Abstract

composto Ginsenoside K (CK), um ginsenoside rara originária de

Panax Ginseng

, foi encontrado como possuindo actividades farmacológicas únicas especificamente como anti-cancro. No entanto, o papel do citocromo P450 (CYP) no metabolismo de CK não é clara. Neste estudo, nós analisamos os CYP para o metabolismo de CK

in vitro

usando microssomas de fígado humano (HLMs) ou CYP recombinantes humanas. Os resultados mostraram que a CK inibido as actividades enzimáticas de CYP2C9 e CYP3A4 no HLM. O

K

m

e

V

valores

máximo de CK foram 84,20 ± 21,92 mM e 0,28 ± 0,04 nmol /mg de proteína /min, respectivamente, para os HLM; 34,63 ± 10,48 | iM e 0,45 ± 0,05 nmol /nmol P450 /min, respectivamente, para CYP2C9; e 27,03 ± 5,04 uM e 0,68 ± 0,04 nmol /nmol P450 /min, respectivamente, para CYP3A4. O

IC

50

valores foram 16,00 mM e 9,83 mM, e

K

i

valores foram 14,92? M e 11,42 M para CYP2C9 e CYP3A4, respectivamente. Outras isoformas CYP humanas, incluindo CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 e CYP2C19, mostrou um efeito mínimo ou nenhum sobre o metabolismo da CK. Os resultados sugeriram que a CK era um substrato e também inibidores tanto para CYP2C9 e CYP3A4. Os pacientes que usam CK em combinação com drogas terapêuticas que são substratos do CYP2C9 e CYP3A4, por diferentes razões devem ter cuidado, embora a potência inibidora de CK é muito mais pobre do que a de inibidores específicos da enzima

Citation:. Xiao J, Chen D, Lin XX, Peng SF, Xiao MF, Huang WH, et al. (2016) Triagem de enzimas metabolizadoras de fármacos para o composto Ginsenoside K

In Vitro

: uma substância eficiente Anti-Cancer Originário de

Panax Ginseng

. PLoS ONE 11 (2): e0147183. doi: 10.1371 /journal.pone.0147183

editor: Olorunseun Ogunwobi, Hunter College of The City University of New York, United States |

Recebido: 23 de maio de 2015; Aceito: 30 de dezembro de 2015; Publicação: 04 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Xiao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciência da China (Grants 81302850, 81300204, 31400306); a China de Pós-Doutorado Science Foundation (Grants 2013M531817, 2014T70793); e de Ciência e Tecnologia planejar projetos da província de Hunan (Grant 2014RS4011)

CONFLITO DE INTERESSES:. Graças a Zhejiang Hisun Pharmaceutical Company Limited (Zhejiang, China) para fornecer o composto Ginsenoside K. A empresa farmacêutica não tem um papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Introdução

Panax Ginseng

é uma medicina complementar e alternativa ( CAM), que tem muitas atividades farmacológicas, como a manutenção da vitalidade física e aumentar a resistência ao estresse e ao envelhecimento [1].

Panax Ginseng

é amplamente utilizado em clínicas para a prevenção do câncer, disfunção erétil e funções físicas melhoradas, entre outros [2]. Os principais componentes ativos de

Panax Ginseng Quais são ginsenosides, e até à data, mais de 150 ginsenosides naturalmente derivados foram obtidos a partir de

Panax Ginseng

[3]. Os principais constituintes que compreendem mais de 80% do conteúdo do

Panax Ginseng Quais são Rb1, Rb2, Rc, Rg1 e Re. O resto são conhecidos como ginsenosides raros, que representam apenas uma pequena parcela do total de saponinas, e eles têm atividades farmacológicas únicas [4].

composto Ginsenoside K (CK), ou 20-O-p- (D-glucopiranosil) -20 (S) -protopanaxadiol (A estrutura molecular é mostrada na figura 1), é naturalmente ausente. Pertence à rara ginsenosídeo, o qual é transformado a partir de ginsenosideRb1 e Rb2 por bactérias intestinais [5]. Ginsenosides são fracamente absorvidos a partir do intestino enquanto o seu metabolito CK é absorvida. À medida que a forma final, CK que joga um papel farmacológico causou um interesse crescente. CK pode resistir a todos os tipos de células tumorais e promovem a apoptose de células, tais como células de cancro colorectal, cancro gástrico, células de células de cancro do pulmão, mieloma múltiplo e [1, 6, 7]. CK aumenta a resistência à função da imunidade para prolongar o tempo de sobrevivência do transplante no transplante cardíaco, tem uma função anti-inflamatória, resiste ao envelhecimento da pele, e protege o miocárdio [1, 8].

O único biológica atividade de CK tem atraído muita atenção, e, portanto, tem uma perspectiva ampla aplicação. O uso atual de MAC por pacientes está aumentando [9]. O uso concomitante de CAM e drogas terapêuticas pode levar a problemas de segurança graves em pacientes. CAM tem o potencial de causar interacções farmacocinéticas com drogas terapêuticas. Pode aumentar ou diminuir os níveis plasmáticos de drogas terapêuticas e resultar em toxicidades inesperadas ou reduzida eficácia [10].

interações CAM-droga mais farmacocinéticos envolvem droga metabolização do citocromo P450 (CYP) enzimas [11, 12] . Os CYP são uma grande família de enzimas metabolizadoras de drogas que desempenham um papel fundamental no metabolismo de drogas fase I. Além disso, a maior parte das substâncias endógenas e exógenas são os substratos de CYP. Os principais CYP envolvidas no metabolismo da maioria das drogas é CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, CYP2C19 e CYP3A4, que representam mais de 90% do metabolismo de substâncias endógenas e exógenas [13].

CK é um dos CAM mais utilizado para muitas doenças em clínicas. Como co-administração não pode ser evitado, como evitar interações CK-drogas se tornou uma questão principal entre os pacientes. Para fornecer conselhos racional para o uso de drogas, nós examinamos as enzimas CYP responsáveis ​​pelo metabolismo da CK no presente estudo.

Métodos

Enzimas e produtos químicos

As enzimas e produtos químicos utilidades domésticas preparado de acordo com o nosso estudo anterior com algumas modificações [14]. Reunidas microssomas de fígado humano, enzimas CYP humanos recombinantes, NADPH e foram adquiridos a partir de Cypex Ltd. (U.K.) e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Ginsenoside composto K (CK, C

36H

62o

8, MW: 622,873, assay≥99.2%, Lot: P1201-1) foi fornecido pela Zhejiang Hisun Pharmaceutical Company Limited (Zhejiang, China). Furafilina, tranilcipromina, cetoconazol, sulfafenazole, quinidina, cloridrato chlormethiazole, e cloridrato de ticlopidina foram comprados dos Institutos Nacionais para a Alimentação e Controle de Drogas (Pequim, China). Fenacetina, cumarina, midazolam, tolbutamida, S-mefenitoína, metoprolol, clorzoxazona, e os padrões para os seus metabolitos, incluindo acetaminofeno, cumarina 7-hidroxilo, midazolam 1-hidroxilo, tolbutamida 4-hidroxilo, mefenitoína 4-hidroxilo, metoprolol α-hidroxilo , clorzoxazona 6-hidroxilo, e irbesartan (padrão interno), foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Xangai, China). Todos os outros produtos químicos e solventes eram de cromatografia líquida de alta eficiência de grau (HPLC).

Aparelhagem e condições de operação

As concentrações dos substratos de CYP e seus metabolitos foram quantificados de acordo com o método descrito em nosso estudo anterior com algumas modificações [14]. Foi utilizado um sistema de módulo de separação HPLC Waters 2695 acoplado a um Quattro micro

™ API triplo quadrupolo espectrometria de massa em tandem (Waters Corp., Milford, Massachusetts, EUA) com uma fonte de ionização electrospray. As amostras foram separadas num HyPURITY C

18 coluna (150 mm x 2,1 milímetros, 5 um, Thermo, EUA). As fases móveis consistiu de 20 mM de formato de amónio e acetonitrilo numa razão de 60:40. Alíquotas de 20 ul foram injectados a uma taxa de fluxo da fase móvel de 0,3 ml /min. monitorização de reacção múltipla foi realizada no modo positivo, excepto para CK que foi realizado no modo negativo (ião progenitor m /z 621,4 para ião filha m /z 160,8). As outras transições foram os mesmos que os divulgados no estudo anterior [14]. Os espectros de massa dos metabolitos formados nas incubações foram idênticos aos dos correspondentes padrões autênticos.

condições de incubação Geral

O método foi realizado de acordo com o nosso estudo anterior, com algumas modificações [14] . As reações sonda específica para isoforma CYP utilizados foram fenacetina O-deetilação (para CYP1A2), cumarina 7-hidroxilação (para CYP2A6), tolbutamida 4-hidroxilação (por CYP2C9), metoprolol α-hidroxilação (por CYP2D6), clorzoxazona 6-hidroxilação ( para CYP2E1), S-mefenito�a 4-hidroxilação (para CYP2C19) e midazolam 1-hidroxilação (para CYP3A4). O estudo da cinética da CK foi realizado com HLM. Um ml de uma mistura 0,2 de incubação que consistia de CK (como um substrato), as HLM (0,5 mg /mL) ou CYP isoformas (10 pmol), e tampão de fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,4) foi pré-aquecida durante 5 min a 37 ° C. A reacção foi iniciada pela adição de 1 mg /mL de nucleótidos triphosphopyridine (NADPH). Todos os reagentes foram dissolvidos em metanol, e a concentração final do solvente em todas as incubações (incluindo os controlos) foi de 1%. As incubações finais foram realizadas num banho de água com agitação (37 ° C) durante 30 min. As reacções foram paradas por adição de 0,2 mL de acetonitrilo arrefecido com gelo, que contém o irbesartan (114,9 ng /ml) como padrão interno. As amostras foram agitadas durante 5 min. Após centrifugação (12000 x g durante 10 minutos), os sobrenadantes foram transferidos, e aliquotas de 20 ul foram injectados no sistema de HPLC-MS /MS para análise.

A análise cinética da CK

os parâmetros cinéticos para o metabolismo de CK foram determinados por incubação de concentrações crescentes de CK (10-100 uM) a 37 ° C com as HLM NADPH e sob as condições de incubação, tal como descrito em detalhe previamente [14]. A equação de velocidade de reacção CK (

V

) nos HLM ou isoformas CYP é expresso como

V = (C

0

C

t

) /Tablet T

/C

p

, onde

C

0 Comprar e

C

t Quais são as concentrações iniciais e finais de CK na solução de incubação, respectivamente, T é o tempo de incubação (min), e

Cp

é a concentração de proteína (mg /mL ou nmol). Todos os valores foram expressos como a média ± desvio padrão (SD). A taxa de depuração intrínseca média (

CL

int

) para o

in vitro

incubação foi estimada utilizando

V

max

/K

m

.

isoformas CYP específicos selecionados para o metabolismo CK

à tela a isoforma CYP específico responsável pelo metabolismo CK, determinou-se o efeito inibidor de inibidores específicos sobre o metabolismo de CK nas HLM como descrito em detalhe previamente [14]. Inibidores incluindo furafilina (para CYP1A2), tranilcipromina (para CYP2A6), sulfafenazole (por CYP2C9), quinidina (para CYP2D6), chlormethiazole (para CYP2E1), ticlopidina (para CYP2C19), e cetoconazol (para CYP3A4) foram incubadas separadamente com CK ( 50 uM), as HLM, NADPH e sob as mesmas condições de incubação como mencionado above.The concentrações dos inibidores foram utilizados, aproximadamente, pelo respectivo

IC

50

valores de acordo com a anterior relatórios [15-18]. Os efeitos inibitórios dos inibidores específicos acima sobre a taxa de depuração metabólica da CK foram avaliados separadamente para rastrear as isoformas CYP responsáveis ​​pelo metabolismo CK. A actividade relativa das isoformas CYP foi calculada dividindo a área do pico de CK quando incubadas com o inibidor da pela de CK a partir dos controlos negativos.

Os estudos de inibição em

IC

50

determinação

CK (10-100 mM) e um substrato específico da isoforma única CYP (com uma concentração semelhante ao seu correspondente

K

m

valor) foram utilizados para determinar o efeito inibidor de isoformas de CK no CYP específicos tal como descrito em detalhe previamente [14]. Substratos incluindo fenacetina, cumarina, tolbutamida, metoprolol, clorzoxazona, S-mefenitoína, e midazolam foram utilizados a concentrações de 10, 5, 100, 7,5, 40, 100, e 5 uM, respectivamente. Todas as condições de incubação foram as mesmas, como mencionado acima. Os efeitos inibitórios sobre as isoformas CYP foram investigados individualmente por incubação das HLM na ausência ou na presença de CK. A solução de incubação com o solvente que foi utilizado para dissolver CK foi considerado como o controlo negativo, e as soluções que contêm os inibidores específicos mencionados acima, foram considerados os controlos positivos.

Determinação de

K

i

IC

50

experimentos determinação, CK CYP2C9 marcadamente inibida e CYP3A4, enquanto que o seu efeito sobre CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 e CYP2C19 foi mínima. Portanto, gráficos de Dixon para a inibição de CYP3A4, CYP2C9 e foram determinados por incubação da sonda de substrato em várias concentrações, com ou sem o inibidor de teste com os co-factores e HLM. Os dados de inibição obtidos a partir de experiências piloto foram utilizadas como um guia para gerar as concentrações adequadas de inibidor de substrato sonda e teste para a determinação da

K

i

valores para cada uma das isoformas de CYP . As concentrações de substrato sonda específica para isoformas utilizados foram 25-200 mM tolbutamida para CYP2C9 e 5-50 midazolam M para CYP3A4. As concentrações de CK utilizados foram 10-100 mM.

Determinação da

K

i

‘

de acordo com Cornish-Bowden

et al

. [19], uma trama Dixon é limitado pelo fato de que não faz distinção inequívoca entre inibidores competitivos e mista e, para os inibidores mistos ou não competitivos, não prevê qualquer medida de

K

i ‘

, a constante de dissociação do complexo EIS. Portanto, nós utilizamos S /V versus [I] parcelas para determinar o

K

i ‘

valores para a inibição da CYP2C9 e CYP3A4. Quando

K

i

K

i

‘, o cruzamento foi acima do eixo [I] na lote de S /V contra o [I] e abaixo dela na trama Dixon; o oposto era verdade, se

K

i

K

i

‘

. No caso especial em que

K

i

=

Ki ‘(inibição não-competitiva simples), os cruzamentos ocorreram no eixo [I] em ambos os parcelas. Os casos assintótica de inibição competitiva e não competitiva pode ser gerado através da inserção das condições

K

i ‘

para ∞ para inibição competitiva, ou

K

i

para ∞ para a inibição não competitiva [19].

Cálculo das cinética enzimática e método estatístico

Como descrito em detalhe anteriormente [14], para determinar as principais enzimas responsável pelo metabolismo CK em HLM, a taxa de depuração metabólica da solução de incubação sem qualquer inibidor específico para CK foi considerada como 100%. Os efeitos dos inibidores específicos sobre a taxa de depuração metabólica da CK foram avaliadas com o programa SPSS análise unidireccional da variância (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). P 0,05 foi considerado significativo em todos os casos. Os parâmetros cinéticos aparentes de CK (

K

m

e

V

max

) foram determinados através do ajuste da Michaelis Menten, utilizando o software GraphPad Prism Demonstração cinética enzimática 5 (GraphPad Co. Ltd., San Diego, CA, EUA). A equação é expressa como

V = V

max

[S] /(K

m

+ [S])

, onde

K

m

é a concentração de substrato à qual a velocidade de reacção é de 50% do

V

max

. Para determinar a inibição das isoformas CYP, a actividade de cada uma das isoformas de CYP foi calculado utilizando a taxa de depuração metabólica do seu substrato de sonda correspondente. A taxa de depuração metabólica do substrato de sonda foi considerado 100% quando nenhum inibidor específico e CK foram adicionados ao ensaio de incubação. O

IC

50

s

foram determinadas através da análise da representação gráfica do logaritmo da concentração de inibidor versus a percentagem de actividade remanescente após a inibição usando o software SPSS para Windows (versão 11.5, SPSS, Chicago, IL). Para calcular o

K

i

valores, os dados de inibição foram ajustados a diferentes modelos de inibição enzimática (competitivos, não competitivos) por análise de regressão não linear dos mínimos quadrados utilizando o GraphPad Prism 5 software (GraphPad Co. Ltd),

K

i

valores foram calculados com o uso de regressão não linear de acordo com a equação

v =

(

V

max

S

)/(

K

m

(1+

I/K

i

)+

S

) de inibição competitiva e equação

v =

(

V

max

S

)/(

K

m

+

S

)(1+

I/K

i

) para a inibição não competitiva, onde

I

é composto concentração,

K

i

é a constante de inibição,

S

é a concentração de substrato, e

K

m

é a concentração de substrato na metade da velocidade máxima (

V

max) da reação [20].

K

i

‘valores

foram calculados utilizando a trama secundária de encostas da S /V versus [I] [19].

Resultados

a análise cinética da CK

Figura 2A, 2B e 2C mostram o metabolismo de CK após incubação com o HLM, CYP2C9, e CYP3A4. As parcelas cinéticos indicaram que o

K

m

e

V

valores

max foram 84,20 ± 21,92 mM e 0,28 ± 0,04 nmol /mg proteína /min para o HLM, 34,63 ± 10,48 | iM e 0,45 ± 0,05 nmol /nmol P450 /min para CYP2C9, 27,03 ± 5,04 uM e 0,68 ± 0,04 nmol /nmol P450 /min para a CYP3A4, respectivamente. O

em vitroCL

int

valores de CK na HLM, CYP2C9 e CYP3A4 foram 0,0033 ml /mg de proteína

-1 · min

-1, 0,0130 mL /nmol P450

-1 · min

-1 e 0,0252 mL /nmol P450

-1 · min

-1, respectivamente

Nota:. As condições de incubação são descrito na secção de materiais e métodos. A curva foi automaticamente montado por meio de regressão não-linear ea equação de Michaelis-Menten. Os dados foram obtidos em triplicado.

isoformas CYP específicos para o metabolismo de CK

Os efeitos inibidores dos inibidores específicos CYP sobre a taxa de depuração metabólica da CK nas HLM estão apresentados Fig 3. As concentrações de furafilina, tranilcipromina, sulfafenazole, quinidina, ticlopidina, e cetoconazol foram de 1 uM, excepto para clormetiazole a 5 uM. As concentrações foram selecionados com base relatado anteriormente

IC

50

ou

K

i

valores para as isoformas CYP para assegurar a selectividade de inibição adequada e a potência inibitória máxima. Na presença de sulfafenazole e cetoconazol, a taxa de eliminação metabólica (MCR) de CK diminuiu para 73,5 ± 20,9% e 74,6 ± 28,1% do que a do controlo, respectivamente (Figura 3). No entanto, outros inibidores não tinham efeitos inibidores evidentes sobre o metabolismo de CK. As enzimas foram rastreados adicionalmente confirmada por CYP recombinantes humanos utilizando os inibidores específicos. O MCRs de CK diminuiu para 22,0% do que a do controle para CYP2C9 e a 13,2% de que o controlo para a CYP3A4 (Figura 4). Os resultados indicaram que CYP2C9 e CYP3A4 foram as principais enzimas responsáveis ​​pelo metabolismo da CK

in vitro

Nota:. Furafilina, tranilcipromina, sulfafenazole, quinidina, chlormethiazole, foram utilizados ticlopidina, e cetoconazol como os inibidores específicos para CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1 e CYP2C19, respectivamente. As condições de incubação são descritos na secção de materiais e métodos. Cada ponto de dados representa a média das determinações triplas e as barras de erro. Na presença de sulfafenazole (1 uM) e cetoconazol (1 uM), a taxa de depuração metabólica da CK diminuiu para 73,5% e 74,6% do que a do controlo, respectivamente, ao passo que os outros inibidores não teve nenhum efeito inibitório significativo sobre o metabolismo do CK

. Nota: cerca de 50 um de CK foi incubada com os recombinantes de CYP e co-factores, na ausência (controlo) ou na presença dos inibidores por sulfafenazole (1 uM) e cetoconazol (1 uM), respectivamente. Cada ponto representa a média das incubações em triplicado. O MCRs de CK foram diminuiu significativamente em comparação com os do controlo para CYP3A4 e CYP2C9.

Estimativa de

IC

50

s

os efeitos inibidores de várias concentrações de CK (10-100 uM) sobre a actividade de cada uma das isoformas de CYP determinado pelo metabolismo de uma única concentração de sonda específica para isoforma foram testados com os HLM (ou expressa CYP quando necessário). CK mostrou a inibição potente de CYP2C9 (tolbutamida 4-hidroxilação) e CYP3A4 (midazolam 1-hidroxilação) (Fig 5), com a

IC

50s

de 16,00 mM e 9,83 mM , respectivamente. O efeito inibitório de CK na actividade de CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 e CYP2C19 foi insignificante

. Nota: As condições de incubação são descritos na secção de materiais e métodos. Cada ponto de dados representa a média das determinações triplas e barras de erro.

Estimativa de

K

i

valores

Para CYP2C9 , o

K

i

valores foram determinados utilizando tolbutamida como substrato sonda. O

V

max

e

K

valores

m estimada usando um modelo de regressão linear para a inibição da enzima competitiva da CYP2C9 tolbutamida catalisada 4-hidroxilação nos HLM, as parcelas representativas Lineweaver-Burk (Fig 6) e o enredo secundário da atividade CYP2C9 usando as inclinações das parcelas Lineweaver-Burk primárias contra as concentrações de CK mostram que

K

i

de CK foram 14,92 m (Fig 7) [20]. Os lotes representativos de Dixon o efeito de CK no tolbutamida formação de 4-hidroxilação e S /V versus [I] lotes (Fig 6) sugeriu que os dados de inibição se ajustar bem a um tipo misto de inibição [19]. Para CYP3A4, o

K

i

valores foram determinados utilizando midazolam como substrato sonda. O

V

max

e

K

valores

m estimada usando um modelo de regressão linear para a inibição da enzima competitivo da CYP3A4 midazolam catalisada por 1-hidroxilação no HLM (Fig 8). As parcelas representativas Lineweaver-Burk (Fig 8) e o enredo secundário da atividade CYP2C9 usando as inclinações das parcelas Lineweaver-Burk primárias contra as concentrações de CK mostram que

K

i

de CKvalues ​​foram 11,42 m (Fig 9) [20]. Os lotes representativos de Dixon o efeito sobre a formação de CK midazolam 1-hidroxilação e S /V versus [I] lotes (Fig 8) mostraram que os dados de inibição se ajustar bem a uma inibição não competitiva [19].

A os pontos de dados são os valores médios das incubações em triplicado. . TB, tolbutamida

Nota: A análise de regressão não-linear da tolbutamida 4-hidroxilação função da concentração do substrato foi realizada para obter o

K

i

valores. Cada ponto representa a média de determinações em triplicado

. Nota: A inibição da actividade do CYP3A4 é melhor descrito como uma inibição não competitiva por diferentes concentrações de CK (10-100 uM) em incubações HLM (0,5 mg · mL

-1 proteína). Os pontos de dados são os valores médios das incubações em triplicado. . MDZ, midazolam

Nota: A análise de regressão não-linear da CK função da concentração do substrato foi realizada para obter o

K

i

valores. Cada ponto representa a média de determinações em triplicado.

Discussão

Atualmente, o uso concomitante de CAM e drogas terapêuticas são populares. CAM tem o potencial de causar interações farmacocinéticas e dinâmicas com drogas terapêuticas. Por conseguinte, os níveis de plasma diminuído ou aumentado de estas drogas poderia resultar em um efeito terapêutico menor ou um maior risco de toxicidade [9, 10]. Especialmente para drogas anti-câncer, que têm janelas terapêuticas estreitas, interacções farmacocinéticas poderia facilmente levar a efeitos clinicamente relevantes [9]. CK é uma CAM que tem uma aplicação prospectiva para o tratamento de câncer [5-7]. Portanto, a triagem das enzimas que metabolizam drogas de CK pode fornecer informações úteis para evitar interações de CK drogas.

A superfamília CYP compreende importante fase Ι enzimas que metabolizam drogas que oxidam mais de 90% das actuais drogas terapêuticas. Mais de 90% da oxidação do fármaco, humana pode ser atribuída a CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1, CYP2D6, e CYP3A4 [12]. Medicamentos concorrentes com a mesma enzima que metaboliza pode levar a interações de droga-droga, resultando em eficácia alterada ou toxicidade em indivíduos [13].

No presente estudo, os nossos dados sugerem que CYP2C9 e CYP3A4 foram as principais enzimas envolvidas no metabolismo de CK

in vitro

, não os substratos de CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 e CYP2C19. Além disso, nosso estudo mostrou que CYP2C9 e CYP3A4 foram sensíveis à inibição por CK, e seus

IC

50

valueswere 16,00 mM e 9,83 mM, respectivamente. CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 e CYP2C19 dificilmente eram sensíveis à inibição da CK (

IC

50s

foram todos superiores a 100 M). Estes achados são parcialmente suportados pelo estudo de Hao et al. (2008), que ginsenosides, Rh2, CK, e todos os sapogenins exibiu inibição CYP3A4 moderada em baculosomes. De acordo com Kong

et al

[21], a potência de um composto podem ser classificados de acordo com a sua

IC

50

valores, tão potente, se

IC

50

≤ 20 ng /mL ou ≤10? M; moderada, se

IC

50

20-100 mg /mL ou 10-50 um; ou fraco, se

IC

50

≥100 ng /mL ou ≥ 50? M. CK é classificado como um inibidor potente de CYP3A4, um inibidor moderado de CYP2C9, e um fraco inibidor do CYP os outros cinco testadas neste estudo.

CYP2C9 é uma das enzimas CYP mais abundante (cerca de 20% de o conteúdo total de CYP hepática) [22]. É metaboliza um número de drogas clínicas importantes, incluindo anti-câncer, antibióticos, anti-diabético, anti-epilépticos, anti-hipertensiva, anti-coagulante, e fármacos anti-hiperlipidémicos [23]. De especial interesse é o metabolismo mediado pela CYP2C9 de fármacos com um índice terapêutico estreito, como a varfarina e fenitoína [24]. Por isso, competir com o metabolismo CYP2C9 pode conduzir a toxicidade grave. CYP3A4 é a principal citocromo P450 no fígado humano que tem substratos gerais [25]. CYP3A4 metaboliza não apenas xenobióticos, incluindo a maioria dos fármacos e substâncias cancerígenas, mas também muitos compostos endógenos, tais como colesterol, ácidos biliares, ácidos gordos, prostaglandinas, leucotrienos, retinóides, e aminas biogénicas, e interacções CAM-droga, assim, mais farmacocinéticos envolvem CYP3A4 [26]. O presente estudo mostra que a CK é um inibidor de ambos CYP2C9 e CYP3A4. Portanto, pacientes em uso de CK em combinação com drogas terapêuticas convencionais que são substratos do CYP2C9 e CYP3A4 por razões diferentes deve ser cuidadoso.

No entanto, em contraste com os inibidores específicos da CYP2C9, o

IC

50

e K

i

valores de CK foram 11-53 vezes e 49 vezes maior do que os dos sulfafenazole em HLM, respectivamente [15, 16]. Para CYP3A4, o

IC

50

e K

i

valores de CK foram 41-123 vezes e 761 vezes de mais elevada do que aqueles do cetoconazole em HLM, respectivamente [17]. A inibição potente de CK era mais pobre do que a de inibidores específicos do enzima. Presumivelmente, a potência inibidora de CK é demasiado baixo para causar CYP2C9 clínico significativo e inibição CYP3A4. Note-se que no nosso outro estudo realizado em voluntários saudáveis, 10 voluntários saudáveis ​​do sexo masculino receberam administrações de 800 mg comprimidos pura CK (100 mg /comprimido, fornecidos pela Zhejiang Hisun Pharmaceutical Company Limited, China) engolidos por 150 mL de água, depois da série venosa amostras de sangue de 5 ml foram recolhidas em tubos contendo EDTA a 0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72 e 96h. As amostras de plasma foram analisadas por HPLC-MS /MS, o pico de concentração de plasma (C

max) e o tempo para atingir a concentração máxima no plasma (T

max) foram obtidos directamente a partir dos dados observados de concentração-tempo. A área sob a curva de concentração plasmática-tempo (AUC) desde o tempo zero a última concentração medida (AUC

(0-t)) foi calculada de acordo com a regra do trapézio linear, a estimativa de depuração oral (CL /F) foi calculado como CL /F = Dose /AUC

(0-t) [27]. Os resultados mostraram a C

máximo de CK foram 4,07 mM (95% CI: 2.89, 5.24). O C

máximo de CK de alguns voluntários foram encontrados para estar perto de 5 mM por meio de um dia de suplementação de 800 mg, que é perto do

IC

50

e

Ki

valores de CK para CYP2C9 e CYP3A4 (Fig 10). Assim, nós ainda alertam contra a interação CK-droga, apesar de sua suavidade.

Inset retrata os mesmos dados em uma escala semi-logarítmica, cada valor é a média ± SD.

Agradecimentos

Graças ao Zhejiang Hisun Pharmaceutical Company Limited (Zhejiang, China) para fornecer o composto Ginsenoside K. Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciência da China (Grants 81302850, 81300204, 31400306); a China de Pós-Doutorado Science Foundation (Grants 2013M531817, 2014T70793); e de Ciência e Tecnologia planejar projetos da província de Hunan (Grant 2014RS4011). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.