Abstract

Glioblastomas (GBM) pode conter uma proporção variável de células-tronco cancerosas ativas (CSCs), capazes de auto-renovação, de agregar em CD133

neurospheres +, e desenvolver tumores intracranianos que fenocópia os originais. Nossa hipótese é que nucleostemin pode contribuir para a biologia das células estaminais câncer como essas células compartilham características com as células-tronco normais. Aqui mostramos que nucleostemin é expressa na membrana basal glomerular-CSCs isoladas a partir de amostras de pacientes, e que a sua expressão, inversamente ao que foi descrito para as células estaminais normais, não desaparece quando as células são diferenciadas. O significado da expressão nucleostemin em CSCs foi abordada por alvo o mRNA correspondente usando lentivirally transduzidas RNA curto hairpin (shRNA). Ao fazê-lo, encontramos um off-alvo nucleostemin RNAi (shRNA22) que suprime a proliferação e induz a apoptose em GBM-CSCs. Além disso, na presença de shRNA22, MBG-CSCs não conseguiu formar neuroesferas

in vitro

ou crescer em agar mole. Quando estas células são xenotransplantadas no cérebro de ratos nus, o desenvolvimento do tumor é significativamente retardada. Foram feitas tentativas para identificar o alvo principal /s de shRNA22, sugerindo um fator de transcrição envolvido em uma das MAP-quinases ou alvos múltiplos-vias de sinalização. O uso deste shRNA pode contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para esse tipo de tumor cerebral incurável

Citation:. Gil-Ranedo J, Mendiburu-Eliçabe M, García-Villanueva M, Medina D, del Álamo M, Izquierdo M (2011) Um Off-alvo Nucleostemin RNAi inibe o crescimento in Human células-tronco cancerosas Glioblastoma-Derived. PLoS ONE 6 (12): e28753. doi: 10.1371 /journal.pone.0028753

editor: Keith L. Black, Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de junho de 2011; Aceito: 14 de novembro de 2011; Publicação: 12 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Gil-Ranedo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos de: Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF 2009-07259) Espanha, e Fundación Eugenio Rodriguez Pascual (Madrid). O Centro de Biologia Molecular S.O. é também o destinatário de um subsídio institucional do Areces Fundação Ramón. JG-R foi o destinatário de uma bolsa predoctoral do Gobierno Vasco, Espanha. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o glioblastoma multiforme é um dos mais maligna e comum de todos os tumores astrocíticos [1]. O padrão de crescimento de GBM é altamente infiltrativa, tornando a cura cirúrgica muito difícil e resultando em resultados de sobrevivência muito pobres que melhoraram apenas marginalmente nas últimas décadas [2]. A hipótese de células-tronco do câncer sugere que os tumores são organizados em uma hierarquia com uma subpopulação de CSCs responsáveis ​​pela progressão do tumor, manutenção e reincidência [3]. As células com propriedades de haste-como foram inicialmente identificados na leucemia mielóide aguda [4], e na actualidade a sua existência foi confirmada no cancro da mama [5], meduloblastoma e glioblastoma [6], o cancro da próstata [7], o melanoma [8], [9], de cabeça e pescoço câncer de ovário carcinomas escamosos [10], câncer de cólon [11], de câncer pancreático [12] e cancro do pulmão [13], entre outros. Em glioblastoma, recidivas, normalmente, seguir o tratamento, provavelmente porque CSCs são altamente infiltrativa, seletivamente resistente a radioterapias, quimioterapias [14], [15], [16], imunoterapias [17], e promover atividade angiogênica. Além disso, as terapias de quimioterapia e radio- pode primos CSCs de tumores cerebrais para melhorar suas características de células-tronco semelhantes [18]. Esta população de CSCs é altamente tumorigénicas e fenocópia do tumor original em modelos de xenoenxerto de roedores [19], [20]. Abordagens para forçar CSCs para diferenciar para células com ou sem atributos limitados, a divisão celular, expondo-os a proteínas morfogenéticas ósseas, por exemplo, foram usados ​​para torná-los mais vulneráveis ​​a terapias convencionais, e mostrou eficácia considerável nos modelos de ratos [21]. Compreensão da biologia básica das células-tronco do câncer é uma característica fundamental antes de passar para tratamentos putativos para eliminá-los.

Nucleostemin é uma proteína de ligação GTP, assim chamado por causa de sua localização nucleolar e expressão preferencial em células-tronco [22 ]. Embora a proteína é predominantemente presente em células estaminais embrionárias e adultos, que também é expresso em várias linhas celulares transformadas e tumores [23], [24]. Nucleostemin, por outro lado, é abruptamente sub-regulada durante a diferenciação antes da divisão celular de terminal. Esta proteína foi identificada pela primeira vez em ratos adultos células estaminais neuronais, e tem sido implicada na progressão do ciclo celular [22]. Várias proteínas de ligação nucleostemin foram identificadas, incluindo p53, MDM2 e telomérica de ligação ao factor 1 (TRF1) repetição [22], [25], [26]. Alterações nos níveis de expressão nucleostemin causar uma diminuição na taxa de proliferação de células, em ambos os modos dependentes e independentes de p53, [22], [26] – [28]. A proteína é indispensável para a embriogénese precoce [29], mas é também importante nas células estaminais neuronais adultas [30]. Alguns estudos têm mostrado que a depleção de nucleostemin está associada com uma capacidade limitada tanto tumorigénico em células HeLa e células PC-3 [31], [24]. Ao lado de sua implicação na regulação da proliferação celular, vários papéis adicionais foram atribuídos a nucleostemin como a regulação comprimento dos telômeros, promovendo a degradação do TRF1 [25], o processamento de pré-rRNAs [32] e manutenção da arquitetura nucleolar [33].

a nossa intenção era explorar o papel da nucleostemin em humanos GBM-CSCs usando lentivirally transduzidas hairpin RNAs curtos (shRNA) para reduzir severamente a sua presença nas células. Os CSCs empobrecido de expressão nucleostemin (shRNA18) não resultou na redução profunda da proliferação celular e aumento da apoptose que esperávamos. Em vez disso, um lentivírus fora do alvo (shRNA22) proliferação abolida, auto-renovação e sobrevivência das CSCs. Além disso, a presença deste shRNA atraso significativo CSCs capacidade tumorigénica quando xenoenxerto em cérebros de ratos nus.

Resultados

A expressão de nucleostemin em duas linhas de células-tronco cancerosas humanas com glioblastoma derivados

Duas culturas enriquecidas em células-tronco do câncer foram obtidos a partir de amostras de tumores cerebrais humanos (amostras CSCs-5 e CSCs-7). Ambas as linhas celulares cresceu exponencialmente e formou neurospheres mesmo quando semeadas a baixa densidade, indicando uma forte capacidade de auto-renovação. As neuroesferas foram positivos para CD133 (Fig 1A;. Verde), nestin (Fig 1A;. Vermelho), Sox2 (Fig 1B;. Verde) vimentina (Fig. 1B; vermelho), e nucleostemin (Fig 1B;. Rosa) neural marcadores de células estaminais. Nucleostemin estava presente no núcleo de 88% das CSCs-5 e CSCs-7 células, como determinado por ensaios de imunofluorescência (Fig. 1C). Uma grande percentagem de células (76%) também foram positivos para CD133, e percentagens ainda mais elevadas foram obtidas para nestina, vimentina e Sox2 (mais de 95%), este último envolvido no auto-renovação e proliferação de células estaminais. CD15 foi um marcador para 54% dos CSCs-5 e 69% para CSCs-7. O multipotência destas duas culturas foi demonstrada como as neuroesferas cultivadas em meio indutor de diferenciação exibida diferenciação típico morfológicas em relação a todas as três linhagens neurais – astrocíticos, neuronal e oligodendrocíticos, tal como avaliado pela positividade para β-III-tubulina [34] e MAP2 ( neuronal) (Fig. 1D vermelho e S1 vermelho), GFAP (astrócitos) (Fig. verde 1D) e NG2 (precursor oligodendrocíticos) (Fig. S1 verde) antígenos respectivamente. No entanto, as células diferenciadas não solta expressão de nucleostemin (Fig. 1E), apesar de não expressam qualquer um dos outros genes relacionados stemness (dados não mostrados). As análises de cariotípica mostrou várias alterações que reflectem a actividade transformadora, e os ensaios clonogenicidade em agar mole indicou desenvolvimento de muitas colónias.

A. CSCs-5 e CSCs-7 neurospheres expressam CD133 (verde) e nestina (vermelho). Barra de escala: 50 ^ m. B. CSCs-5 e CSCs-7 células que mostram a expressão e localização celular de Sox2 (verde), vimentina (vermelho) e nucleostemin (roxo). Barra de escala: 10 mm, e enredo quantitativa (C) dos marcadores de células tronco CD133, nestina, vimentina, Sox2, nucleostemin e CD15 em CSCs-5 (cinza) e CSCs-7 (verde). D. Neuron (β-III-tubulina, rosa-vermelho) (GFAP, verde) capacidade e astrocitário diferenciação das CSCs-5 e CSCs-7. Barra de escala: 50 ^ m. expressão E. Nucleolar nucleostemin no tronco ou differentiatiated CSCs-5 (cinza) e células CSCs-7 (verde). F. A ressonância magnética de

in vivo

tumores desenvolvidos a partir de CSCs-5 e CSCs-7 (setas amarelas apontam para o tumor), e análise de sobrevivência de Kaplan-Meier (G) de ratos immunodeficent, após CSCs-5 (vermelho) ou CSC-7 (verde) xenotransplantes ortotópicos.

em seguida, explorou o potencial de ambos CSCs-5 e CSCs-7 para formar tumores após xenogratf ortotópico em cérebros de ratos immunodeficent. Após a injecção de 5 × 10

5 células intra-cranial, ambas as linhas de células formadas grandes tumores em 100% dos casos (n = 12 para os CSCs-5 e 11 para os CSCs-7), seguido por imagem de ressonância magnética (MRI) (Fig. 1F). Os tumores eram altamente infiltrante (Fig. S2). Explantes dessas gliomas foram serialmente transplantadas para os cérebros de outros ratos nus e tumores letais gerados que foram igualmente enriquecidas em CSCs, demonstrando uma alta capacidade de auto-renovação. Os tempos de sobrevivência médios dos anfitriões foram 60 ± 4 dias, com CSCs-5 e 81 ± 11 dias para os CSCs-7 células (Fig. 1G). análises histopatológicas de xenoenxertos mostraram as características gerais característicos de GBM, como pseudopalisade e necrose focal, celularidade alta, alta expressão do EGFR e do índice proliferativo elevado (MIB-1). Pacientes e amostras de xenoenxertos de mostrar os níveis de expressão semelhantes para todos os marcadores, incluindo o meio de baixa expressão (paciente /xenoenxerto 7) para a p53 (paciente /xenoenxerto 5) e, muito baixa e, se for o caso, para a p16 (Fig. S3). Os resultados mostram que os tumores transplantados nos ratos foram fenocópias dos tumores original do doente.

Caracterização dos shRNAs concebidos para direccionar nucleostemin humano

O gene nucleostemin tem 15 exões, e à medida que sofre splicing alternativo produz três transcritos de ARNm diferentes. Excepto para o exão 1, estas variantes possuem sequências semelhantes. Portanto, para a concepção de primers específicos para knock-down todas as três variantes, optámos primers em locais comuns de exons 4, 10, 13 e 15 (Fig. 2A). Nós alvo nucleostemin por infecção com lentivírus expressando shRNA contra a proteína nucleolar. Cinco shRNAs diferentes, com sequências complementares perfeito no mRNA nucleostemin humanos foram introduzidas para CSCs-5 e células CSCs-7. Três dos cinco shRNA foram escolhidos para posterior caracterização: shRNA18, shRNA20 e shRNA22. A análise de mancha de RT-PCR e Western revelou que enquanto shRNA18 causou uma redução significativa no ARNm nucleostemin (78%) e os níveis de proteína (51%), ambos shRNA20 e shRNA22 não parecem afectar os níveis de mRNA e proteína, quando normalizado para o respectivo correspondente GAPDH (ARNm) e controlos de actina (proteína) (Fig. 2B). Os resultados sugerem off-meta vinculativa de ambos shRNA20 e shRNA22. Em alternativa, relativamente menores reduções de níveis de mensageiro alvo nucleostemin via efeito poderia ter efeitos dominantes em um ensaio, se a saída da dose é muito sensível a níveis desta proteína particular. Concebemos um ensaio, com base na formação de colónias em agar mole, para distinguir entre as duas possibilidades. A expressão de shRNA18 em CSCs-5 ou CSCs-7 não inibe a formação de colónias em agar mole, enquanto que a expressão de shRNA22, e em menor grau shRNA20, reduziu drasticamente o número de colónias que cresceram neste tipo de forma (Fig 2C. E 2D). Se shRNA22 estava causando uma pequena redução na mensagem nucleostemin, e isso desencadeou uma maior inibição do crescimento, porque a via envolvida era muito sensível a reduções do nível de menores do messenger ou proteína, devemos esperar um efeito semelhante quando as células ou são infectados com shRNA18 sozinho, ou quando as células são infectadas com simultânea tanto shRNA18 e shRNA22. Isto é, um grande número de colónias em crescimento. Por outro lado, se um verdadeiro efeito fora do alvo foram operando aqui, o resultado desta combinação seria o contrário, como o alvo real seria diferente do nucleostemin, e nós observar como algumas colónias que crescem em agar mole como as observadas quando shRNA22 foi usada sozinha. A infecção de células com um lentivírus não transportando um shRNA foi utilizada como um controlo. A medição do número de CSCs-5 colónias formadas em agar mole após diferentes tratamentos combinados deu os seguintes resultados (Figura 2E.): Um elevado número de colónias para o controlo shRNA (shRNACo) e para a combinação shRNACo + shRNA18, como esperado e um baixo número de colônias, tanto para shRNACo + shRNA22 e shRNA18 + shRNA22. Executar esta experiência, fomos capazes de discriminar entre as possibilidades de todos os shRNAs segmentação nucleostemin a diferentes graus ou, o shRNA22 ter um destino diferente. Se o efeito era devido ao baixo nível de inibição, a co-expressão do shRNA18 e shRNA22 deve mascarar o efeito do último, uma vez que iria inibir shRNA18 mais forte a expressão do gene nucleostemin. Por outro lado, se o efeito fora do alvo foi, gostaríamos as consequências de shRNA22 independentemente da expressão de shRNA18. Os resultados mostram claramente que induz o seu efeito shRNA22 independentemente da expressão de shRNA18, indicando que é devido a um efeito fora do alvo. Nós, portanto, descartou a hipótese de uma redução muito menor de nucleostemin por shRNA22 tendo um efeito negativo dominante no crescimento celular. Nós acreditamos que o efeito de inibição do crescimento de shRNA22 em agar mole é devido a um

bona fide

off efeito alvo.

A. Representação esquemática das variantes de transcritos 3 nucleostemin e exões. Pontas de seta apontar para cada um projetado shRNA. B. mRNA Nucleostemin (vermelho) e proteína (azul) quantificação em CSCs-5 tratado com shRNACo, shRNA18, shRNA20 e shRNA22. C. shRNAs efeito sobre CCC-5 e CCC-7 capacidade de formação de colónias em agar mole, e a sua análise quantitativa (D). E. macias contagens de colónias de agar em duplas infecções para determinar a nucleostemin-especificidade do shRNA22. ** P ≤ 0,05; *** P≤0.001.

Depleção de nucleostemin por shRNA18, não reduziu significativamente a população de células na fase S, tal como indicado pelo nível de absorção de BrdU após um pulso de 15 min-(Fig. 3A) ou a população total de células em divisão capturado por um tratamento de 20 horas com BrdU (Fig. 3B). Os outros dois shRNAs: shRNA20 e shRNA22, possuindo um muito baixo, se existir, a inibição da expressão, exibida uma percentagem consistentemente mais baixa de células em fase S e de ciclismo. Como demonstrado por ensaios da curva de crescimento, o número total de células infectadas com o lentivírus de controlo sem inserção shRNA-expressando (shRNACo) aumentou várias vezes ao longo de seis dias. As células shRNA20 ou shRNA22 infectadas não aumentaram em número, ou mesmo diminuir consideravelmente (Fig. 3C e 3D), enquanto CSCs infectadas com shRNA18 se comportou muito mais perto de controlar células do que shRNA20 e shRNA22. Os resultados sugerem uma implicação da meta primária de shRNA22, e um ligeiramente menor grau ao shRNA20 atingido, na sustentação do crescimento e sobrevivência do ser humano GBM-CSCs. Nós não estamos certos sobre shRNA20 e shRNA22 compartilhando um alvo primário, apesar da proximidade física das sequências originais shRNA20 e shRNA22 no gene nucleostemin. Apesar de apenas 66 nucleotídeos separar estas duas sequências, uma busca de alinhamento sequência humana tendo em conta os 66 nucleotídeos entre eles não revelou qualquer jogo além nucleostemin.

A. Número de fase-S ou-ciclismo total (B) CSCs-5 (cinza) e células CSCs-7 (verde) tratados com os diferentes shRNAs. C. número de células viáveis ​​no DIV 0, 3 e 6 nos CSCs-5 e CCC-7 (D) tratados com as diferentes shRNAs. ** P ≤ 0,05; *** P≤0.001.

O shRNA20 e shRNA22 off-alvo, induzir a apoptose preferencialmente em CD133 CSCs + e prejudica a formação neurosphere

A presença destes shRNAs afectam não só a proliferação celular mas também a sobrevivência celular. Foram quantificados a percentagem de células em apoptose em ambos os CSCs-5 e 7 populações seguintes shRNACo, shRNA18, shRNA20 e infecção lentiviral shRNA22. 7-AAD /anexina V-coloração revelou um apoptose preferencial em CD133

+ células em ambos os CSC-5 e 7 populações (Fig 4A e 4B.); os valores relativos em relação aos controlos para os CSCs-5 e CCC-7 são apresentados na Tabela 1. Além disso, a percentagem de CD133

+ células é reduzida em ambos os CSCs-5 e CSCs-7 após a infecção populações lentiviral shRNA20 e shRNA22 (Fig. S4). Estes resultados sugerem que o alvo principal da shRNA22 e shRNA20 é um fator de sobrevivência para GBM-CSCs preferencialmente expresso em CD133

+ células.

A. Apoptose induzida por shRNAs em CSCs-5 e CSCs-7 (B) CD133

+ (vermelho) ou CD133

– populações (azul). C. Neurosphere formador de capacidade de CCC-5 e 7-CSCs células (d), tratou-se com as diferentes shRNAs. ** P ≤ 0,05; *** P≤0.001.

A partilha certas características-chave de células-tronco normais, CSCs são capazes de auto-renovação, o que permite a manutenção sustentada desta subpopulação e expansão do tumor correspondente. capacidade de formação Neurosphere após o tratamento com o diferente shRNAs foi medida (Fig. 4C e 4D). Praticamente não há esferas foram formadas por células tratadas com shRNA22 e muito poucos por ShRNA20 trataram células em ambos os CSCs-5 e 7 populações. As neuroesferas desenvolvido em 100% dos grupos de controlo. Estes resultados, juntamente com as nossas observações de que CSCs não conseguiram proliferar e sofreram apoptose, sugerem que o alvo principal da shRNA22 e shRNA20 é necessário para auto-renovação das células-tronco cancerosas glioblastoma.

O shRNA22 fora do alvo reduz significativamente o potencial tumorigénico do CSCs-5

Foi examinado o efeito de infectar CSCs-5 células com lentivírus de controlo ou lentivírus expressando shRNA22. Após a selecção de puromicina, 5 × 10

5 células foram injectadas nos cérebros de ratos nus. Todos os animais portadores de células de controlo, que são as células infectadas com lentivírus vazio, (n = 3) desenvolvido tumores grandes, seguido por ressonância magnética, e morreram em 63 ± 1 dia, não muito diferente de CCC-5 não infectadas (61 ± 4 dias, n = 12). Em contraste, os animais injectados com células que expressam shRNA22 (n = 6), desenvolveram tumores significativamente menores, sendo o volume médio de 148 mm

3, enquanto que o valor médio de tumores que expressam shRNACo eram 358 mm

3 (Fig . 5A e 5B). A trama de sobrevida de Kaplan-Meier indica uma diferença significativa entre o shRNACo e shRNA22 trataram células tumorais, com uma sobrevida média dos últimos de 71 ± 2 dias (Fig. 5C). Assim, a presença e expressão de shRNA22 em CSCs parece ser importante para atenuar a progressão do tumor.

. Quantificação dos volumes dos tumores induzidos com CSCs-5 células tratadas com shRNACo (preto) e shRNA22 (vermelho). B. A ressonância magnética de exemplos representativos de tumores após xenotransplantes ortotópicos em nus de ratos cérebros de células CSCs-5 transportando shRNACo ou shRNA22, e enredo de sobrevida de Kaplan-Meier (C) dos ratos inoculados com immunodeficent CSCs-5 (simulada, cinza ), as células que transportam shRNACo (preto) e shRNA22 (vermelho). *** P≤0.001.

O efeito da shRNA22 não parece ser exclusivo para CSCs

Temos uma tentativa de determinar o efeito da shRNA22 em células de glioma sem CD133

+ propriedades estaminais, tais como linhas celulares de glioma humano U87MG e U373MG. Nós avaliamos o seu potencial clonogênica por ensaio em agar mole seguinte shRNACo e shRNA22 infecção lentivírus. Observou-se uma redução significativa no número médio de colónias quando shRNA22 foi expressa em U373MG (até 1%), e em menor extensão quando na linha de células U87MG glioma (até 41%) (Fig. 6A). Nós também medido a sobrevivência celular por estimar a percentagem de células apoptóticas em ambas as linhas de células U373MG e U87MG seguintes shRNACo, e infecção por lentivírus shRNA22. 7-AAD /anexina V-coloração revelou apoptose preferencial em células U373 num comportamento semelhante para os CSCs. Por outro lado, as células U87MG apareceu pouco resistentes à apoptose (Fig. 6B). Os resultados sugerem que, embora shRNA22 pode atenuar o crescimento tumoral em células de glioma em geral, o seu impacto pode depender do tipo de célula. A constatação de que efeito shRNA22 não se limita a CSCs é importante na concepção de estratégias para eliminar todos os tipos de células cancerígenas que se acumulam um tumor altamente heterogêneo tais como glioblastoma.

A. efeito shRNAs em U373MG (preto) e U87MG (cinza) a capacidade de formação de colónias em agar mole. apoptose B. shRNAs-induzida em U373MG (preto) e U87MG (cinza). ** P ≤ 0,05; *** P≤0.001.

As tentativas de identificar o alvo principal de shRNA22

Realizamos uma pesquisa genômica para sequências, além nucleostemin, com diferentes graus de homologia com shRNA22 nucleótidos. Para isso, utilizou a ferramenta de busca de alinhamento local básico (BLAST) e nós selecionamos quatro candidatos: PCLO, envolvido na liberação neurotransmisor; HSPA13, membro da HSP70 família acompanhante; SEC22C, envolvido no tráfego vesicular; e CNOT1 relacionada com a transcrição e a degradação do mRNA. Dos 21 nucleotídeos, 14 eram uma combinação perfeita em todos os casos, exceto CNOT, com um jogo de 13 nucleótidos. No entanto, nenhum dos quatro candidatos era o alvo principal para shRNA22 como medido por qRT-PCR (dados não mostrados) como não foram observadas diferenças na concentração dos seus das na presença ou ausência de shRNA22 relacionadas com shRNACo ARNm.

Para determinar genome-wide genes diferencialmente expressos nos CSCs-5 após a infecção shRNA22, utilizou-se GeneChip Gene Affymetrix 1,0 ST Sistema de matriz contendo cerca de 28,869 genes humanos, incluindo a região 3 ‘não traduzida (UTR) dos mRNAs que poderiam ser um alvo para a ligação de uma maneira semelhante de ARN de micro (mI). Como resultado, identificou 182 genes regulados negativamente em CSCs-5 tratados com shRNA22 em relação ao shRNACo (Tabela S1). Como esperado, nucleostemin não estava entre os genes regulados por baixo. As tentativas de agrupar os genes com shRNA22 remate por função (baseado em Gene ontologia e dados de sinalização de via) revelou a presença de 26 genes envolvidos na regulação da transcrição entre os genes silenciados, e 56 de ligação de ADN de proteínas (Fig. 7A). A via de transdução de sinal com mais genes regulados negativamente foi a MAPK via quinases (Fig. 7B). Embora os resultados até agora não são conclusivos, uma indicação de que shRNA22 podem estar envolvidos em silenciar um factor de transcrição envolvidos em uma das MAP-quinases-vias de sinalização pode ser sugerido. Alternativamente, múltiplos efeitos alvo são também uma forte possibilidade de shRNA22, de forma semelhante às micro RNAs.

A. Significativa jusante (verde), para cima (vermelho) e todos os regulamentados genes (azul) agrupados por função de processos biológicos, ou por pertencer a vias de sinalização (B) induzidas por shRNA22 em células CSCs-5.

Discussão

as semelhanças e diferenças entre SCs e CSCs têm sido a fonte de muita disputa [35], [36], [37]. CSCs do cérebro se assemelham SCs neurais em termos de fenótipo, sinalização e comportamento in vitro [38], mas não está claro se as CSCs são, de fato,

bona fide

células-tronco. caracterizações experimentais de populações de células-tronco do câncer pode ajudar nessas questões. Em ratos, nucleostemin é altamente expresso no nucléolos do sistema nervoso central SCs, mas não na sua progenia diferenciada, tal como o gene parece ser abruptamente desligado durante a diferenciação antes fases terminais [22]. Nossas observações de nucleostemin sendo expressas, mesmo depois de CSCs foram forçados a se diferenciar em cultura, implica uma nova assinatura para CSCs e uma diferença significativa com SCs, não previamente relatado.

Foi usada uma abordagem RNAi para promover especificamente a degradação do nucleostemin ARNm. Dados anteriores mostraram que a bater-se nucleostemin expressão causou uma diminuição grave da proliferação celular em células cancerosas da bexiga [39] e reduziu a capacidade de formação de esfera em células estaminais humanas do cancro da mama [40]. Uma redução significativa na progressão do ciclo celular em diferentes tipos de tumores cerebrais humanos e em linhas celulares derivadas de glioblastoma humanas também foi relatada [41]. No entanto, verificou-se que o único shRNAi que reduz eficazmente a proteína, não suprime a progressão do ciclo celular, não diminui o crescimento de culturas CSCs, e não diminui o número de colónias formadas em agar mole, em comparação com os controlos infectados com um vazio lentivírus. As discrepâncias pode ser devido a diferenças nos níveis batendo-down de nucleostemin obtidos em relatórios anteriores (superior a 75% e, por vezes, mais de 90%) e dos EUA (51%).

tecnologia de RNAi tem sido amplamente utilizada em células de mamífero para suprimir o nível de expressão de genes individuais, contribuindo assim para definir os papéis funcionais de genes, particularmente em doenças. Muito trabalho tem centrado em torno de algoritmos de design shRNA, com foco na especificidade gene-alvo e eficiência [42], [43]. Não obstante os efeitos fora do alvo são generalizados, e shRNAs individuais têm sido mostrados para regular negativamente um ou vários outros genes “indesejadas” [44], [45], por vezes, por ligação de uma micro (MI) forma ARN semelhante ao três ‘UTRs de ARNm [46]. Descobrimos que shRNA22 é vinculativo a outros /s do que o gene alvo pretendido. efeitos fora do alvo através de estudos de ARNi anteriores foram mediados por complementaridade parcial entre shRNAs e 3 ‘UTRs de genes fora do alvo, envolvendo um heptâmero ou hexâmero’ ‘jogo da cadeia shRNA na extremidade 5’ semente final nas posições 2 a 8 ou 2 a 7, respectivamente [46], [47]. O mecanismo é semelhante ao de miARN. Embora a biblioteca BLAST utilizado incluiu os 3’UTRs dos mensageiros, um parâmetro de correspondência de nucleótidos-7 não foi incluído na análise de tela, uma vez que representam um grave relaxamento das condições e um grande aumento na partidas putativos. Um alvo principal comum para shRNA20 shRNA22 e presume-se, como as sequências são apenas 66 nucleótidos no exão além nucleostemin 10. É possível que uma sequência nucleostemin incluindo o shRNA22, a região entre os dois shRNAs e shRNA20 (talvez parcialmente), seria também estar presente em uma outra região genómica, que codifica para uma proteína diferente cuja estrutura secundária do mRNA seria mais acessível para shRNA22 e shRNA20 do que a do ARNm nucleostemin. No entanto, há novos jogos ao lado nucleostemin foram encontrados em uma busca em todo o genoma humano para regiões complementares às sequências de dois shRNA e os nucleotídeos entre eles, realizada utilizando a ferramenta da busca alinhamento local básico (BLAST).

A expressão gênica profiling de CSCs-5 na presença ou ausência de shRNA22 não inequivocamente indicar o seu alvo principal. Em vez disso, múltiplos efeitos alvo são uma possibilidade razoável para este shRNA. O maior número de genes silenciados estava relacionada com a regulação da transcrição quando sucessos foram agrupados por função e sobre-representação de genes envolvidos na via de sinalização MAPK foram regulados negativamente pela expressão shRNA22. A sobre-expressão de um ou mais genes da via de sinalização MAPK é comum em glioblastomas, e várias moléculas pequenas que inibem a via de sinalização da quinase PI3-Akt estão em desenvolvimento clínico. Embora muitas destas moléculas têm sido eficazes em modelos pré-clínicos, não fica claro se sozinho desta estratégia será suficiente para interromper os eventos moleculares iniciada e mantida por sinalização ao longo das vias devido à activação de outras vias que compensam a inibição do alvo quinase. Tentativas têm sido feitas recentemente para identificar genes ou vias cuja inactivação, em combinação com os inibidores de PI3K PX-866 e NVPBEZ-235, pode resultar num fenótipo letal em células de glioblastoma multiforme [48]. O shRNA22 identificado, quando expresso em CSCs de pacientes com glioblastoma, inibe a proliferação de células e de auto-renovação, induz a apoptose e reduz significativamente o seu potencial tumorigénico quando xenotransplantadas no cérebro de ratos nus. O facto de o alvo primário de shRNA22 não está limitado a CSCs é importante, porque quando se tenta eliminar um tumor uma também deve ter como alvo as células do estroma tumoral e microglia porque estas células contribuem para a manutenção e a progressão do tumor. O uso deste shRNA sozinho ou em combinação com outras drogas pode representar uma estratégia terapêutica clínica potencial.

Materiais e Métodos

Declaração de cuidados com os animais

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com a legislação e as orientações para cuidados com os animais e manipulação na Espanha (espanhol Real Decreto 1201/2005 BOE publicada 21 de outubro de 2005), e os da União Europeia (2003/65 /CE do Parlamento Europeu e do Conselho Julho de 2003) . O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade Autónoma de Madrid (autorização associado ao projeto SAF 2009-07259 emitido em Madrid 11

th março de 2009) e pelo Comitê de Biossegurança institucional CBMSO. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia de gás isoflurano, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Declaração de consentimento do paciente

Obtivemos duas novas linhas de células-tronco cancerosas (CSCs-5 e CSCs-7 ) a partir de glioblastoma primário espécimes cirúrgicos de pacientes submetidos à ressecção de glioma recém-diagnosticados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê do y Cajal Hospital Ramón Institucional de Ética. Consentimento informado por escrito para utilizar o excesso de tecido para a pesquisa foi obtido de cada paciente e tecidos de-identificados, para proteger o anonimato, foram utilizados (autorização associado ao projeto SAF 2009-07259, emitida em Madrid a 26

de Fevereiro de 2009, a Espanha .)

Declaração de dados microarray

Todos os dados aqui apresentados é Miame complacente e os dados em bruto foi depositado no banco de dados compatível GEO (número de acesso: GSE30448)

. isolamento de células e cultura

as novas culturas, CSCs-5 e CSCs-7, foram estabelecidos a partir de espécimes cirúrgicos frescas colhidas diretamente da sala de cirurgia em PBS mais 0,6% de glicose e imediatamente transportadas em gelo para a célula sala de cultura e processado como se segue: os pedaços de tumor foram lavadas e finamente picados com uma tesoura pequena, eles foram em seguida incubadas em 0,1% de tripsina e 0,04% de DNase (tipo II, Sigma) em PBS durante 1 h a 37 ° C . tecido digerido foi lavada duas vezes e dissociadas mecanicamente por passagem através de pippetes Pasteur polidas ao fogo.