Abstract

A obesidade e diabetes tipo 2 está associada a um risco aumentado para o desenvolvimento de certas formas de câncer, incluindo câncer de cólon. A publicação de estudos epidemiológicos altamente controversas, em 2009, levantou a possibilidade de que o uso da insulina glargina aumentos analógicos este risco ainda mais. No entanto, não está claro como efeitos mitogénicos de análogos de insulina e insulina medido

in vitro

correlacionam com efeitos promotores do crescimento de tumores

in vivo

. O objetivo deste estudo foi examinar possíveis efeitos de promoção de crescimento de insulina humana nativa, a insulina X10 e IGF-1, que são considerados controles positivos

in vitro

, em um modelo animal de curto prazo de uma à obesidade e câncer de diabetes relevantes. Nós caracterizado insulina e expressão do receptor de IGF-1 e a resposta ao tratamento com insulina, X10 e IGF-1 na linha de células do cancro do cólon murino (células MC38)

in vitro

e

in vivo

. Além disso, nós examinamos farmacocinética e farmacodinâmica e monitorizado o crescimento de enxertos de células MC38 em murganhos com obesidade induzida por dieta tratados com insulina humana, X10 e IGF-1. O tratamento com o X10 e IGF-1 aumentou significativamente o crescimento de enxertos de células MC38 em ratos com obesidade induzida por dieta e, portanto, podemos concluir que as doses supra-farmacológica do análogo da insulina X10, que é super-mitogênica

in vitro

e aumento da incidência de tumores mamários em ratos fêmeas em um estudo de toxicidade de 12 meses, também aumentar o crescimento de enxertos de tumor em um modelo animal de curto prazo

Citation:. Hvid H, Blouin MJ, Birman e, Damgaard J, Poulsen F, Fels JJ, et al. (2013) O tratamento com insulina analógica X10 e IGF-1 aumenta o crescimento do cancro do cólon aloenxertos. PLoS ONE 8 (11): e79710. doi: 10.1371 /journal.pone.0079710

editor: Josep Bassaganya-Riera, Virginia Tech, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de julho de 2013; Aceito: 24 de setembro de 2013; Publicação: 18 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hvid et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente apoiado por uma bolsa (TFF-116128) do Canadian Institute of Health Research. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos de interesses ao relatório: H HVID, J Damgaard, JJ Fels, F Poulsen, C Fledelius e BF Hansen são funcionários da Novo Nordisk e detém ações na empresa. M Pollak é consultor da Novo Nordisk. Para todos os demais autores não existem conflitos de interesses a relatar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A obesidade e diabetes tipo 2 está associada a um risco aumentado de certas formas de câncer, tais como mama, pâncreas e câncer de cólon [1] – [5]. Estudos epidemiológicos altamente controversa sugerido que o uso terapêutico da insulina glargina análogo de insulina foi associada a um risco aumentado de desenvolvimento de cancro [6], [7], mas o julgamento ORIGEM fornecida recentemente uma forte evidência de que isto não é o caso [8]. No entanto, os estudos epidemiológicos publicados em 2009 e as seguintes discussões destacaram a importância da avaliação de segurança pré-clínica de análogos de insulina. Além disso, os resultados tranquilizadores relativos glargina não diminuem a evidência prévia para uma associação entre diabetes tipo 2 e aumento do risco ou pior prognóstico de certos tipos de câncer, incluindo câncer de cólon, e os mecanismos por trás dessa associação continua a ser um tema importante.

neste contexto, o análogo de insulina X10 é um ligando interessante. X10 foi desenvolvida como um análogo da insulina de acção rápida, por substituição da histidina na posição B10 com ácido aspártico [9]. Esta substituição de um único aminoácido aumentou a afinidade de ligação de X10 ao receptor de IGF-1 (IGF-1R) e receptor de insulina (IR) de 3 a 5 vezes e 2 vezes, respectivamente [10], [11]. Além disso, X10 diminuiu a taxa de dissociação do IV em comparação com a insulina humana nativa (HI) que resulta na sinalização sustentada do IR [12]. Recentemente, foi mostrado que X10 resulta em activação proporcionalmente mais forte dos locais de fosforilação nos domínios justa-membrana e cinase do RI do que o domínio C-terminal [13]. Estas características de ligação ao receptor e -activation X10 dá um potencial de 3-15 vezes maior do que mitogénica HI ​​

In vitro

[14] e em uma toxicidade crónica de 12 meses doses estudos supra-farmacológica de X10 aumentada a incidência de espontânea tumores mamários em ratos Sprague Dawley fêmeas [15]. Maior desenvolvimento do X10 para o uso clínico foi, portanto, descontinuado, mas os mecanismos por trás do aumento da incidência de tumores nunca foram totalmente esclarecidas (ver [16] para uma revisão detalhada).

estudos animais anteriores utilizando genética ou induzida por dieta modelos de obesidade ou diabetes têm correlacionado hiperinsulinemia com o aumento da formação de lesões pré-neoplásicas induzidas quimicamente no cólon [17], [18], o crescimento de tumores do cólon induzidos quimicamente [19], [20], bem como o crescimento de aloenxertos de células de cancro de murídeo [21 ] – [25]. Em modelos de rato com a indução química do cancro, o tratamento com insulina aumentada crescimento de tumores induzidos por azyoxymethane cólon [26] e 7,12-dimetilbenz (a) antraceno induzida por tumores mamários [27]. Também tem sido demonstrado que a infusão constante de insulina a ratos durante 12 h aumento da proliferação de células epiteliais do cólon [28], e doses supra-farmacológica de HI ou glargina para 18 semanas aumentou a proliferação de células epiteliais do cólon e formação de lesões pré-neoplásicas, mas não resultou na formação de tumores [29]. Nos estudos de segurança, que tradicionalmente são realizados como estudos de carcinogenicidade ou estudos de toxicidade crónica de 6-24 meses de duração em camundongos ou ratos [30], nenhum aumento na incidência do tumor foi observada em ratos Sprague Dawley e NMRI-ratos após o tratamento com doses relativamente baixas de glargina e HI para até 24 meses [31]. No entanto, como mencionado acima, o tratamento com doses elevadas de X10 de 12 meses o aumento da incidência de tumores mamários em ratas Sprague Dawley tumorais mamarias propensas [32]. Enquanto as recomendações para estudos de segurança de insulina e análogos de insulina são baseados em prática científica bem validado, desenvolvido originalmente para estudos de agentes mutagénicos, os dados existentes sugerem que um promotor do crescimento do tumor efeito da insulina e análogos de insulina é uma preocupação mais pertinente, que preocupação para aumento da iniciação do tumor, através de um aumento da taxa de mutação causada por um aumento da proliferação, como também foi sugerido anteriormente [33]. A relação custo-eficácia dos programas de rastreio para diferentes formas de câncer enfatiza que não é incomum para adultos, incluindo diabéticos, para ter pré-malignas sem ser detectado primeiros cânceres [34], [35]. É, portanto, relevante para explorar como o tratamento com insulina e análogos de insulina influenciar o comportamento dos cânceres existentes, e para fazer isso em modelos animais de diabetes ou obesidade combinado com resistência à insulina, pois esses fatores são conhecidos fatores de risco para desenvolvimento de câncer.

o objectivo do estudo foi examinar a possível do tumor (células MC38) efeito do tratamento com HI, X10 e de IGF-1 num modelo de alo-enxertos de cancro do cólon de murino de promoção de crescimento estabelecido em ratinhos com obesidade induzida por dieta (DIO) e resistência à insulina. Nós, portanto, caracteriza-se a linha de células MC38 utilizado para os estudos de aloenxerto extensivamente e realizaram uma série de experiências com animais para obter uma estimativa confiável do efeito tumor de promoção do crescimento possível de HI, X10 e IGF-1

in vivo

.

Materiais e Métodos

Experimentação animal

Para examinar o efeito do tratamento com HI, X10 e IGF-1 no crescimento de enxertos de tumores MC38 nós realizados cinco experimentos com animais idênticos. Nós focado em diferentes mecanismos nestas experiências com animais e monitorizado o crescimento do tumor em todas as experiências, ver Tabela 1. As experiências em animais foram realizados tal como descrito recentemente [36]. Em resumo, ratinhos C57BL macho /6 machos foram adquiridos a Jackson Laboratories, na idade de 18 semanas, onde os ratinhos haviam sido mantidos numa dieta de elevado teor de gordura (dieta de roedores com 60 kcal% de gordura, D12492, Dietas Research, Inc., New Brunswick, NJ, EUA) desde a idade de 6 semanas. Para a caracterização do fenótipo metabólico em DIO-ratos (ver Tabela 2), parâmetros metabólicos também foram medidos em ratos magros com a mesma idade alimentados com uma dieta controle (dieta Rodent com 10 kcal% de gordura, D12450B, Research Diets) incluídos em cada três os experimentos. cuidados com os animais e os tratamentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas e protocolos aprovados pelo Instituto Lady Davis (protocolo nº 5951) e Comitê de Ética Animal da Universidade McGill. Os ratos foram alojados um rato por gaiola com acesso ad libitum à água da torneira e da dieta de alta ou de baixa gordura, respectivamente, ao longo dos estudos. A temperatura nas salas dos animais foi mantida a 20-25 ° C com um ciclo de luz /escuro de 14/10 horas. Os murganhos foram aclimatizados durante 7-10 dias antes dos procedimentos experimentais foram iniciadas. No dia experimental 0, 2,0 × 10

5 (experiência A) ou 5,0 x 10

5 (todas as outras experiências) células MC38, por via subcutânea, suspenso em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), foram injectados (SC) no flanco direito dos ratos. Subsequentemente, cada rato foi injectado sc duas vezes por dia quer com veículo (solução aqueos contendo fosfato de 7 mM, glicerol 150 mM, NaCl 22 mM e fenol 30 mM, pH 7,4), insulina humana recombinante, 600 nmol /kg, análogo de insulina X10 (análogo de insulina B10Asp) (Novo Nordisk A /S, Copenhaga, Dinamarca), 600 nmol /kg ou recombinantes humanos IGF-1 (Increlex, IPSEN Pharma GmbH, Ettlingen, Alemanha) a 600 nmol /kg. O tamanho dos enxertos do tumor foi medida três vezes por semana, e o volume calculado usando a seguinte fórmula: comprimento x largura

2 × 0,52. Com base nos dados do volume do tumor para cada rato, calculou-se a área sob as curvas de crescimento do tumor (tumor de crescimento AUC). Ao término dos experimentos, os ratos foram anestesiados com isoflurano. O sangue foi colhido por punção cardíaca, e imediatamente após a eutanásia por deslocação cervical, as amostras de fígado, cólon, o músculo gastrocnémio e os aloenxertos de células de tumor MC38 foram dissecados e congelados instantaneamente em azoto líquido para posterior preparação de lisado de tecido.

glicose no sangue e HbA1C

Para monitorar o efeito farmacodinâmico do tratamento com HI, X10 e IGF-1, de glicose no sangue foi medida antes do tratamento e 15 min, 1 h, 2,5 he 6 horas após o tratamento. Recolheu-se sangue por punção da veia e de glicose no sangue safena medida utilizando um Ultra Glucometer OneTouch (LifeScan, Inc., Milpitas, CA, EUA).

os níveis de hemoglobina glicosilada (HbA1c) no sangue de Dio e controle camundongos magros foram medidos utilizando o kit de análise de hemoglobina A1c Gen.3 Tina-quant e um instrumento Cobas 6000 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), de acordo com instruções do fabricante.

Coleta de Amostras e medições de plasma de peptídeo C, a insulina humana, insulina X10 e IGF-1 humano

Antes de experimentos foram iniciados, os níveis sistêmicos de insulina de rato foram medidos usando um rato /mouse insulina ELISA kit (Millipore Corp., Bilerica, MA , EUA), de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de plasma recolhidas a terminação de experiências foram testadas para o rato do péptido-C, insulina humana, insulina X10 analógico ou IGF-1 humano. Rato C-péptido foi ensaiado com Rat /Mouse C-péptido 2 kit de ELISA (Millipore), de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações plasmáticas de IGF-1 humano foram medidos com o kit de ELISA IDS-iSys IGF-1 (IDS Immunodiagnostics, Fountain Hills, AZ, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de plasma foram analisadas para a insulina humana nativa utilizando uma Oxigénio luminescência Canalização Imuno-ensaio (LOCI-ensaio), conforme descrito anteriormente [37]. A insulina X10 foi medido no plasma do rato utilizando um ensaio de lavagem-LOCI, como também recentemente descrito [38]. Veja Materiais S1 para obter informações detalhadas sobre estes ensaios.

Cultura de Células

células MC38 (linha celular de rato descrito por Corbett et al. (1975) [39] e generosamente fornecidos pelo Dr. Pnina Brodt , McGill University, Montreal, QC) e células MCF-7 (ATCC, Manassas, VA, EUA), foram cultivadas em meio DMEM contendo 4,5 g /l de glucose (Wisent Inc., Montreal, QC, Canadá) suplementado com 10% ( v /v) de soro fetal de bovino (FBS, Invitrogen) e 20 ug /ml de gentamicina (Sandoz, Canada, Boucherville, QC, Canadá) (isto é, meio de crescimento). As células utilizadas em experiências com animais foram tripsinizadas, lavadas uma vez em PBS e ressuspensas em PBS (4 ° C) a uma concentração de 5,0 × 10

6 células /ml e mantidas em gelo até injecção subcutânea nos ratos. Para a sinalização de experiências, as células MC38 foram cultivadas em meio de crescimento durante dois dias até 80-90% confluentes, as culturas de células foram então lavadas uma vez em PBS (temperatura ambiente), e meio de privação (semelhante ao meio de crescimento, excepto que continha apenas 0,25% (v /v) de FBS e sem vermelho de fenol) foi adicionado durante 3 h. Após as células de fome foram tratados com insulina humana nativa, X10 ou IGF-1 em concentrações finais de 1 ou 10 nM em meio de privação. Exactamente 30 minutos após o tratamento, as células foram lavadas uma vez em PBS (4 ° C) e lisadas pela adição de tampão de lise, tal como descrito acima. Cada experimento sinalização composta por duas amostras idênticas por tratamento e três experimentos independentes foram realizadas. células MC38 utilizados para a caracterização da expressão do IGF-1R e IR foram cultivadas, colhidas e lisadas, como descrito para as experiências de sinalização acima, excepto que não foram deixados em jejum antes da lise.

A proliferação celular

Efeito dos compostos de teste sobre a proliferação foi avaliada com 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT) ensaios, essencialmente como descrito anteriormente [40]. Em resumo, as células MC38 foram plaqueadas em placas de 96 poços (5000 células por poço) em meio de crescimento. Após incubação durante 1 dia, as células foram lavadas em PBS (temperatura ambiente), fome durante 3 h e depois tratou-se com IH, X10 ou IGF-1 em concentrações variaram desde 0,001 a 1000 nm. Os dados para os números de células relativos das três experiências repetidas, cada uma com quatro replicar amostras por condição, foram então usadas para o ajuste de curvas de dose-resposta utilizando o GraphPad Prism Versão 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). experiências de proliferação celular foram realizadas com células MCF-7 tal como descrito para as células MC38, excepto que as 20000 células foram plaqueadas por cavidade. Veja Materiais S1 e Figura S1 de informações suplementares detalhadas sobre experiências de proliferação celular.

Preparação de tecidos e células Lysates e Western Blotting

Lise de congelados amostras de tecidos e culturas de células em placas de Petri, centrifugação de Os lisados, ensaio de concentração de proteína, a mistura de lisados ​​celulares ou de tecidos com tampão de carga DSS 2X, a desnaturação, a SDS-PAGE em géis pré-4-15% de gradiente de fundido (BioRad) e transferência para membranas de nitrocelulose de 0,45 um foram realizados como descrito anteriormente [ ,,,0],36] Antes de blotting com anticorpos primários as membranas de nitrocelulose foram bloqueadas por incubação em solução salina tamponada com Tris com 0,05% (v /v) de Tween (TBS-T) com 5% (w /v) de albumina de soro bovino (BSA) (quando blotting com anticorpos primários específicos de fosforilação) ou TBS-T com 5% (w /v) de leite desnatado (todos os outros anticorpos primários) durante 1 h à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram diluídos em TBS-T com 5% (w /v) de BSA e a incubação foi realizada durante a noite a 4 ° C. Os seguintes anticorpos de coelho, toda a partir de Cell Signaling Technology Inc., Boston, MA, EUA, foram usadas:. Anti-fosfo-p70S6K (.. Thr389, gato não 9205), anti-P-S6 (Ser235 /236, N�cat . 2211), anti-fosfo-AKT (Ser473, cat. no. 9271), anti-Akt (cat. no. 9272), anti-fosfo-MAPK (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187, cat. no. 4370) , anti-P-IRS-1 (Ser302, cat. no. 2384), anti-IRβ (cat. no. 3025), anti-IGF-1Rβ (cat. no. 3018), anti-beta-actina (cat. n. 4967). A incubação com anticorpo secundário (peroxidase de rábano conjugada com IgG de cabra anti-coelho (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA, Cat. Não 5401) e visualização das bandas de proteínas foi feito como descrito anteriormente [36]. A intensidade de bandas de proteína foi quantificada utilizando o software ImagePro (BioRad). em cada célula experimento de sinalização, de intensidades de bandas foram normalizados para a média das amostras tratadas com o veículo. bandas de IR e o IGF-1R no fígado, cólon muscular e aloenxertos de células MC38 foram normalizados significar intensidades das bandas em amostras de fígado e músculo, respectivamente.

ensaio de teor de triglicéridos de fígado em lisado preparado a partir de amostras de fígado de Dio e ratos magros foi feito usando um kit de triglicéridos ensaio colorimétrico (Cayman Chemical Company, Ann Arbor , MI, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.

análise estatística

a análise estatística foi realizada utilizando software SAS versão 9.1.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Em todas as análises observações foram assumidos como sendo independente entre animais ou unidades experimentais de cultura de células. Além disso, os dados foram assumidas seguir uma distribuição normal e ter homogeneidade de variância. Para cumprir estes pressupostos, os dados foram transformados usando o logaritmo natural, quando necessário. Dados com um valor residual normalizado numérica . 3.0 foram considerados como valores atípicos, como sugerido anteriormente [41], ea análise estatística foi feita com e sem esses valores extremos (ver mais abaixo)

In vitro

dados de sinalização foram analisados ​​utilizando uma análise de uma via de variância (ANOVA), seguido de comparações de pares entre cada tipo de tratamento e controle usando vários testes t com correção Dunnetts. Além disso, em cada nível de dose, uma comparação direta do tratamento com HI e X10 e HI com IGF-1 foi feito usando estudante t-testes. Dados de IV e descrevem expressão de IGF-1R em vários tecidos de rato foram analisados ​​em um one-way ANOVA seguido por comparações aos pares entre tecidos utilizando múltiplos t-teste de Bonferroni com correcção.

O efeito do tratamento sobre o crescimento do tumor em cada de cinco experiências com animais foram analisados ​​em um one-way ANOVA seguido por comparação aos pares de cada tratamento com veículo usando vários testes-t com correcção Dunnetts para cada uma das duas extremidades de crescimento de tumor; volume tumoral final e a área sob as curvas de crescimento do tumor (tumor de crescimento AUC). Os resultados desta análise para cada experiência, ou seja, os valores médios para cada tratamento, os intervalos de confiança de 95% e a mudança de dobragem de cada tratamento em relação ao veículo, são mostrados na Tabela 3.

Para examinar tratamento efeitos relacionados com no crescimento do tumor em todos os cinco experimentos com animais, que para cada ponto final (volume final do tumor e o crescimento do tumor AUC) reunidos todos os dados em um conjunto de dados e analisá-los em um modelo linear misto com o tratamento como uma variável explicativa fixa e experiência como um efeito aleatório. Não houve interação significativa entre tratamento e experimento foi encontrado para a qualquer um dos dois resultados (volume final do tumor e AUC crescimento do tumor). Para explorar ainda mais as diferenças entre tratamentos, comparações de pares de cada tipo de tratamento foram feitas usando múltiplos teste t com correção Bonferonni. Não há valores atípicos foram observadas entre as 131 observações de volume de tumor final, ao passo que um outlier foi identificado entre as 131 observações da AUC crescimento do tumor. Exclusão deste outlier foi necessária para cumprir as premissas por trás dos modelos estatísticos e não alterou o resultado global da análise. A AUC média de crescimento do volume final do tumor e do tumor para cada tratamento em todas as cinco experiências, incluindo intervalos de confiança de 95% e dobre mudança de cada tratamento relativamente ao grupo tratado com veículo são mostrados na Tabela 3.

Resultados

As células MC38 é sensível à insulina, X10 e IGF-1