Sumário

22Rv1 é uma linha celular de cancro da próstata comum utilizado em experiências com ratos de xenoenxerto, bem como em ensaios de cultura de células in vitro para estudar os aspectos da tumorigénese cancro da próstata. Recentemente, esta linha de células foi mostrado para abrigar múltiplas cópias de um Gammaretrovirus, chamado XMRV, integrados no seu genoma. Enquanto a próstata de xenoenxerto de cancro CWR22 original está livre de qualquer retrovírus, linhas celulares posteriormente gerados 22Rv1 e CWR-R1, transmitir o vírus e, adicionalmente, derramou partículas gammaretroviral infecciosas no seu sobrenadante. Embora XMRV mais provável foi gerado por eventos de recombinação em cultura de células, este vírus tem sido demonstrado para infectar células humanas in vitro e 22Rv1, bem como células CWR-R1 são agora considerados de segurança 2 reagentes. Aqui, demonstramos que as células com 22Rv1 mostra transcrição retroviral reduzida reduzida angiogénese de tumor e aumentou a de necrose do tumor a partir de células primárias derivadas xenoenxertados em ratinhos SCID quando comparado com a linha celular parental. A presença de transcritos de XMRV aumenta significativamente a secreção de osteopontina (OPN), CXCL14, IL13 e TIMP2 em 22Rv1 células. Além disso, estes dados são suportados por na invasão de células in vitro e ensaios de diferenciação. Colectivamente, estes dados sugerem que a presença de transcritos de XMRV contribui, pelo menos, parcialmente para 22Rv1 características observadas in vitro e in vivo no que diz respeito à migração, invasão tumoral e angiogénese. Propomos que os dados recebidos com 22Rv1 células ou células que transportam equivalentes gammaretroviruses xenotr�icos deve ser cuidadosamente controlada, incluindo outras linhas celulares de cancro da próstata testados por sequências virais

citação:. Stieler K, L Schumacher, Horst AK, Fischer N (2012 ) XMRV induz a migração celular, a expressão das citocinas e angiogénese tumoral: são 22Rv1 células um cancro da próstata do modelo adequado? PLoS ONE 7 (7): e42321. doi: 10.1371 /journal.pone.0042321

editor: Peter Sommer, Institut Pasteur Coréia, República da Coreia

Recebido: 23 Abril de 2012; Aceito: 02 de julho de 2012; Publicação: 27 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Stieler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PC) é o tipo mais comum de câncer em homens nas sociedades ocidentais com mais de 350.000 cancros recentemente diagnosticados e mais de 90.000 mortes reais por ano, apenas na Europa, representando, assim, um problema sócio-económico sério. O cancro da próstata reflecte uma doença em fase heterogénea e multi que fornece um desafio para o desenvolvimento apropriado in vitro e in vivo em modelos

modelos in vitro confiar em algumas linhas celulares de cancro da próstata disponíveis [1], que são de origem epitelial.: as linhas de células mais comuns utilizadas são LNCaP [2], PC3 [3], DU145 [4] e como um modelo de xenoenxerto também comum 22Rv1 células [5]. Estas linhas de células servido no passado, e ainda são normalmente aplicados, como modelos para a investigação de progressão tumoral, invasão, metástase, novas estratégias terapêuticas, bem como resistência a drogas. Transplantados em ratinhos imunodeficientes estas linhas celulares produzem tumores, que são semelhantes ao tumor parental [5]. Tais em modelos xenoenxerto in vivo foram estabelecidos utilizando células LNCaP, 22Rv1 ou células PC3 enxertadas em SCID imunodeficientes, ratinhos nus ou NOD-SCID. Na ausência de um modelo ideal do rato exibindo hiperproliferação e hiperplasia das células epiteliais (Prostática neoplasia intra-epitelial, PIN), PIN de alto grau (HGPIN), adenocarcinomas e carcinomas da próstata invasivos (ratos naturalmente não desenvolvem PC), experiências com ratos de xenotransplante utilizando tecido fatias ou linhas celulares de cancro da próstata humano são amplamente utilizados.

22Rv1 é derivado a partir de um xenoenxerto de tumor CWR22 recaída que foi transplantado seriadamente em ratinhos nus [5]. Em 2009, as células 22Rv1 foram demonstradas para transportar várias cópias integradas do XMRV Gammaretrovirus (xenotr�ico vírus da leucemia murina relacionada com virus); Essas células produzem-altos títulos de vírus no sobrenadante de cultura [6]. Um trabalho recente fornece evidências de que duas linhas de células geradas a partir de um CWR22 tumor xenoenxerto, 22Rv1 (CWR22Rv1) e CWR-R1, produzir partículas infecciosas XMRV em sua sobrenadante [7].

XMRV foi inicialmente identificada no tecido da próstata de pacientes com câncer de próstata familiar [8]; trabalho posterior forneceram evidências da expressão da proteína XMRV em até 23% dos casos de câncer de próstata [9]. No entanto, vários estudos não conseguiram detectar o XMRV em amostras de câncer de próstata utilizando PCR ou métodos de IHC [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19] Devido à falta de variabilidade da sequência de fragmentos de genes XMRV em isolados de pacientes em comparação com variabilidade de sequência identificada numa linha celular positiva XMRV 22Rv1 foi postulado que XMRV pode ser um contaminante de laboratório, em vez de um verdadeiro vírus humano exógeno [20]. Estes dados são reforçados por dados recentes de Paprotka e colegas analisar diferentes passagens de xenoenxertos de CWR22: XMRV está presente nas células e células 22Rv1 CWR-R1, no entanto, as primeiras passagens do xenoenxerto CWR não possuem quaisquer sequências XMRV detectáveis. Estes dados são a favor de um evento de recombinação durante passaging de CWR22 xenotransplante, gerando assim XMRV [7].

22Rv1 células são um modelo pré-clínico comumente usado de câncer de próstata [21], [22], [23] . Apenas recentemente, esta linha celular foi classificado como uma linha celular de biosegurança nível 2. Esta linha de células produz títulos elevados de partículas gammaretroviral xenotr�icos que podem infectar as células humanas [6], [7]; células de ratinhos consanguíneos têm, normalmente, uma mutação no receptor destes vírus, chamado Xpr1, e não são permissivas para este grupo de vírus. No entanto, certas células de ratinho (ratinhos selvagens e algumas estirpes endogâmicas portadores do alelo receptor apropriado [24], [25]) podem ser infectados com o vírus. Cuidado para a interpretação dos dados apenas resultante de células 22Rv1 portadores do vírus têm sido discutidas anteriormente [26], contudo, não directamente no âmbito do in vivo ou in experimentos in vitro.

Neste estudo analisamos o nexo de causalidade entre a Gammaretrovirus XMRV e o fenótipo transformado de células 22Rv1 utilizando ensaios in vitro utilizada para estudar a proliferação celular, a migração e a diferenciação através da comparação 22Rv1 células e 22Rv1 células com títulos virais reduzidos em experiências com ratos, a migração de xenoenxerto in vitro, invasão e ensaios de formação de tubo. Nós fornecemos evidências de que o XMRV Gammaretrovirus contribui significativamente para a tumorigênese de xenoenxertos 22Rv1 em camundongos. Estas observações são apoiadas por resultados in vitro que demonstram diferenças na liberação de citocinas em células 22Rv1 infectados com células XMRV e 22Rv1 com reduzidas transcritos virais. Além disso, nós fornecemos evidências de que a infecção por XMRV em fibroblastos estromais da próstata induz significativamente mudanças na liberação de citocinas. Observa-se as diferenças na migração das células de células LNCaP, quando utilizado in vitro de migração celular e invasão ensaios em conjunto com sobrenadante de cultura de células do estroma infectadas com XMRV; sobrenadante de células infectadas com gammaretroviruses anfotrópicos ou env do vírus XMRV pseudotipado como partículas não influenciar a migração celular de células LNCaP, indicando que este é específico para afectar XMRV e não dependente da interacção do receptor ou a sinalização do receptor.

Em resumo, a nossa resultados indicam que a capacidade de transformação de células 22Rv1 é fortemente dependente da presença de XMRV. Portanto, os resultados obtidos em experimentos utilizando células 22Rv1 que diz respeito à tumorigênese do câncer de próstata tem que ser validado em outras linhas celulares de cancro da próstata vírus negativo.

Resultados

A linha de células epiteliais da próstata 22Rv1, derivado um xenoenxerto de carcinoma da próstata humana em ratinhos imunodeficientes, contém várias cópias do XMRV Gammaretrovirus integrado no ADN da célula hospedeira. XMRV replica activamente nesta linha de células resultante em vírus infeccioso contendo sobrenadante [6], [7]. 22Rv1 células foram usadas em experiências com ratos de xenoenxerto no passado sem saber que um vírus infeccioso é shedded por esta linha celular. Apesar do facto de XMRV provavelmente não é um vírus em circulação na população humana foi analisada a contribuição deste vírus com as características da linha de células:. A migração celular e a libertação de citoquinas, bem como a progressão do tumor em ratinhos imunodeficientes

xenoenxertado 22Rv1 tumores em ratinhos SCID com transcritos virais reduzidas são altamente necróticas e Show menos formação de vasos

Nós estabelecemos uma linha celular 22Rv1 com quantidades XMRV transcrição reduzidas, resultando em partículas virais menos infecciosas no sobrenadante da cultura. Dois shRNAs diferentes segmentação duas regiões diferentes na região de XMRV LTR (Figura 1A) foram combinados. hairpins estáveis ​​contendo as sequências shLTR1 e shLTR2 (Tabela S1) foram clonados individualmente no vector lentiviral LEGO G-puro [27]. pseudotipado partículas virais contendo sobrenadante de ambos os shRNAs contendo ARN lentivirais foi utilizado para a infecção de células 22Rv1, que foram tratados subsequentemente com puromicina para seleccionar células que expressam shRNA. Para descartar seleção específica de eventos de integração individuais, a seleção em massa em vez de seleção de clones única foi realizada, bem como foi gerado sobrenadante de controlo contendo partículas virais pseudotipados com o plasmídeo lentiviral parental LEGO G-puro, sem shRNA inserção. Como mostrado na Figura 1B Gag p30 /CA (capsídeo), os níveis de expressão de proteína foram significativamente reduzida, bem como a quantidade de partículas infecciosas derramado para o sobrenadante foi consideravelmente diminuída em shLTR1 + 2 expressando 22Rv1 células (Figura 1C). Utilizando estas células em experiências in vivo, em xenoenxerto, um total de seis ratinhos SCID por grupo shRNA foram injectados subcutaneamente com 2 x 10

6 células em matrigel em cada flanco lateral. aparecimento do tumor e o peso foi monitorizada por 36d. Não foram observadas diferenças significativas no início do crescimento tumoral entre as células de controlo e células 22Rv1 22Rv1 expressam shLTR1 + 2, tal como avaliado por inspecção visual diariamente e o controlo do peso dos ratos (dados não mostrados). Após 36d, os ratinhos foram sacrificados e o peso do tumor, necrose, bem como a formação de vasos foi analisada. O peso de 22Rv1 shLTR1 + 2 tumores foi significativamente reduzida (Figura 2A painel da esquerda) em comparação com tumores de controlo. Estes tumores exibida grandes áreas de necrose (como pode ser visto na Figura 2B painel da esquerda, Figura S2A (células de controlo) e S2B (22Rv1 shLTR1 + 2)) e demonstraram significativamente menos números de vasos quando se realiza a coloração imuno-histoquímica da aplicação de um anticorpo monoclonal de CD34 para secções de tecido de tumor ( Figura 3A painéis superiores e Figura 3B) em comparação com os controlos.

(a) representação esquemática da região LTR XMRV e 5 ‘UTR de Gag. Localização dos usados ​​para reduzir shRNAs XMRV transcritos em células 22Rv1 é mostrado como setas. Três sequências diferentes, shLTR1 (região R), shLTR2 (região U5) e shLTR3 (localizado logo a jusante do local dador (SD)) foram escolhidos usando a ferramenta on-line siRNA alvo localizador da Ambion. (B) 22Rv1 células transduzidas com o sobrenadante lentiviral contendo o shRNAs indicado e puromicina seleccionado: 22Rv1 shLTR1 + 2 células mostram reduziu significativamente a proteína p30 (CA), na análise de Western Blot em comparação com células de controlo. Actina foi utilizado como um controlo de carga. (C) PCR em tempo real determinar a quantidade relativa de partículas infecciosas no sobrenadante de shRNA 22Rv1 transduzidas células.

ratinhos SCID (n = 6) foram s.c. injectados com 22Rv1 shLTR1 + 2, ou com shLTR3 22Rv1 células de controlo. Para cada linha celular a quantidade final do tumor foi n = 12. 36d p.i. camundongos foram sacrificados e os tumores foram analisados ​​quanto ao peso (A) e necrose (B).

(A) coloração imuno-histoquímica para CD34 revelaram formação de vasos sanguíneos rudimentar em XMRV derrubar tumores, enquanto que os tumores de controlo 22Rv1 visor emergiu estruturas de angiogénese. (B) CD34

+ áreas em tumores foram quantificados em tumores shLTR3 (n = 10 cada) e controle de. Percentagens de CD34

+ áreas são expressas em relação às áreas totais analisados.

Para descartar que as diferenças observadas são uma consequência dos chamados efeitos pontuais alvo de shRNAs segmentação transcrições XMRV ou selecção clonal um evento de integração individual, uma terceira shRNA com as sequências complementares para a região de 5’GAG (229-250, NC_007815) (Figura 1A) foi clonado no plasmídeo LEGO L-puro. Semelhante às células 22Rv1 transfectadas com shLTR1 + 2, as células 22Rv1 expressam shLTR3, mostraram significativamente reduzida P30 CA /níveis de expressão da proteína gag (Figura 1B, pista 3 e 4) e até 80% de partículas virais menos infecciosas no sobrenadante da cultura (Figura 1C), em comparação com células de controlo. Injectar destas células em cada um dos flancos de seis ratinhos SCID não reduzir o ponto de tempo do crescimento do tumor, bem como não houve mudança significativa no peso do tumor, como observado para shLTR1 + 2 (Figura 2A, painel da direita). No entanto, observou-se grandes áreas de necrose nos tumores 22Rv1 shLTR3 (Figura 2B, painel da direita). Embora os tumores de 22Rv1 shLTR1 + 2 mostrou apenas pequenas diferenças no tamanho das áreas de necrose, essas diferenças foram estatisticamente significativas nos tumores induzidos com células 22Rv1 shLTR3. Do mesmo modo, a coloração de CD34 demonstrou redução da formação de vasos com base na coloração positiva CD34 IHC em tumores induzidos por células 22Rv1 shLTR3 em comparação com tumores de controlo (Figura 3).

Estas experiências indicam que as características de xenoenxertos em ratinhos imunodeficientes 22Rv1 dependem parcialmente na produção do XMRV Gammaretrovirus nestas células.

22Rv1 células que expressam shLTR1 + 2 diferem no padrão de expressão de citocinas em comparação com células parentais

os sobrenadantes de cultura de células de controlo, infectadas com 22Rv1 sobrenadante pseudotipado lentiviral contendo o plasmídeo LEGO L Puro vazio e de 22Rv1 shLTR1 + 2 as células foram recolhidas e ensaiadas para citocinas usando um processo de fase sólida imunotransferência (RayBio Cytokine anticorpo humano matriz 5; RayBiotech) (Figura S3). Os sobrenadantes foram aplicadas a membranas contendo anticorpos para 80 citocinas humanas. pequenas diferenças na liberação de citocinas de estas células foram detectados (Figura S3). Em 22Rv1 células com níveis XMRV transcritos reduzidos, osteopontina (OPN), inibidor de tecido de TIMP2 matrixmetalloproteinase e IL13 foram ligeiramente reduzido, enquanto o factor de crescimento de hepatócitos (HGF) foi aumentada.

Usando quantitativa PCR em tempo real para o ARNm indicada transcrições que confirmaram estes achados: OPN, TIMP2 e expressão IL13 é reduzida significativamente em 22Rv1 células que expressam shLTR1 + 2 enquanto expressão HGF é aumentado consideravelmente (Figura 4). Além disso, testou-se a expressão da metaloproteinase de matriz MMP9 e expressão em células de CXCL14 22Rv1 e 22Rv1 shLTR1 + 2 células. Enquanto nós não encontraram diferenças na expressão de mRNA MMP9 nestas linhas celulares (dados não mostrados), expressão CXCL14 foi significativamente reduzida nos 2 células 22Rv1 shLTR1 +

RNA total do controle 22Rv1 e 22Rv1 shLTR1 + 2. foram analisados ​​para os níveis de citocinas indicadas por qRT-PCR de expressão de ARNm. Os dados foram normalizados contra três genes de limpeza (GAPDH, TBP, RLP13).

De Novo A infecção de próstata estromal de fibroblastos com Replication XMRV competente Diferenças induzida em citocinas Expressão

Para analisar se o diferenças observadas na expressão de citocinas e liberação é tipo de célula dependente, analisamos a expressão das citocinas e solte em fibroblastos estromais da próstata (PRSC) infectadas com a replicação do XMRV competente derivadas de células LNCaP transfectadas com DNA pró-viral XMRV VP62. CARP foram isoladas a partir de tecido de próstata por colagenase Digest e cultura em meios selectivos como descrito recentemente [28], [29]. Outgrowing células foram expandidas e confirmada através de coloração de FACS para a expressão de α-SMA (actina de músculo liso) e vimentina (marcadores de fibroblasto do estroma activado) e a falta de expressão de citoqueratina [28]. Somente os números baixos de passagem destas células foram usadas em experiências de infecção XMRV. 2d sobrenadante infecção passada de XMRV infectado PRSC ou células infectadas simuladas foi aplicado a uma membrana matrizes de anticorpos comerciais (RayBio; veja a Figura S4). XMRV infecção das células foi confirmada por PCR específica XMRV mordaça (dados não mostrados). Dos 60 citocinas analisadas por matrizes de membrana de anticorpos oito (GRO, GROa, Timp1, TIMP2; HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13) foram diferencialmente expressos pelo XMRV infectados em comparação com zombar células infectadas. Enquanto transcrições GRO e GROa foram-se regulamentada em sobrenadante de células infectadas PRSC XMRV, HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13, TIMP1 e TIMP2 expressão foi reduzida.

Para confirmar os resultados obtidos por matrizes de anticorpos de citocina e de excluir diferenças na preparação de células de fibroblastos estromais da próstata primário, foi realizada em tempo real quantitativo experiências de PCR utilizando duas linhas de fibroblastos do estroma obtidas a partir de diferentes CARP pacientes diferentes (Figura 5). As células foram infectadas com o sobrenadante de cultura contendo a replicação competente XMRV derivada a partir de células LNCaP transfectadas com ADN proviral XMRV VP62 [30], [31]; ARN total foi extraído, ADNasel tratado e, subsequentemente, analisadas por qRT-PCR para as diferenças na expressão de citoquinas. Enquanto nós fomos capazes de confirmar nossos resultados obtidos pela matriz Ab para GROa, IL13 e TIMP1, não fomos capazes de confirmar nossos dados preliminares para TIMP2, HGF e IGFBP4. TIMP2 e IGFBP4 expressão aumentada em resposta à infecção XMRV e indução de expressão de HGF foi observada apenas em células PrSc29, enquanto que as células PRSC5 mostrou o efeito oposto.

próstata primário do estroma fibroblastos (CARP) foram infectadas com sobrenadante de XMRV contendo LNCaPi células ou com sobrenadante simulada. O ARN total foi analisado para níveis de expressão de mRNA de diferentes citocinas por qRT-PCR. Os dados foram normalizados contra três genes de limpeza diferentes e ilustrado como expressão gênica relativa em comparação a zombar células infectadas em cada momento individual.

citocinas libertação dependente em XMRV Replication Influências Invasividade and Tube Formação in vitro

Para obter um entendimento mecanicista das diferenças observadas na liberação de citocinas de epiteliais ou do estroma células da próstata infectadas com o XMRV, vários estudos in vitro foram realizados. Não foram observadas diferenças na proliferação celular entre infectados (controle 22Rv1 shRNA e 22Rv1 shLTR1 + 2 ou PRSC células infectadas e PRSC aplicando um ensaio MTT (Figura S1) não infectados. Em seguida, investigou-se as células XMRV infectado poderia promover a migração de células LNCaP de um modo parácrino. fibroblastos estromais da próstata primário, quer simulada ou XMRV infectadas foram semeadas no compartimento inferior de um prato de câmara 24 Transwell. por meio de uma membrana permissiva libertado citocinas afectam directamente a invasividade de células LNCaP. Utilizando este ensaio foi realizado um curso em uma infecção XMRV, mostrado na Figura 6A. infecção XMRV dos resultados do estroma de fibroblasto em aumento estatisticamente significativo de migração de células LNCaP, que está além disso aumentada nas células infectadas por longo período de tempo (28 dias). Este aumento é específico para XMRV uma vez que uma MLV relacionada (MoMCF, um MLV anfotrópico usando PIT2 como receptor) não resultou em maior quantidade de migração de células LNCaP (Figura 6B). Interessantemente, a replicação do vírus incompetentes como partículas pseudotipado com env XMRV não resultou num aumento da migração de células LNCaP (Figura 6B ) sugerindo que eventos independentes da ligação ao receptor e sinalização contribuir para o fenótipo observado.

(a) fibroblastos estromais primárias (PRSC) 8d ou 28d pi com XMRV foram semeadas no compartimento inferior de uma câmara de invasão. Invasividade de células LNCaP foi calculada em três experiências independentes realizadas em duplicado. células (B) PRSC infectadas com MLVs xenotr�ico (XMRV) induzir a invasão de células cancerosas da próstata in vitro, enquanto as células do estroma infectadas com anfotr�ico MoMCF ou XMRV env vírus pseudotipado como partículas não aumentam invasão de células LNCaP. infecção XMRV (C) e (D) induz a formação de tubos de células HMEC. As células cultivadas sobre Matrigel foram incubadas com o sobrenadante de ambos os XMRV ou fibroblastos estromais infectadas simuladas e formação do tubo foi seguida durante 5 h. imagem representativa de formação do tubo observada é mostrado em (C). (D) Quantificação de duas experiências independentes realizadas em triplicado. Imagens de três diferentes campos visuais por poço foram analisadas para comprimento do tubo (20 tubos por campo), utilizando a ferramenta régua Adobe Photoshop

Além disso, foram realizados ensaios in vitro angiogênese:. A formação do tubo foi analisada utilizando sobrenadantes a partir de qualquer XMRV ou zombar células infectadas como um estimulante como eles continham diferencialmente expressos /ou diferentes níveis de citocinas pró-angiogénicos. O sobrenadante da cultura de fibroblastos estromais da próstata foi adicionado às células HMEC sobre a formação de matrigel e o tubo foi seguida durante 5 horas. Mudanças na libertação de citoquinas em resposta à infecção XMRV aumentou significativamente o comprimento da rede capilar formadas pelas células HMEC (Figura 6C e D), que está de acordo com os nossos resultados in vivo.

Discussão

Nosso estudo demonstra que gammaretroviruses xenotr�icas, que têm sido frequentemente identificado em linhas celulares de cancro, estabelecidos pela passagem aqueles que ratinhos nus, não só suportar o risco de infecção, mas também pode influenciar significativamente os dados experimentais receberam com estas linhas celulares. Em particular, a linha celular de cancro da próstata 22Rv1 comumente utilizados no cancro da próstata in vitro, bem como in vivo em modelos de xenoenxerto transporta várias cópias de XMRV integrado e activamente lança vírus infeccioso no seu sobrenadante.

XMRV foi originalmente identificada nas tecido de cancro da próstata humano e sua associação com patologias humanas tem sido sugerido nos últimos anos. Os dados recentes que sugerem uma recombinação de sequências de rato XMRV dois ancestrais, chamada Pré-XMRV1 e Pré-XMRV2, em cultura de células gerando assim XMRV [7], juntamente com vários estudos não detecção de sequências de XMRV em amostras de humanos [11], [12], [ ,,,0],14], [17], [18], [20], [32], [33], [34], [35], [36], [37] questionar uma associação de XMRV com doenças humanas.

Ainda, a análise de potencial de transformação XMRV é de interesse significativo desde 22Rv1 células e células CWR22-R1 produzir vírus infecciosos e são um modo geral aceite modelo in vitro, bem como o modelo de xenoenxerto para estudar a tumorigénese cancro da próstata, progressão, os biomarcadores e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.

neste estudo actual foi gerada uma linha celular 22Rv1 com transcritos XMRV reduzidas e níveis de proteínas virais através da aplicação de segmentação shRNAs duas regiões diferentes na região de XMRV LTR. experiências in vivo mostraram que os tumores induzidos por células 22Rv1 com transcritos XMRV reduzidos eram altamente necrótico e mostrou significativamente menos vascularização, tal como avaliado por coloração de CD34 (Figura 3) e uma CEACAM-coloração (dados não mostrados). Para excluir a seleção local de integração, bem como shRNA fora do alvo afeta estes experimentos foram repetidos usando experimentos independentes infecção 22Rv1 LEGO-shXMRV LTR, bem como o uso de diferentes sequências shRNA alvo uma terceira região em XMRV (shLTR3). Em contraste com as experiências usando células 2 22Rv1 shLTR1 +, não foram observadas diferenças significativas no tamanho do tumor que pode ser devido ao pequeno número de animais por grupo. Alternativamente, as diferenças observadas no tamanho do tumor no primeiro conjunto de experiências de xenotransplante utilizando sequências shRNA visando as regiões LTR 59-79 e 103-125 poderia ser uma consequência dos chamados efeitos fora do alvo nas células. Salientamos que, em vez de shRNA contra luciferase ou outras sequências geralmente não encontrados no genoma humano, um vector lentiviral vazio foi usado para gerar sobrenadante de controlo lentiviral subsequentemente utilizado para transduzir células 22Rv1. Assim, não podemos excluir a saturação dos componentes da maquinaria siRNA resultando em efeitos inespecíficos. No entanto, não se observou qualquer fenótipo, aumento dos níveis de apoptose, reduziu a viabilidade das células, que foi descrito para ser correlacionada com efeitos não específicos causadas por saturação da via siRNA [38]. Off-alvo efeitos foram descartados, repetindo os experimentos com animais com um terceiro, região diferente no genoma XMRV como uma seqüência shRNA.

Sem formação de metástases no pulmão, baço e fígado, bem como metástase óssea foi detectada em ratinhos de controlo, bem como ratinhos shLTR (dados não mostrados). Além disso, os tumores não variou no estado de diferenciação, a organização das células do estroma nem os tumores apresentam diferenças na infiltração de leucócitos, refletida pela presença relativa de CD18

+ leucócitos (dados não mostrados). Curiosamente, ambos conjunto de experiências de xenoenxerto (shLTR1 + 2, bem como shLTR3) revelou reduzida vascularização e áreas de necrose aumentadas. Uma vez que não criar um vírus XMRV com um site de destino alterado das shRNAs aplicadas que poderíamos usar para complementar 22Rv1 células transduzidas com shLTR3, é possível que o observado in vivo e in diferenças in vitro dessas células são uma consequência de ler ou XMRV recombinante e transcritos celulares.

estudos recentes têm sugerido funções importantes de citocinas em vários aspectos do crescimento do tumor. A maioria das citocinas identificados nos ensaios foram descritos para influenciar a formação microambiente do tumor durante a tumorigénese da próstata. GRO /GROa (CXCL1), um membro da família quimioquina CXC, promove a angiogénese e recruta neutrófilos e células endoteliais durante a progressão maligna de cancro da próstata. A expressão aberrante de HGF (factor de crescimento de hepatócitos) e o seu receptor, c-Met, muitas vezes se correlacionam com estados avançados do cancro da próstata. Da mesma forma, IGFBP2 e 4 (insulina como fator de crescimento de proteínas de ligação 2 e 4) são biomarcadores para estágios avançados de câncer de próstata. inibidores teciduais das matrixmetalloproteinases (TIMP) têm independentemente da sua função – inibir a actividade de proteinase da MMP (matrixmetalloproteinases) foram descritos como factores envolvidos na progressão tumoral: TIMP 1 e 2, tanto inibir a apoptose de células de tumor; TIMP 1 promove a angiogénese de tumores e o TIMP 2 acelera a progressão do tumor

induzida por XMRV libertação de citocina não parecem ser células epiteliais de tumor específico mas também pode ser observada usando fibroblastos estromais da próstata (figura 5; S4).. Gostaríamos de salientar que nestas experiências XMRV stocks virais derivadas de células LNCaP transfectadas com proviral XMRV DNA VP62 foram utilizados. Nós não sequenciar a população de vírus derivado de células LNCaP infectados de novo para descartar de forma aguda transformando variantes XMRV derivados por eventos de recombinação como recentemente publicado [39].

infecção XMRV de fibroblastos do estroma resultou em aumento estatisticamente significativo de migração As células LNCaP, que foi, além disso, um aumento nas células infectadas por longo período de tempo (28 dias). Este aumento pode ser específico para XMRV e depende da replicação do XMRV: um relacionada MLV (MoMCF, um MLV anfotrópico PIT2 utilizando como receptor) não resultou em valores mais elevados de células LNCaP que migram (Figura 6B). Curiosamente, o sobrenadante das células infectadas com partículas pseudotipados replicação defeituosa XMRV-env não resultar em alterações de migração celular, sugerindo que a ligação não contribui para as alterações observadas receptor.

De um modo geral, as nossas observações estão em concordância com alguns aspectos dos dados recentemente publicados que mostram que a infecção de células LNCaP XMRV promove a proliferação, capacidade de invasão e de transformação destas células in vitro [40], bem como foi recentemente demonstrado que a infecção XMRV pode induzir a apoptose em algumas linhas celulares humanos [41]. Enquanto observamos também um aumento na capacidade de invasão das células quando incubadas com sobrenadante de cultura de células XMRV infectado, não observamos um aumento de proliferação devido à infecção XMRV, nem 22Rv1 células transduzidas com shRNAs transcrições alvo XMRV (Figura S1) nem células LNCaP ou células estromais infectadas com o XMRV (dados não mostrados) mostrou uma diminuição ou aumento na taxa de proliferação

não observamos diferenças nos níveis de mRNA MMP9 como uma consequência da infecção XMRV como recentemente publicado [40].; embora tenha sido observado uma redução de liberação TIMP2 de células infectadas com o PRSC XMRV. Desde MMP são regulados principalmente nos níveis de proteína, não podemos excluir diferença na actividade MMP9. matrizes de anticorpo citocina usadas aqui não incluiu MMP9 ou MMP2, assim como nós não incluem técnicas zimografia para testar diferenças na atividade da proteína MMP9 ou MMP2. Entende-se que a taxa e a extensão da angiogénese é um componente crítico da progressão do tumor. O mecanismo exato pelo qual XMRV pode afetar a angiogênese, formação de vasos e as diferenças na liberação de citocinas não é compreendido.

Retrovirus contaminação parece ser freqüente entre linhas celulares amplamente utilizados [11], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. A presença desconhecido de retrovírus em linhas celulares de lado o risco de risco biológico podem afetar os resultados de experimentos. Estudos recentes demonstram claramente que as linhas de células humanas, incluindo linhas celulares de cancro da próstata comumente transportar sequências gammaretroviral [6], [20], [48]. Para algumas delas a formação de partículas infecciosas tem sido demonstrado que: A linha de células T humanas Jurkat J6, linfoblastóide A3.0 linha celular /F7 [47], a linha celular B-DG75 [45] e as linhas celulares de cancro da próstata LAPC4, VCaP e EKVX [6], [48]; No entanto, em apenas alguns exemplos a consequência sobre o resultado experimental tem sido demonstrada [44], [47], [49]. Concluímos que os resultados experimentais obtidos in vitro ou in vivo realizados com linhas de células positivas de retrovírus (em particular 22Rv1 ou CWR-R1) pode reflectir propriedades moleculares do vírus, em vez de características específicas do tipo de célula. Portanto, o status retroviral de linhas celulares usadas em experimentos devem ser fornecidas, bem como estudos (incluindo xenoenxerto in vivo) devem ser validados usando várias linhas celulares.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

O linhas celulares de cancro da próstata humano LNCaP (ATCC # CRL-1740) e 22Rv1 (ATCC # CRL-2505) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10% de FCS, 5% de penicilina /estreptomicina e L- glutamina. Condições semelhantes foram aplicadas a shRNA tratada 22Rv1 células. TE671 (ATCC # CRL-8805) e células 293T (ATCC # CRL-11268) foram cultivadas em DMEM Glutamax (Gibco) suplementado com 10% de FCS, 5% de Penicilina /Estreptomicina. células HMEC (Lonza) foram cultivadas em células endoteliais Meio de Crescimento MV2 (PromoCell). linhas celulares de estroma (CARP) foram estabelecidas como descrito [29], [50], [51].