Abstract

Septinas são uma família de proteínas do citoesqueleto de ligação ao GTP expressos em muitos tumores sólidos. Septin 9 (

SEPT9

), em particular, foi encontrado superexpresso em diversos carcinomas. Aqui, nós estudamos a expressão de SEPT9 isoforma 1 proteína (SEPT9_i1) em amostras de câncer de próstata humanas. Nós utilizamos coloração imuno-histoquímica para estudar a expressão da proteína SEPT9_i1. nível de coloração foi analisada em associação com características clínicas e com o grau de Gleason patológica e pontuação. Cinquenta amostras humanas de câncer de próstata (42 tumores primários e 8 lesões metastáticas) foram coradas pelo anticorpo SEPT9_i1 e analisados. SEPT9_i1 proteína foi expressa em células de cancro da próstata, mas ausente em células epiteliais normais. A intensidade da coloração foi correlacionada proporcionalmente ao pré-tratamento de antígeno (PSA) níveis sanguíneos específicos da próstata e da escala de Gleason (

P Art 0,05). SEPT9_i1 foi altamente expressa em todas as lesões metastáticas. A assocation significativa entre a expressão SEPT9_i1 e alta pontuação de Gleason em análise de regressão linear múltipla foi encontrado. Concluímos que SEPT9_i1 é expresso em tumores da próstata de alto grau sugerindo que tem um papel significativo na tumorigénese da próstata e que poderia servir como um marcador molecular para a progressão do tumor de próstata

citação:. Gilad R, K Meir, Stein I, L alemão, Pikarsky E, Mabjeesh NJ (2015) High SEPT9_i1 Expressão da proteína é associada com cânceres de Alto Grau de próstata. PLoS ONE 10 (4): e0124251. doi: 10.1371 /journal.pone.0124251

Editor do Academic: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 07 de novembro de 2014; Aceito: 11 de março de 2015; Publicação: 21 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Gilad et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Fundação de Investigação médica (AMRF). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o segundo câncer de pulmão na incidência mundial e é o segundo câncer mais comum, e uma das principais causas de mortes por câncer entre os homens ocidentais [1]. Os principais fatores de risco para câncer de próstata são a idade e história familiar. O câncer de próstata se torna mais comum com o avançar da idade homens afetando com 50 anos ou mais [2]. adenocarcinoma de próstata metástase principalmente para os ossos e, menos comumente para os gânglios linfáticos, e pode localmente antecedência para invadir órgãos vizinhos. Os tratamentos atuais incluem terapia hormonal, imunoterapia e quimioterapia, ainda não existe um tratamento curativo para câncer metastático de próstata [3, 4]. Por conseguinte, novas estratégias para o tratamento de cancro da próstata e a identificação e caracterização de novos alvos moleculares, como a interleucina-6 são essenciais [5].

Septinas são uma família de proteínas formadoras de ligação a GTP e filamentos, em primeiro lugar descrito em

Saccharomyces cerevisiae

em uma tela de genes que regulam o processo de brotamento [6]. Desde então, septinas foram identificados em muitos outros eucariotas, desde os fungos aos seres humanos [7-9] com uma notável ausência de plantas [10]. Muitos isoformas Septin são anormalmente expresso em carcinomas [11], e os níveis alterados de expressão septina fortemente correlacionada com fenótipos tumorigênicos como o aumento do crescimento celular, motilidade, invasão e resistência a reagentes de desregulação microtúbulos [12, 13].

tinham previamente identificado SEPT9_i1, um produto de transcrição que codifica SEPT9_v1 isoforma 1 com o maior extensão N-terminal, como um regulador positivo na via hipóxico [14]. SEPT9_i1 interage com o factor 1α indutível por hipoxia (HIF-1α), a subunidade regulada de oxigénio de HIF-1, que é um regulador chave da via de resposta hipóxica [15]. A interacção é específica para a HIF-1α, mas não a HIF-2α, e que aumenta a estabilidade da proteína HIF-1α, bem como o HIF-1 actividade de transcrição, o que leva à proliferação aumentada, crescimento tumoral e angiogénese. HIF-1 é um factor de transcrição que regula as respostas celulares para adaptação e hipóxia condução transcrição de muitos genes que são importantes para a adaptação e a sobrevivência em condições de hipoxia [14]. Entre estes genes são enzimas glicolíticas, os transportadores de glicose Glut-1 e Glut-3, endotelina-1, factor de crescimento endotelial vascular, anidrase carbónica IX, eritropoietina e [16]. As análises de imuno-histoquímica revelaram que o HIF-1α é sobre-expresso em muitos cancros humanos [17]. Além disso, o aumento da actividade de HIF-1 é muitas vezes associada com o aumento da agressividade do tumor, resistência à terapia, e mortalidade [18].

Os nossos estudos anteriores em várias linhas de células de próstata e xenoenxertos mostrou que o ARNm SEPT9_v1 é altamente expressa na próstata humana amostras de cancro, em comparação com o tecido normal da próstata [15]. No presente estudo, determinou-se a expressão da proteína SEPT9_i1 em tecidos de câncer de próstata humanas primárias utilizando imuno-histoquímica e correlacionados a sua expressão com as características clínico-patológicas.

Materiais e Métodos

As amostras de tecido

o conselho de revisão institucional do Centro Médico da Universidade hebraica-Hadassah aprovou este estudo (IRB protocolo 0500-12-HMO). material de arquivo antes do ano 2000 foi aprovado para uso pelo conselho de revisão institucional do Centro Médico da Universidade Hebraica-Hadassah, com uma renúncia de consentimento livre e esclarecido, de acordo com o Estado de Direito Israel da informação genética, 2002. Todos os espécimes de arquivo usado neste estudo foram obtidos a partir da biorrepositório institucional no Hadassah Medical Center. Todas as amostras do estudo foram antes de 2000 e todos foram de-identificados. Este foi um estudo retrospectivo em uma série de 50 amostras de câncer de próstata embebidos em parafina: 38 de prostatectomia radical, 6 de cistoprostatectomia radical e 6 de ressecção transuretral da próstata (TUR-P). Desta coleção, oito espécimes foram excluídos do estudo devido a problemas técnicos no processamento de tecidos deixando 42 tumores primários em diferentes fases de avaliação final (Tabela 1). Oito lesões metastáticas adicionais a partir de 8 pacientes diferentes, da medula óssea (3), gânglios linfáticos (2) e do osso (3) foram analisados ​​separadamente. Uma amostra de cada paciente foi analisado e nenhum dos pacientes recebeu terapia neoadjuvante.

A imuno-histoquímica

Um anticorpo policlonal de coelho dirigido para o terminal N de SEPT9_i1 foi produzido anteriormente [15] e caracterizado ainda (Fig 1A e 1B). coloração imuno-histoquímica foi realizada utilizando o mesmo protocolo para todos os tecidos. Resumidamente, 4 uM secções embebidas em parafina fixadas com formalina foram desparafinizadas, reidratadas e recuperação de antigénio foi realizada em 25 mM de tampão de citrato a pH 6 por meio de aquecimento a 125 ° C durante 3 min em câmara decloaking (Biocare Medical). As secções foram incubadas com anticorpo anti-SEPT9_i1 a 1:. 2000 diluição durante a noite a 4 ° C

células de rim embrionário humano HEK-293T foram transitoriamente transfectadas com Flag-SEPT9_i1 construção ou vector vazio (EV). (A) Os extractos celulares totais foram preparados e analisados ​​por 4-20% de SDS-PAGE e imunotransferência (IB) com anticorpos para marcar (1: 2000), SEPT9_i1 (1: 3000), o soro pré-imune (1: 3000) ou anticorpo SEPT9_i1 (1: 3000) pré-incubadas com 10 uM do péptido imunogénio, durante 4 horas. (B) Os mesmos extractos celulares foram sujeitos a imunoprecipitação (IP) utilizando anticorpo anti-Flag e as immuneprecipitates foram submetidos a 4-15% SDS-PAGE e, em seguida, coradas imunologicamente com anticorpos anti-Flag ou anti-SEPT9_i1. coloração (C) Representante SEPT9_i1 em amostras de câncer de próstata humanas. Pontuação 0: sem coloração SEPT9_i1, 1: baixo SEPT9_i1 coloração 2: coloração meio SEPT9_i1 e 3: coloração alta SEPT9_i1. Ampliação x200, barra de escala 50? m.

O anticorpo anti-coelho conjugado com HRP (Vector Labs) foi utilizado para detectar o anticorpo primário. As lâminas foram desenvolvidos com diaminobenzidina (DAB) e contrastadas com hematoxilina.

A avaliação quantitativa da imunocoloração e marcando

Todas as lâminas foram revisadas por dois investigadores independentes (RG e europeias) que foram cegados a todos clínico e dados patológicos. A intensidade da coloração foi pontuada como 0 (nenhuma expressão), 1 (fraca), 2 (moderado) e 3 (forte). Também foi realizada análise de imagem computadorizada utilizando um sistema automatizado de microscópio de varredura e análise de imagem Ariol-SL50 (Imagiologia Aplicada) para avaliar a intensidade da coloração espécime, essencialmente como descrito [19]. As lâminas foram digitalizadas e todas as áreas tumorais foram marcados. A partir de cada tumor 10 campos separados, seleccionados aleatoriamente, foram analisados ​​e normalizados de acordo com os fabricantes de ajuste (módulo Hersight). Os resultados da análise são apresentados como a intensidade média normalizada, tal como calculada pelo software Ariol-SL50.

transfecção transiente, a extracção de proteína, ensaios de imunoprecipitação, imunotransferência e análise

de rim embrionário humano (HEK 293T células) foram semeadas a 70% de confluência em placas de 6 cm e foram transfectadas com 3 ug de um plasmídeo que expressa a proteína Flag-SEPT9_i1 ou vector vazio (EV), utilizando o reagente de transfecção GenePorter (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA) como previamente descrito [15]. Os extractos celulares totais foram preparados e as concentrações de proteína foram determinadas utilizando um kit de ensaio de proteína do ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL) como previamente descrito [15]. A imunoprecipitação foi realizada utilizando gel de EZView vermelho Afinidade anti-FLAG (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), e seguindo as instruções do fabricante. As proteínas foram então analisadas por SDS-PAGE e imunotransferência com anticorpos, tal como apresentadas nas Figs. basicamente, como previamente descrito [15]. Os anticorpos primários foram anticorpo policlonal de coelho para SEPT9_i1, que foi produzido previamente [15] e a sua correspondente soro pré-imune ou com Flag (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). anticorpo secundário foi peroxidase conjugado de cabra anti-rato ou coelho (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).

Análise estatística

As estatísticas descritivas da amostra do estudo foram usados ​​para resumir as características dos participantes. análises de correlação de bivariada de Spearman foram utilizados para avaliar a relação entre “características dos pacientes” e significam. Em uma análise de regressão linear múltipla, o resultado foi média intensidade de coloração SEPT9_i1. As variáveis ​​independentes incluíram idade e escore de Gleason. β e SE Ajustado foram computados. O melhor modelo foi determinado considerando ajustada R

2. Todos os testes foram bicaudais e significância estatística foi definida como

P

valor 0,05. As análises foram realizadas com o PASW Statistics 17.0 para Windows.

Resultados

As principais características dos participantes cujas amostras foram utilizadas no estudo estão descritos na Tabela 1. A idade média foi de 65 anos, com mediana PSA de 5,9 ng /ml ea maioria teve escore de Gleason ≥ 7. coradas amostras de todos os doentes usando um anticorpo específico para SEPT9_i1 [15]. O primeiro caracteriza a especificidade de anticorpo SEPT9_i1. constructo SEPT9_i1 marcado com FLAG foi expresso transitoriamente em células HEK-293T e submetida a imunotransf erência com anticorpos contra a bandeira, SEPT9_i1 SEPT9_i1 e na presença do péptido imunogénio [15], bem como com o soro pré-imune (Fig 1A). Bandeira e anticorpos SEPT9_i1 feito reagir com uma banda de 70 kDa correspondente à proteína Flag-SEPT9_i1 enquanto que o soro pré-imune não mostrou nenhuma reactividade (Figura 1A). Além disso, a imunorreactividade de SEPT9_i1antibody foi quase completamente abolida quando o péptido imunogénio foi adicionado (Fig 1A). Além disso, as espécies imunoprecipitada por anticorpos da bandeira, também foi reconhecido por anticorpos anti-SEPT9_i1antibodies (Fig 1B). Estes resultados estão de acordo ainda mais a especificidade do anti-SEPT9_i1antibodies produzido.

na próstata, não neoplásico observou coloração citoplasmática SEPT9_i1 proeminente na maioria das células basais, enquanto as células luminais foram negativos (Fig 1C). As células estromais de coloração em ambas as regiões neoplásicas e não neoplásicas foi variável. As células tumorais mostraram intensidade de coloração variável, que tendia a ser citoplasmática No entanto, em alguns casos era nuclear. A intensidade da coloração de células de tumor era em alguns casos variável. Nestes casos, o marcador foi atribuído com base na intensidade de coloração mais abundante. Cada amostra foi então pontuadas de 0 a 3 para o nível de SEPT9_i1 (Fig 1C) expressão. Nós então correlacionados SEPT9_i1 intensidade de coloração com características clínicas e encontraram correlação forte e significativa entre os níveis de expressão SEPT9_i1 e pontuação de Gleason (

P

= 0,01, Tabela 2). Na análise de regressão linear múltipla para a associação entre as características dos pacientes e dizer SEPT9_i1 intensidade de coloração, pontuação de Gleason foi o único fator preditivo independente (RR 2,0, IC 95% 0,15-3,85,

P

= 0,035). Nós estratificada intensidade de coloração SEPT9_i1 quer através da utilização de pontuação visual (Fig 2A) ou por análise de imagem computadorizada com um sistema de análise de imagem automatizado (Ariol-SL50) (Fig 2B) de acordo com a pontuação de Gleason. Houve significativamente maior nível de coloração SEPT9_i1 como a pontuação de Gleason foi maior (Fig 2)

Média SEPT9_i1 intensidade de coloração ± SE de cada grupo pontuação de Gleason (marcar. 5: 3 pacientes, marcar 6: 8 pacientes, pontuação 7: 19 pacientes, marcar 8: 3 pacientes, marcar 9: 6 pacientes e marcar 10: 2 pacientes) foi calculado usando o escore visual (a) ou análise de imagem automatizado com o sistema Ariol-SL50 (B)

A seguir, analisadas metastáticos espécimes de cancro da próstata a partir de diferentes sites, incluindo óssea (3 amostras), medula óssea (3 amostras) e linfonodos (2 amostras). Todas as lesões metastáticas foram fortemente positivas para SEPT9_i1 coloração (Fig 3). Ao todo, alta expressão de SEPT9_i1 no câncer de próstata de alto grau e nas metástases de cancro da próstata sugere que SEPT9_i1 é um marcador candidato para a progressão do tumor.

lesões câncer de próstata metastático da medula óssea, linfonodo e osso foram imunocoradas com SEPT9_i1 . painéis esquerdos são baixos (x100) ampliação (LM) (barra de escala 100 mm) e painel direito são altos (x200) ampliação (HM) (barra de escala de 50 mm). Nota alto nível de coloração SEPT9_i1 em todas as metástases.

foram observados Discussão

Altos níveis de expressão SEPT9_i1 em várias doenças malignas incluindo leucemia [20] e do cancro da mama [11]. Neste estudo, nós mostramos que a expressão da proteína SEPT9_i1 está significativamente associado com pontuação de Gleason (Figuras 1 e 2 e Tabela 2). Até nos dias de hoje, a Gleason classificação e sistema de pontuação continua a ser um dos mais poderosos fatores prognósticos para o câncer de próstata [21]. Mais importante ainda, uma intensa coloração significativa SEPT9_i1 foi visto nas metástases de adenocarcinoma da próstata para vários locais (Fig 3). Estes resultados sugerem que a expressão da proteína SEPT9_i1 se correlaciona fortemente com a agressividade do tumor e progressão. Da mesma forma, Stanbery et ai. mostrou que a expressão da proteína de alta SEPT9_i1 na cabeça e pescoço de células escamosas carcinomas foi associado com resultados clínicos pobres [22]. Além disso, eles descobriram que a expressão elevada de SEPT9_i1 correlacionado com ambos avançados T e estágio N [22]. Colectivamente, estes dados clínicos apoiam estudos anteriores que mostram o papel de SEPT9_i1 na oncogênese [15, 23-25].

A vigilância activa é uma das abordagens aceites utilizados para reduzir o tratamento de pacientes com câncer de próstata de baixo risco . Tais pacientes são monitorados com o exame físico de toque retal, avaliações periódicas de PSA no sangue e repetir biópsias de próstata e, em alguns protocolos recentes de imagem seletiva usando multiparamétrico endorectal MRI [26]. O tratamento é então oferecido para aqueles com sinais de progressão. Infelizmente, vários relatórios mostram que uma parte substancial (cerca de 30%) de homens com câncer de próstata de baixo risco são classificadas erroneamente e precisam receber tratamento definitivo imediato [27]. No entanto, atualmente não existe um modelo exato para prever quais desses pacientes com doença de baixo risco devem ser tratadas imediatamente antes de progredir durante a vigilância [28]. Uma vez que a expressão da proteína SEPT9_i1 está fortemente correlacionada com a progressão do tumor e metástases, propomos SEPT9_i1 como um novo marcador que podem distinguir entre baixo risco contra o cancro da próstata de alto risco para a melhor selecção dos pacientes em programas de vigilância activa. Claro, mais estudos são necessários para testar esta hipótese.

Uma das limitações do nosso estudo é a falta de resultados clínicos de longo prazo para comparação com intensidade de coloração patológico de SEPT9_i1. Outra limitação é o número relativamente pequeno de pacientes em nossa coorte embora tenha sido suficiente para alcançar significância estatística.

Conclusões

No total, os nossos dados mostra claramente que a expressão SEPT9_i1 no câncer de próstata é fortemente associada com o mais poderoso fator preditivo patológica, a pontuação de Gleason. Além disso, os níveis de expressão elevados SEPT9_i1 foram detectados em todas as metástases de adenocarcinoma da próstata, sugerindo que SEPT9_i1 tem um papel na invasão tumoral e progressão. Mais estudos são necessários para determinar a aplicabilidade da SEPT9_i1 imunocoloração no contexto clínico.

Reconhecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Fundação de Investigação Médica (AMRF).