Abstract

Fundo

O câncer de pâncreas é uma doença altamente maligno, com um extremamente mau prognóstico. inibidores de histona-desacetilase (HDACIs) têm mostrado promissores actividades antitumorais contra modelos pré-clínicos de cancro do pâncreas, quer isoladamente ou em combinação com agentes quimioterapêuticos. Neste estudo, buscou-se identificar histona desacetilases clinicamente relevantes (HDACs) para orientar a selecção de inibidores de HDAC (HDACIs) adaptada para o tratamento de câncer de pâncreas.

Metodologia

expressão de HDAC em sete linhas celulares de cancro do pâncreas e células pancreáticas humanas normais ductais epiteliais foi determinado por Western blotting. interações entre antitumorais I- classe e classe HDACIs II selectivos foram determinadas por ensaios de MTT e isobolograma standard /software CompuSyn analisa. Os efeitos de HDACIs sobre a morte celular, a apoptose e a progressão do ciclo celular, e histona H4, alfa-tubulina, a p21, e os níveis de γH2AX foram determinadas por ensaios de formação de colónias, análise de citometria de fluxo, e Western blotting, respectivamente.

resultados

A maioria das classes I e II HDACs foram detectados nas linhas celulares de cancro do pâncreas, embora em níveis variáveis. Tratamentos com MGCD0103 (uma classe I-seletiva HDACi) resultou na prisão dose-dependente do crescimento, morte celular /apoptose e interrupção do ciclo celular na fase G2 /M, acompanhado por indução de p21 e de DNA quebras de cadeia dupla (LAP). Em contraste, MC1568 (uma classe IIa-selectiva HDACi) ou Tubastatin A (um inibidor selectivo HDAC6) mostrou efeitos mínimos. Quando combinados ao mesmo tempo, MC1568 aumentou significativamente prisão induzida por MGCD0103 crescimento, morte celular /apoptose e parada do ciclo /célula G2 M, enquanto Tubastatin A única sinergicamente aumentada parada do crescimento induzido por MGCD0103. Embora MC1568 ou Tubastatin A isoladamente não teve efeitos óbvios no DSB de ADN e expressão p21, a sua combinação com MGCD0103 resultou na indução cooperativa de p21 nas células.

Conclusão

Nossos resultados sugerem que as classes I e II HDACs são potenciais alvos terapêuticos para o tratamento de câncer de pâncreas. Assim, o tratamento de cancro do pâncreas com pan-HDACIs pode ser mais benéfico do que os inibidores de aula ou isoformas seletivo

Citation:. Wang G, J Ele, Zhao J, Yun W, Xie C, Taub JW, et al . (2012) Classe I e Classe II histona Desacetilases são potenciais alvos terapêuticos para o tratamento de cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (12): e52095. doi: 10.1371 /journal.pone.0052095

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de abril de 2012; Aceito: 09 de novembro de 2012; Publicação: 14 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da Universidade de Jilin, Changchun, China, a National Science Foundation Natural da China (No. 31071105), e em parte por um fundo de arranque do Instituto do Câncer Barbara Ann Karmanos, Faculdade de Medicina, Detroit Wayne State University , MI. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de pâncreas é uma doença altamente maligno com uma incidência cada vez maior. Apesar de ser a quarta causa de morte por cancro em os EUA, pouca melhoria na prognóstico tem sido feito ao longo dos últimos 20 anos [1] – [3]. Devido a atrasos no diagnóstico clínico, o câncer de pâncreas é frequentemente detectada em um estágio avançado eo prognóstico é extremamente pobre, com uma sobrevida de 4 a 6 meses [2]. Gemcitabina (2 ‘, 2’-difluorodesoxicitidina, dFdC) é o padrão do fármaco de primeira linha para o tratamento de doentes com cancro avançado do pâncreas [4]. No entanto, com sobrevida média de 5,7 meses e taxa de sobrevivência de 1 ano de 18%, a sua eficácia permanece baixa [5], [6]. Portanto, o cancro do pâncreas continua a ser uma malignidade altamente resistente à quimioterapia e necessita urgentemente novas abordagens terapêuticas.

histona desacetilases (HDACs) desempenham um papel crítico na regulação da expressão do gene epigenética por catalisar a remoção dos grupos acetilo, estimulando a condensação da cromatina e na promoção repressão transcricional [7], [8]. As HDAC compreendem um grande grupo de proteínas divididos em quatro classes com base na sua homologia para as HDACs de levedura, a sua localização subcelular e as suas actividades enzimáticas [8] – [10]. Classe I compreende HDAC1, 2, 3 e 8, que são todos os homólogos da proteína de levedura rpd3. Eles são ubiquamente expressa e localizado principalmente no núcleo [8] – [10]. enzimas da classe II incluem HDAC4, 5, 6, 7, 9 e 10, que são homólogos da proteína de levedura hda1. Estas enzimas geralmente apresentam expressão específica de tecido e de transporte entre o citoplasma e o núcleo, em resposta aos sinais celulares [8], [11]. Uma vez que as HDAC 6 e 10 contêm dois sítios catalíticos, estas enzimas são, por vezes, ainda mais designado como uma sub-classe separada (Classe IIb) de HDAC 4, 5, 7, 9 e (IIa) [8], [12]. Classe III compreende os sete SIRTUINAS, SIRT1-7, os homólogos da proteína de levedura SIR2 [8], [13]. HDAC11 contém resíduos conservados que são compartilhados por ambas as enzimas II classe I e classe e representa uma classe separada de HDAC (Classe IV) [8], [10], [14].

mudanças epigenéticas aberrantes são uma marca registrada dos cancros humanos [15]. expressão alta HDAC1 foi encontrado para correlacionar com pulmão avançado estágio e câncer pancreático [16] – [18]. Assim, HDACs podem representar alvos promissores para a intervenção farmacológica do câncer. Numerosas pequenas HDACIs molécula têm sido desenvolvidos ao longo da última década [19], [20], que têm mostrado promissores actividades antitumorais contra modelos pré-clínicos de cancro do pâncreas, quer isoladamente ou em combinação com quimioterapêutico ou agentes direcionados [16], [21] – [24]. No entanto, as isoformas de HDAC clinicamente relevantes no cancro pancreático não foram determinados inteiramente. KO e experiências knockdown siRNA sugerem que as HDACs de classe I são essenciais para a proliferação de células de cancro e em contraste com a sobrevivência de classe II HDAC 4 e 7 [25], [26]. No entanto, a inibição da classe IIb HDAC6 leva a acetilação e interrupção da função de acompanhante de choque térmico 90 (Hsp90) em células de leucemia [27]. Embora alguns HDACIs são considerados pan-HDACIs (por exemplo, LBH-589, PXD-101, e SAHA), um estudo recente demonstrou que as enzimas da classe IIA não são direcionados pela maioria dos HDACIs (por exemplo, FK-228, LBH-589 , MGCD0103, MS-275, PXD-101, e a SAHA), em concentrações farmacologicamente relevantes [28]. Assim, embora seja cada vez mais evidente que a classe I enzimas HDAC são clinicamente relevantes para o cancro [25], [26], isso é menos estabelecida para a classe enzimas II, especialmente no contexto de I HDACs de classe.

neste estudo, nós examinamos a expressão de classes I e II HDACs em sete linhas celulares de cancro do pâncreas e células epiteliais do ducto pancreático humanos e determinou as suas funções terapêuticas em células de câncer de pâncreas, usando de aula, subclass- e HDACIs isoformas selectivo. Os nossos resultados demonstram, pela primeira vez,

In vitro

antitumorais interacções sinérgicas entre a classe I e classe II HDACIs em células de cancro do pâncreas, mas não em células pancreáticas humanas normais epiteliais do ducto. Embora haja uma necessidade de estudos de acompanhamento em

In vivo

modelos, nossos resultados sugerem que tanto a classe I e classe HDACs II são potenciais alvos terapêuticos para o tratamento de câncer de pâncreas.

Materiais e Métodos

HDACIs

a nova classe I-seletiva HDACi MGCD0103 (Mocetinostat) [29], eo HDACi MC1568 classe IIa-seletiva [30] – [32] foram adquiridos de Selleck Chemicals LLC ( Houston, TX). O novo inibidor selectivo HDAC6 Tubastatin A [33] foi adquirido a partir de BioVision Inc. (Mountain View, CA). Todos os HDACIs foram dissolvidos em DMSO e armazenado a -80 ° C, como recomendado pelos fabricantes.

Cultura celular

O HPAC, MiaPaCa-2, BxPC-3, PANC-1 ( derivada de tumor primário [34]), AsPC-1, CFPAC-1, e Capan-1 (derivadas de metástases [34]), linhas celulares de cancro pancreático humano foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). As células normais humanos ductal pancreático epiteliais (HPDE) foram obtidos a partir de M. D. Anderson Cancer Center. As linhas celulares foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) ou RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) com 10% de soro inactivado por calor fetal de bovino (FBS; Hyclone Labs, Logan, UT), mais 100 U /mL de penicilina e 100 ug /estreptomicina mL numa atmosfera húmida a 37 ° C contendo 5% de CO

2/95% de ar.

In vitro

Citotoxicidade

In vitro citotoxicidades

HDACi de linhas de células de cancro do pâncreas e as células HPDE foram medidos usando MTT (brometo de 3- [4,5-dimetil-tiazol-2-il] -2,5-difenil-brometo, Sigma-Aldrich, St Louis , MO) reagente, tal como descrito anteriormente [35], [36]. Resumidamente, AsPC-1, BxPC-3, células PANC-1 (amplamente utilizados modelos de linhas celulares para a investigação do cancro pancreático), ou de HPDE foram cultivadas em 100 ul de DMEM /FBS a 10% em placas de 96 poços. As células foram incubadas a 37 ° C na presença de concentrações variáveis ​​de 5 MGCD0103 (0-4? M), MC1568 (0-10 uM), ou Tubastatin A (0-8? M). Após 96 h, adicionou-se MTT a uma concentração final de 1 mM. Depois de 4,5 horas, os cristais de formazan foram dissolvidos pela adição de 100 ul de SDS a 10% em HCl 10 mM. As densidades ópticas foram medidas com um leitor de microplacas visível a 590 nm. IC

50 valores foram calculados como concentrações de droga necessária para inibir 50% de crescimento em comparação com células de controlo não tratadas. Os dados para as linhas de células são apresentados como médias ± erros padrão de pelo menos 3 experiências independentes. A extensão e a direcção da MGCD0103 e MC1568 ou Tubastatin A interacções antitumorais foram avaliados por análise de isobolograma padrão como descrito anteriormente [35], [37], [38], e usando o software CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ) . Resumidamente, as interacções droga foram quantificados por determinação do índice de combinação (Cl), onde IC 1, IC = 1, e CI 1 indicam, aditivo, e efeitos sinérgicos antagonistas, respectivamente. Os dados são apresentados como médias ± erros padrão de pelo menos 3 experiências independentes.

Colony ensaios de formação de

Um dia antes de tratamentos HDACi, 300 PANC-1 ou 500 células BxPC-3 foram semeadas em placas de 100 mm em DMEM completo ou RPMI160. As células foram então tratadas com concentrações variáveis ​​de MGCD0103 (0-1,0 M), MC1568 (0-10 uM), Tubastatin A (0-4? M), MGCD0103 mais MC1568 (0,5 uM 5 uM), ou mais MGCD0103 Um Tubastatin (0,5? M 2? M) durante 96 h. As células foram então lavadas duas vezes com DMEM isento de droga ou RPMI1640 e cultivadas em DMEM completo ou RPMI1640 por até 3 semanas. As colónias foram visualizadas por coloração com azul de Coomassie e contadas. Os resultados são apresentados como percentagens médias ± erros padrão relativos às células de controlo não tratadas a partir de três experiências independentes. Extensão e direção de interações antitumorais entre MGCD0103 e MC1568 ou Tubastatin A foram determinadas usando o software CompuSyn (ComboSyn, Inc.).

shRNA Knockdown de HDACs em células PANC-1