2], MMP16 [NM_005941.4], e RHOA [NM_001664.2], foi customizados e adquiridos. ITGA5, MMP16, RhoA e os níveis foram normalizados para níveis de GAPDH.

análise por PCR do locus de miR-31

O ADN genómico foi extraído das linhas celulares de cancro, utilizando o kit DNeasy (Qiagen). O estado (supressão ou retenção) do locus do gene quente miR-31 foi analisado por PCR DNA genômico utilizando o conjunto de primers de F 5’TAACTACATCTTCAAAAGCGGAC e R 5’TACATAGCAGGACAGGAAGTAA. O status do locus do gene CDKN2A (D9S974) e um outro lugar distante do braço curto do cromossomo 9 (D9S304) também foram analisados ​​utilizando os conjuntos de iniciadores de F 5’GAGCCTGGTCTGGATCATAA e R 5’AAGCTTACAGAACCAGACAG e F 5’GTGCACCTCTACACCCAGAC e R 5’TGTGCCCACACACATCTATC, respectivamente.

In situ

hibridação de miRNA

In situ

hibridação foi efectuada de acordo com um método descrito anteriormente [ ,,,0],19]. Resumidamente, o ácido nucleico bloqueado (LNA) -Modified sondas de detecção para miR-31 e U6 snRNA, e mexidos sonda de controlo negativo (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) foram marcadas com digoxigenina (DIG) utilizando o kit DIG Oligonucleótido Tailing (Roche, Basileia , Suíça) de acordo com as instruções do fabricante. Fixadas em formalina e secções de tecido embebidas em parafina foram acetiladas e hibridadas com sondas de detecção marcada com DIG, e foram então sondadas com fragmentos Fab anti-DIG conjugados com fosfatase alcalina (Roche). O sinal de hibridização foi visualizada usando uma solução reveladora de cor (Roche).

fluorescente

in situ

fluorescente (FISH) para o locus do gene

fixo-formaldeído e parafina-embedded secções de tecido foram utilizadas para a análise. Secções foram fervidas em tampão de citrato (0,01 M, pH 6,0) para libertar estruturas cromossómicas fechado [20]. Estas secções foram hibridizadas com uma sonda marcada com Cy3 cobrindo o miR-31 locus de (clone BAC: RP11-354P17) e uma sonda marcada com FITC para o locus de centrómero no cromossoma 9 (Vysis INC, Downer Groves, IL.). O sinal do miR-31 locus de centrómero e 9 foi contado por mais de 50 células em cada tumor e calculou-se o número de cópias do locus de miR-31 em relação à de centrómero 9.

O tratamento com 5 -azacytidine e tricostatina a

as células foram tratadas com 10 pM de 5-azacitidina (Sigma, St. Louis, MO) durante 72 horas, trocando a forma todos os dias ou com 300 ng /ml de tricostatina a ( Wako, Osaka, Japão) durante 24 horas. As células também foram tratados com 5-azacitidina durante 48 horas e, em seguida, com uma combinação de 5-azacitidina e tricostatina A durante mais 24 horas.

metilação específicas de PCR

O ADN genómico foi submetido a um tratamento de conversão bissulfato usando o kit de modificação do ADN bissulfato MethylEasy (assinaturas genéticas humanas, Macquarie Park, Austrália). metilação específicas de PCR para os dois locais de CpG no locus do gene promotor de acolhimento miR-31 (LOC554202), que foi demonstrado anteriormente [21], foi realizada de acordo com o método descrito noutro local [21].

bissulfato de sequenciação de DNA

um local GpC no locus do promotor do gene hospedeiro miR31 (LOC554202), que foi demonstrado anteriormente [21], foi amplificado por PCR utilizando ADN genómico tratados com bissulfato como um molde, de acordo com o método descrito noutro local [21]. O produto de PCR foi sub-clonado no azul vector plasmídeo pT7 (Novagen, Darmstadt, Alemanha), e foi então sujeita a um ciclo de reacção corante-terminador com o iniciador do promotor de T7 universal utilizando o estojo Big Dye Terminator Versão 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Análise estatística

as diferenças nos meios de o número de cópias relativa do miR-31 lugar entre os grupos classificados de acordo com vários parâmetros patológicos foram analisados ​​com ANOVA one-way . As diferenças nos meios de miR-31 níveis no experimento inibitória foram analisados ​​com o teste t de Student não pareado um. As análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS (SPSS para Windows versão 10.0, SPSS, Chicago, IL, EUA).

Outros

Os procedimentos experimentais utilizados para a realização de imunohistoquímica para Ki-67 e analisar oncogênico mutações nos genes KRAS e EGFR foram descritos em outro lugar [22].

resultados

miR-31 ea expressão de seus alvos conhecidos em linhas celulares de cancro do pulmão

miR- 31 expressão parecia ser forte em algumas linhas celulares de cancro, mas estava completamente ausente em outras algumas linhas de células (Fig. 1). A expressão de deixá-7i foi também examinada. Deixe-7i foi expressa em todas as linhas de células e os seus níveis são diferentes dos de miR-31 (Figura S1). Ele serviu como um controlo para avaliar a qualidade dos materiais e assegurar-se que alterações marcadas ocorreu na expressão de miR-31. Além disso, uma experiência preliminar demonstrou que o restabelecimento de miR-31 fortemente inibido o crescimento de uma linha celular de cancro (LC2AD) quase que perdeu a sua capacidade de expressar o miR-31 (Figura S2). Estes resultados nos levou a investigar mais profundamente o significado potencial da expressão alterada de miR-31 na carcinogênese de pulmão.

miR-31 níveis foram normalizados para níveis U6 snRNA. Técnicas repetições foram realizadas em triplicado. Médias e desvios-padrão (barras de erro) são mostrados. AEC, células epiteliais das vias respiratórias (células não cancerosas); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, grande de células de carcinoma de células; SCC, carcinoma de pequenas células.

Status do locus do gene miR-31 em linhas celulares de cancro de pulmão

Os status do locus miR-31 gene, CDKN2A lugar, eo adjacente loco (D9S304), foram investigadas pela análise de PCR. Entre as linhas celulares de quarenta e um examinados, seis linhas celulares (14,6%, 6/41 linhas celulares; H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, e TKB9) perdido o miR-31 hospedeiro locus do gene (Figura 2, Tabela 1. ), enquanto doze linhas (29,3%, 12/41 linhas celulares;. TKB14, H4006, A549, LC2AD, TKB4, H460, H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, TKB9) perdeu o locus CDKN2A (Fig 2, Tabela 1 ). Todos os seis linhas que perderam o locus miR-31 também perdeu o locus CDKN2A (Fig. 2, Tabela 1). O locus adjacente (D9S304) serviu como um controlo positivo para a análise de PCR (Fig. 2).

Os resultados da análise por PCR são mostrados. AEC, células epiteliais das vias respiratórias (células não cancerosas); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, grande de células de carcinoma de células; SCC, carcinoma de pequenas células.

modificação epigenética do promotor de miR-31 e sua expressão

miR-31 expressão estava ausente em todas as seis linhas celulares perder o miR -31 hospedeiro locus de gene (Fig. 2, Tabela 1). Enquanto isso, as cinco linhas de células (H441, LC2AD, Lu140, TKB15, e TKB17) que reteve o gene locus de miR-31 (Fig. 2, Tabela 1) também perderam o miR-31 de expressão ou marcadamente reduzida seu nível (Fig. 2, a tabela 1), o que indicou o envolvimento potencial de modificação epigenética na sua regulação negativa. Assim, as linhas de células que perderam a expressão de miR-31, mas reteve a sua locus do gene foram examinados para investigar os efeitos dos inibidores de metiltransferase de ADN e histona desacetilase na expressão de miR-31. De qualquer e /ou a combinação de ambos os inibidores não reprodutível restaurar a expressão de miR-31 nestas células (Fig. 3A). A análise de PCR específicos de metilação em dois locais na região promotora do gene hospedeiro miR-31 revelou que os dois locais foram metilados em todas as linhas celulares examinadas (Fig. 3B). A análise de sequenciação de ADN bissulfato no site de CpG da região promotora também revelou que era ocasionalmente metilado em todas as linhas celulares examinadas (SAEC, NHBE-T, H820, H441, LC2AD, Lu140, TKB15, e TKB17) (Fig. 3C). Os níveis de metilação parecia ser não significativamente diferente entre as células de retenção da expressão de miR-31 (SAEC, NHBE-T, e H820) e aqueles perdendo (H441, LC2AD, Lu140, TKB15, e TKB17) (Fig. 3C) . O estado de metilação de regiões promotoras dos putativos do gene hospedeiro miR-31 não foi associado com o estado de recuperação de miR-31 níveis seguintes os tratamentos com os inibidores (Fig. 3a e 3c). Assim, a metilação do DNA na região putativa examinadas aqui não podia ser atribuída à regulação negativa do miR-31.

As células tratadas com veículo de controlo (CTL), 5-azacitidina (AZA), tricostatina A (TRC), ou uma combinação de AZA e TSA (AZ /TR) foram examinados para a restauração de miR-31 de expressão utilizando RT-PCR quantitativo. Calculou-se o nível relativo de miR-31 normalizados para os de snRNA U6. Foram realizados dois experimentos independentes. repetições técnicas de análise de PCR foram realizadas em triplicado. As médias e os desvios padrão (as barras de erro são mostrados) (A). Os dois locais (S1 e S2) a partir do promotor putativo de miR-31 foram amplificados por PCR com iniciadores específicos para qualquer metilado (M) ou não metilado (UM) do ADN, utilizando sódio ADN genómico modificado com bissulfato como um molde, de acordo com o método descrito em um estudo anterior [21]. Os resultados representativos são apresentados (B). A região do promotor de miR-31 contendo locais CpG foi amplificado por PCR usando DNA genómico de sódio bissulfato-modificada como um molde, de acordo com o método descrito num estudo anterior [21]. Oito subclones de produtos de PCR foram analisados ​​para o seu estado de metilação usando sequenciação de ADN. Abertas (○) e cheia (•) círculos indicada a citosina não metilada e metilado nos locais CpG indicados, respectivamente, (C). AEC, células epiteliais das vias respiratórias (células não cancerosas); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, carcinoma de grandes células; SCC, carcinoma de células pequenas.

A expressão de miR-31 em cancros primários de pulmão

quantitativa de RT-PCR A análise revelou que alguns tecidos tumorais e não tumorais expressos miR-31 em detectável níveis (Fig. 4A). Estes níveis variaram, mas eram marcadamente elevada em alguns dos tumores examinados (Fig. 4A). Estas pareceram ser ligeiramente maior em grandes carcinomas e ligeiramente mais baixa em adenocarcinomas (Fig. 4A). Entre os adenocarcinomas examinados, a expressão de miR-31 foi inferior no carcinoma pouco diferenciado (Fig. 4B e 4C), bem como no subtipo sólido (Fig. 4D). dano tecidual grave acompanhada por reacções de regeneração foi observada nos tecidos não-tumorais que expressam o miR-31 (não mostrado).

os níveis de miR-31 foram avaliados em tumores primários de pulmão e de pulmão do tecido não tumoral correspondente. Os números de cópias de miR-31 e U6 snRNA foram medidos utilizando RT-PCR quantitativo. Técnicas repetições foram realizadas em triplicado. As médias e os desvios padrão (barras de erro) de miR-31 níveis normalizados para os de snRNA U6 são mostrados como os resultados obtidos a partir de todos os tumores (A) e as de ADC (B). diferenças significativas na média de miR-31 níveis em adenocarcinomas entre os diferentes graus histológicos (9 carcinomas bem diferenciados (WEL), 3 carcinomas moderadamente diferenciados (MOD); 8 carcinomas pouco diferenciados (POR)) e subtipos (carcinoma 8 bronquioloalveolar (BAC) ; 3 carcinoma acinar (ACN); 8 carcinoma sólido (SOL) (um carcinoma papilar (= bem diferenciar carcinoma) foi excluído de uma análise estatística) foram analisados ​​com uma ANOVA one-way As médias e desvios padrão (barras de erro) de. os graus histológicos (C) e subtipos (D) são apresentados.

In situ

análise de hibridação de miR-31 em secções de tecido confirmou que miR-31 foi expressa em células neoplásicas e também revelou que ainda variada entre células neoplásicas mesmo no mesmo tumor (Fig. 5). as células epiteliais regenerativa, células intersticiais e células inflamatórias também expressa miR-31 em vários níveis (Fig. 5).

uma sonda consistindo na sequência aleatória mexidos serviu como um controlo negativo (painéis inferiores). fotografias representativas de tumoral (deixou dois painéis) e não-tumoral de tecido (direita dois painéis), que expressa miR-31 (centro de dois painéis) ou não (laterais dois painéis), são apresentados.

status do locus do gene de acolhimento miR-31 em cancros do pulmão primários

análise FISH revelou que o miR-31 locus do gene de acolhimento foi perdido nas células neoplásicas de alguns tumores, como a contagem de sinal do miR-31 loco foi mais baixa do que a partir do centrómero do cromossoma 9 (Fig. 6A). A dosagem de gene do locus de miR-31 estimada pela razão de miR-31 /centrómeros em adenocarcinomas e carcinomas de células escamosas era ligeiramente mais baixa do que no epitélio brônquico não cancerosos (Fig. 6B). No entanto, em alguns tumores de carcinomas de células grandes do locus de miR-31 foi amplificado (Fig. 6C). A dosagem do gene foi significativamente maior nos carcinomas de células grandes do que em epitélios não-cancerosas e outros tipos histológicos (Fig. 6C, Tabela 2). Todos os tumores com uma amplificação do locus do gene, que foram examinados availably, expressa um elevado nível de transcrição do miR-31. Em contraste, entre adenocarcinomas, a dosagem do gene tendem ainda a ser menor nos tumores mais agressivos (mal tumores diferenciados ou tumores sólidos subtipo) (Tabela 2).

Os resultados representativos de tecidos tumorais e não tumorais são apresentados, e sinais vermelhos e verdes indicam o miR-31 locus de centrómero e local do cromossoma 9, respectivamente (a). A contagem de sinal a partir do locus de miR-31 normalizados para que a partir do locus de centrómero de cromossoma 9 foi determinada como a pontuação de FISH. As pontuações peixes medidos são apresentados (B). Os escores médios em epitélio brônquico não-tumoral e nos diferentes tipos histológicos de câncer de pulmão são apresentados (C). As diferenças na pontuação média foram analisados ​​com um teste ANOVA one-way. Os valores de P são indicados. BEC, células epiteliais brônquicas (células não cancerosas); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, carcinoma de grandes células.

Discussão

Um estudo inicial sobre os cânceres de mama sugeriu que miR-31 poderia ser um supressor de tumor, que inibiu a disseminação invasivo e metastático células neoplásicas [23]. Outros estudos têm apoiado esta conclusão inicial e revelou os mecanismos moleculares subjacentes potenciais como miR-31 foge à invasão e metástase [24]. MiR-31 também mostrou ser regulada negativamente em cancros gástricos e foi sugerido para funcionar como um supressor de tumores [25]. Em contraste, o miR-31 foi encontrado para ser regulada positivamente em cancros colo-rectais, e foi sugerido que promova a difusão invasivo e metastático de células neoplásicas [26], [27]. Assim, o papel potencial de miR-31 na carcinogénese podem diferir entre os vários tipos de cancros. No cancro do pulmão, a expressão do miR-31 tem sido geralmente referida como sendo superior no tecido tumoral do que no correspondente tecido não-tumoral [6] – [12]. Os resultados de análise de RT-PCR quantitativo, em que vários tumores primários de pulmão mostraram expressar fortemente o miR-31, parece ser consistente com as conclusões anteriores [6], [7], [9] – [12]. análise FISH revelou que a amplificação no hospedeiro locus do gene pode ser um dos mecanismos responsáveis ​​pela forte expressão de miR-31. Um estudo recente demonstrou valor prognóstico de miR-31, como a maior expressão de miR-31 foi associado com um pior resultado em cancros do pulmão [13], e também sugeriu o seu papel oncogênico através de

in vitro

experimentos [ ,,,0],13]. Tomados em conjunto com estes resultados, o miR-31 foi sugerido para promover a carcinogénese, especialmente de carcinomas de células grandes. Em contraste, a expressão de miR-31 foi acentuadamente reduzida ou completamente ausente em algumas linhas celulares de cancro de pulmão. Além disso, os seus níveis variaram em tumores primários de pulmão. Alguns tumores expressa miR-31 em níveis mais baixos do que o tecido não-tumoral correspondente, enquanto outros tumores não expressá-lo em tudo. Entre os adenocarcinomas examinados, a dosagem de gene foi ligeiramente inferior nos tumores mais agressivos (fracamente diferenciadas ou subtipo tumores sólidos). Estes resultados sugerem que o miR-31 pode desempenhar um papel supressivo na carcinogénese de adenocarcinomas. Assim, o miR-31 pode desempenhar um papel pleiotrópicos no desenvolvimento de cancros do pulmão de diferentes tipos histológicos. A expressão de alguns alvos conhecidos de miR-31, tais como ITGA5, MMP16, e RHOA [28], foi preliminarmente examinada em células de miR-31-transfectadas e células cancerosas de pulmão (Figura S3). No entanto, a expressão forçada de miR-31 não reduziu os níveis de mRNA de estas moléculas. Em linhas celulares de cancro do pulmão nativo, não foi observada correlação entre o nível destas moléculas e níveis de miR-31 entre os diferentes tipos histológicos (Figura S3). Alvos de miR-31 pode variar em diferentes situações, e crosstalk complexo entre os alvos podem ocultar-se em células de câncer de pulmão. Novos estudos que investigam de forma abrangente alvos a jusante são necessários para elucidar o mecanismo molecular subjacente potencial como miR-31 promove a carcinogênese de diferentes tipos histológicos de câncer de pulmão.

tecidos não-tumorais que apresentam danos severos e inflamação expressa fortemente miR-31.

In situ

análise de hibridação também confirmou a forte expressão de miR-31 na regeneração de células epiteliais não neoplásicas e células mesenquimais. Assim, o miR-31 pode ser induzida por estímulos que promovem o crescimento das células em resposta ao dano do tecido e podem controlar reacções regenerativas. A expressão alterada do miR-31, se é regulada negativamente ou regulação positiva, pode resultar numa interrupção na homeostase celular e também podem participar na transformação neoplásica.

Uma análise do estado do locus do gene demonstrou que o deleção homozigótica do locus do gene de miR-31 foi uma das causas para a perda da sua expressão em linhas celulares de cancro de pulmão. No entanto, algumas linhas de células que retiveram o gene locus de miR-31 também atenuou severamente a sua expressão. Estudos anteriores relataram que a hipermetilação do ADN ou da histona no locus do promotor do gene hospedeiro miR-31 era a causa para a regulação negativa grave de miR-31 em cancros da mama leucemia [21] ou de células T do adulto [29]. No entanto, nossos resultados do experimento usando inibidores de DNA metiltransferase e histona deacetilase não apoiar o envolvimento de modificação epigenética na atenuação da expressão de miR-31. PCR específicos de metilação e sequenciação bissulfato análises também não demonstram uma relação causal entre a hipermetilação do ADN do promotor e tal atenuação severa. Um potencial mecanismo diferente de modificação epigenética é susceptível de ser envolvido na regulação negativa da expressão de miR-31. O locus promotor putativo do gene hospedeiro miR-31 contém vários elementos CCAAT potenciadoras [30]. CCAAT elemento de ligação de proteínas (C /EBP) -β foi encontrada para induzir o miR-31 de expressão no epitélio das vias aéreas em resposta a certos estímulos externos [30]. C /EBP-α foi mostrado para ser severamente regulados negativamente em cancros do pulmão [31] – [34], e pode ser a causa para a expressão desordenada de miR-31. Uma investigação sobre o possível envolvimento da família C /EBP na atenuação de miR-31 expressão no câncer de pulmão é justificada. linhas celulares Enquanto isso, não cancerosas imortalizadas das vias aéreas epiteliais transformadas pelo antigénio T grande de SV40 (NHBE-T, HPL1D, e HPL1A), em que p53 e das vias RB-mediadas são inactivadas, foram encontrados para expressar miR-31 em níveis marcadamente menor do que as células epiteliais das vias aéreas pequenas (SAEC) e células epiteliais brônquicas NHBE (). Este antígeno viral pode, direta e indiretamente modulam a expressão de miR-31.

Em resumo, os resultados do presente estudo sugerem que uma expressão alterada de miR-31 devido a qualquer amplificação ou perda de seu locus do gene de acolhimento pode participar na carcinogénese do pulmão. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a descrever o mecanismo causador potencial subjacente à expressão alterada de miR-31 em cancros do pulmão.

Informações de Apoio

Figura S1.

Os números de cópia de deixá-7i e U6 snRNA foram medidos usando RT-PCR quantitativo. Deixe-7i níveis foram normalizados para níveis U6 snRNA. AEC, células epiteliais das vias respiratórias (células não cancerosas); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, grande de células de carcinoma de células; . SCC, carcinoma de pequenas células

doi: 10.1371 /journal.pone.0100581.s001

(TIF)

Figura S2.

Efeito biológico da restauração de miR-31 sobre uma linha de células de cancro do pulmão (LC2AD) é apresentada. O vector de pró-retrovírus pLHCX (BD Clontech) contendo fragmentos de ADN incluindo a região de codificação de miR-31 (MIMAT0000089) flanqueando uma margem de cerca de 100 pares de bases em ambas as direcções, foi obtido. Os vectores retrovirais (vector vazio (MOCK), a cadeia com sentido de miR-31 (ss) e a cadeia anti-sentido de miR-31 (AS)) foram infectadas como o mesmo método anteriormente descrito [17]. Depois de uma breve selecção com higromicina B (BD Clontech), as células sobreviventes foram colhidas e contadas, e de 2,0 × 10

4 foram re-semeadas em uma placa de 10 cm. Após 15 dias, as células foram fixadas em metanol e coradas com Giemsa (A). As médias e desvios padrão (barras de erro) das contagens de colónias de experiências em triplicado são apresentados (B). As células seleccionadas foram cultivadas e passadas várias vezes. duplicações da população acumulados são apresentados (C). As células colhidas imediatamente após o processo de selecção foram examinados quanto à expressão de miR-31 e U6 snRNA por RT-PCR quantitativo. O nível de miR-31 normalizada ao de U6 snRNA é apresentado (D)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0100581.s002

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Figura S3.

Os números de cópias de ITGA5, RHOA, MMP-16, e ARNm GAPDH foram medidos utilizando RT-PCR quantitativo. ITGA5 (A), RHOA (B) e MMP-16 (C), os níveis normalizados para níveis de GAPDH são mostrados. AEC, células epiteliais das vias respiratórias (células não cancerosas); TRAS, linha celular de cancro do pulmão LC2AD – transfectantes com base (vector vazio (MOCK), a cadeia com sentido de miR-31 (SS), e a cadeia anti-sentido de miR-31 (AS)); ADC, adenocarcinoma; SQC, carcinoma de células escamosas; LCC, grande de células de carcinoma de células; SCC, carcinoma de pequenas células

doi:. 10.1371 /journal.pone.0100581.s003

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Reconhecimentos

Agradecemos especialmente Emi HONDA e Misa otara (Kanagawa Prefectural cardiovascular e respiratória Hospital Center, Yokohama, Japão) para a sua assistência.