Abstract

A identificação de CD8

epítopos de células T +, que pode induzir as células T a matar células tumorais é um passo fundamental para o desenvolvimento de uma vacina contra o cancro péptido. POTE proteína é um antigénio do cancro recentemente identificado que se verificou ser expresso numa ampla variedade de cancros humanos, incluindo próstata, cólon, pulmão, mama, ovário e do pâncreas. Aqui, nós determinamos epítopos citotóxicos HLA-A2.1 restrito de linfócitos T (CTL) na proteína POTE, e também projetou epítopos reforçada por aminoácido (AA) substituições. Cinco péptidos 9-mero foram primeiro seleccionadas e a sua afinidade de ligação a moléculas de HLA-A2 foi medida pelo ensaio de ligação de T2. POTE 272-280 e 323-331 POTE mostrou o mais forte afinidade de ligação a HLA-A2. AA péptidos substituídos POTE 252-9V (com valina na posição 9), POTE 553-1Y (por tirosina na posição 1) e POTE 323-3F (com fenilalanina na posição 3) confere maior afinidade para HLA-A2, e respostas de CTL induzidas reactividade cruzada com antigénios de tipo selvagem. Enquanto POTE 252-9V era a mais forte, a este respeito, POTE 323-3F teve o maior aumento na imunogenicidade em comparação com o tipo selvagem. Importante, dois epitopos modificados (POTE-553-1Y e POTE-323-3F) CTLs induzidos que mataram NCI-H522, a HLA-A2-expressando POTE

+ linha de não-pequenas células humanas de câncer de pulmão de células, indicando endógena naturais processamento destes epitopos. Em conclusão, a imunogenicidade de epitopos pote pode ser melhorada por modificação péptido para induzir células T que matam as células de cancro humano. Uma combinação de epitopos POTE 553-1Y e POTE 323-3F pode ser uma estratégia de vacina atraente para pacientes com câncer de HLA-A2 para superar a tolerância induzida por tumores e impedir a fuga

Citation:. Huang YH, Terabe M, Pendleton CD, Stewart Khursigara D, Bera TK, Pastan I, et al. (2013) Identificação e promoção de HLA-A2.1-Restricted CTL epitopos em um New Human Cancer Antigen-POTE. PLoS ONE 8 (6): e64365. doi: 10.1371 /journal.pone.0064365

editor: Vladimir Brusic, Instituto de Câncer Dana-Farber, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Janeiro, 2013; Aceito: 13 de abril de 2013; Publicação: 04 de junho de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Dr. Yi-Hsiang Huang foi apoiada por Taiwan Merit Scholarship (TMS-094-2-B-015) e NCI financiamento interno de o Centro de NCI para Cancer Research, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, Maryland, EUA; e por financiamento do Taipei Veterans General Hospital (V97S5-002, V100C-104 e V101C-147). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a maioria dos cânceres não pode ser curativa ressecado exceto quando detectado precocemente. Outras abordagens não cirúrgicas, tais como a radioterapia ou a quimioterapia, afectam também células normais, resultando em efeitos secundários que limitam o tratamento. Além disso, todos os tratamentos para o cancro recorrente ou metastático são paliativos. Consequentemente, o desenvolvimento de novas abordagens sistêmicas para tratar avançado, o câncer recorrente ou metastático é necessário. A imunoterapia pode ter um grande potencial como um tratamento promissor para pacientes com cancro, devido à sua especificidade e ausência de efeitos tóxicos de quimioterapias. Desde sipuleucel-T tornou-se a primeira vacina licenciada do cancro nos Estados Unidos [1], [2], tem havido muito interesse renovado em vacinas contra o cancro [3] – [5]. Assim, novos antigénios tumorais específicos para determinados tipos de cancro são de grande interesse.

CD8

+ CTL é capaz de reconhecer especificamente e matam células tumorais que expressam péptidos de antigénios associados a tumores apresentados por moléculas da classe I do MHC. Por conseguinte, a maioria das estratégias de imunoterapia do cancro corrente de focagem sobre a indução de CTL que lisam células de tumor [6]. imunoterapia do cancro especifica para o antigénio confia na identificação de epitopos expressos por células cancerosas que podem ser utilizados como alvos para CD8

+ células T. No entanto, os epitopos CTL naturais de cancros não são sempre óptimo porque o repertório de CTL contra epitopos de elevada afinidade é frequentemente tornadas tolerantes [7]. realce epitopo, por meio da modificação da sequência de AA de epitopos, foi desenvolvido para melhorar a eficácia das vacinas, principalmente através do aumento da afinidade dos péptidos para as moléculas de MHC [3], [8]. vacinas peptídicas têm demonstrado recentemente promessa considerável nos ensaios clínicos [9].

Descobrir antigénios específicos de tumor é crítica para o desenvolvimento da imunoterapia eficaz do cancro [5]. Recentemente, um antigénio associado a um tumor romance, POTE, foi identificado a partir de uma variedade de cancros humanos [10], [11]. Este antigénio tumoral é chamado POTE porque foi encontrada na primeira a ser expressa na próstata normal, ovário, testículos, placenta e tecidos, bem como no cancro da próstata [10]. A família de genes POTE foi encontrado disperso entre oito cromossomos diferentes (2, 8, 13, 14, 15, 18, 21 e 22) com comprimento diferente de mRNAs [12]. No entanto, a sequência de cDNA POTE entre vários cromossomas é altamente homogéneo com a divergência inferior a 10% [11]. Estudos subsequentes revelaram que os genes foram expressos POTE não apenas no cancro da próstata, mas também em uma ampla variedade de malignidades humanas, incluindo cancro da mama, do cólon, do pulmão, dos ovários e do pâncreas [11]. Há padrões distintos de expressão de POTE em tecidos e tipos de câncer [11] normais. Entre os vários tipos de câncer, os parálogos Pote no cromossomo 2 (POTE-2γ) são os mais frequentemente expressa.

Porque POTE mRNA é detectável somente em um número limitado de tecidos humanos normais (próstata e testículos nos machos, e dos ovários e na placenta, no sexo feminino), a proteína POTE é considerado como um membro da família antigénio-cancro testicular [11]. A expressão de antigénios de cancro testicular de placenta ou testículos não deve conduzir a activação das células T, devido à muito baixa expressão de moléculas MHC classe I nestes tecidos [13], [14]. Para pacientes com câncer, alguma reactividade contra o tecido da próstata ou da mama é aceitável, nem os tecidos vitais. Além disso, para pacientes com câncer de mama ou câncer de próstata, a próstata nos homens e de mama na mulher deveria ter sido ressecado cirúrgica ou irradiados. As preocupações de reacção auto-imune em ambos os tecidos não seria um obstáculo no tratamento do cancro com risco de vida. Portanto, o antigénio POTE deve ser um alvo atraente para a imunoterapia destes cancros.

Neste estudo, determinou-se primeiro os epítopos de HLA-A2-restrito a partir POTE (2γ), e suas imunogenicidades foram testados em transgénico AAD os ratinhos que têm um quimérico molécula MHC classe I composto de domínios a1 e a2 de HLA-A2 e domínio α3 de d

d [15]. A seguir, a reforçar a sua ligação a moléculas de HLA-A2.1 por realce epitopo para fazer os epitopos mais imunogénica, sem perder a capacidade de CD8 específicas

+ células T de reconhecer o tipo selvagem epitopo a um grau significativo. Finalmente, confirmou os epítopos modificados CTLs que mataram células cancerosas humanas induzida.

Materiais e Métodos

Animais

camundongos DAA [15] expressando uma HLA-A2.1 quimérico transgene com os domínios a1 e a2 de HLA-A2.1 e o domínio α3 a partir de H-2D

d, para permitir a ligação de CD8 do rato, sobre um fundo de C57BL /6, foram usados ​​nestas experiências. Partes das experiências foram repetidas em ratinhos HHD-2 (uma oferta do Dr. François Lemmonier, Institut Pasteur), que expressam HLA-A2.1 humana quimérica com a p2m humano covalente, sem qualquer classe I de moléculas de murino [16] – [ ,,,0],18]. Os ratos foram criados e alojados em instalações de cuidados de animais apropriados. Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados da instituição.

Peptídeos

Peptídeos neste estudo foram sintetizados num modelo Symphony Peptide Synthesizer (Perkin-Elmer, Boston, MA) usando convencional fluorenilmetoxicarbonilo (F-moc) química e clivado a partir da resina com ácido trifluoroacético. A pureza e a concentração molar foram analisados ​​por cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa numa coluna C18 utilizando um gradiente de ácido trifluoroacético a 0,1% em água e 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrilo e depois purificado por cromatografia líquida de elevado desempenho de fase reversa preparativa utilizando um gradiente similar.

Linhas Celulares

A linha de células T2 é deficiente em proteínas TAP1 e transportadores TAP2 e expressa baixos níveis de HLA-A2 [19]. A linha celular C1R.AAD é derivado do HMYC1R linha celular linfoblastóide B humana transfectada com a molécula quimérica de HLA contendo os domínios a1 e a2 de HLA-A2.1 humano e α3 de ratinho H-2D

d, um presente do Dr. . V. Engelhard (University of Virginia, Charlottesville, VA) como anteriormente descrito [15]. A linha de células C1R.A2.1 (um presente do Dr. William Biddison, NINDS, NIH) também é derivado de HMYC1R transfectadas com HLA-A2.1 [20], [21]. células C1R.AAD C1R.A2.1 e foram mantidas em meio completo, consistindo em 10% de FCS-RPMI 1640, 1 mM de piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais (Biofluid, Rockville, MD), glutamina 4 mM, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, e 50? M 2-ME. NCI-H522 (POTE

+ /HLA-A2

+) foi mantida em meio completo. HTB-19 (POTE

+ /HLA-A1

+) foi mantida em meio essencial mínimo de Eagle (EMEM), com FCS a 5%. MDA-MB-231 (POTE

– /HLA-A2

+) foi mantida em 10% de FCS-DMEM

ensaio de ligação T2

capacidade de ligação do péptido às.. molécula de HLA-A2 foi medida usando a linha de células T2 de acordo com um protocolo descrito anteriormente [19], [22]. As células T2 (3 × 10

5 células /poço) foram incubadas durante a noite em placas de 96 cavidades com meio de cultura (01:01 mistura de RPMI 1640 aminoácido de /Eagle-Hank contendo 2,5% de soro fetal de bovino, 100 U /ml penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina) com 10 ug /ml β2-microglobulina (Sigma) e diferentes concentrações tituladas de péptidos (a partir de 100 ^ M com 2 vezes diluição em série), como mostrado nas figuras para determinar a concentração que dá um 50 % de aumento na ligação (ver abaixo). As células foram lavadas uma vez com HBSS frio contendo 0,1% de BSA e incubadas durante 30 min a 4 ° C com anticorpo monoclonal anti-HLA-A2.1 (BB7.2 clone) (diluição 1:40 de sobrenadante de hibridoma). Após lavagem, as células foram coradas com cabra marcado com FITC anti-imunoglobulina de ratinho (BD, San Jose, CA), e o nível de expressão de HLA foi medida por citometria de fluxo. a expressão de HLA-A2 foi quantificada como o índice de fluorescência (FI) de acordo com a fórmula seguinte: FI = (intensidade de fluorescência média geométrica com péptido – a intensidade de fluorescência média geométrica sem péptido) /intensidade de fluorescência média geométrica sem péptido. fluorescência de fundo, sem BB7.2 foi subtraída para cada valor individual. Para comparar os diferentes péptidos, FI

0,5, a concentração de péptido que aumenta a expressão do HLA-A2.1 em 50% em relação ao controlo sem fundo péptido, foi calculada a partir da curva de titulação para cada péptido. Deve notar-se que o FI

0,5 fornece uma medida relativa da potência ou afinidade de péptidos entre os péptidos, em comparação lado a lado, mas não pode ser tomado como uma afinidade termodinâmica.

Imunizações

AAD ou HHD-2 ratinhos foram imunizados SC na base da cauda com 100 uL de uma emulsão contendo 01:01 adjuvante incompleto de Freund (Sigma) e PBS com péptidos e citocinas (50 nmol de epítopo de CTL, 50 nmol de vírus da hepatite B núcleo 128-140 epitopo ajudante, 5 ^ g de rato interleucina 12 e 5 ug de rato fator de estimulação de colônias de granulócitos macrófagos). As citoquinas foram adquiridos a partir de Peprotech (Rocky Hill, NJ). Os ratinhos foram reforçados 2 semanas mais tarde, e os baços foram removidos 2 semanas após o reforço. Para todas as experiências, foram usados ​​grupos de três ratinhos

interferão-y Ensaio ELISPOT

O número de células que segregam IFN-y foram determinados por um kit ELISPOT (rato IFN-gama ELISpot SixPak.; R D, Minneapolis, MA) ou por um conjunto de revestimento anti-ratinho de IFN-γ (AN18) e de detecção (R4-6A2) anticorpos monoclonais (Mabtech) de acordo com as instruções do fabricante. Duas semanas após a última imunização, as células de baço foram colocadas em placas revestidas com anticorpo de 200.000, 100.000 e 50.000 células /poço e estimuladas com 200.000 células do baço pulsadas com péptido naïve /poço com a concentração indicada de péptidos durante 2 horas. Após a noite de incubação a 37 ° C, as placas foram lavadas e foi adicionado anticorpo de detecção. Um módulo de cor azul ELISPOT (R D) foi usada para o desenvolvimento de cor. As manchas foram lidos por um leitor ELISPOT (AID). Todas as amostras foram analisadas em triplicado.

In vitro

Estimulação e Ensaio de Citotoxicidade

esplenócitos dos ratos imunizados foram re-estimuladas com esplenócitos carregadas com péptido (1 uM). No dia 1 e no dia 5, Stim T de rato (BD Bioscience) foi adicionado como uma fonte de IL-2. Uma semana mais tarde, a actividade de CTL foi medida usando um ensaio de libertação de 4-h

51Cr. As células alvo (10

6) foram pulsadas com péptidos em 200 ul de meio de células T completo e 150 uCi de

51Cr durante 2 h, lavou-se três vezes, e adicionado a 3000 células /poço para a rodada de 96 poços placas -bottom com diferentes proporções E /T. A percentagem de específico

51Cr libertação foi calculada como 100 x [(libertação experimental – libertação espontânea) /(libertação máxima – libertação espontânea)]. A libertação espontânea foi determinada a partir de células alvo incubadas sem células efectoras, e a libertação máxima foi determinada na presença de 5% Triton-X. As linhas celulares ou C1R.AAD C1R.A2.1 com ou sem péptidos ou células de cancro humano sem péptidos foram usadas como alvos. C1R.AAD ou linhas celulares C1R.A2.1 não expressam qualquer outra molécula MHC, ou classe I ou II, além de HLA-A2, para que eles não estão sujeitos a preocupações sobre a atribuição ou xenoreactivity. células cancerosas humanas foram pré-incubadas com 1000 ng /IFN-γ humano ml durante 72 h antes do ensaio [23].

HLA-A2 /péptido Tetrâmero Complexos

tetramérica MHC de classe I /peptídeo complexos obtidos a partir do NIH Facilidade tetrâmero foram sintetizados como descrito anteriormente [24], [25]. Resumidamente, as moléculas HLA-A2 de cadeia simples purificados foram sintetizados por um sistema de expressão procariótico (PET; R D Systems, Minneapolis, MN). A cadeia pesada foi modificado contendo o local Bir-A biotinilação enzimática. De cadeia simples pesada-cadeia β2-microglobulina e o péptido foram redobradas por diluição num sistema tampão redoxshuffling. O produto redobrado foi biotinilado por Bir-A na presença de biotina ligase (Avidity, Denver, CO). A estreptavidina-ficoeritrina conjugado (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) foi adicionado numa razão molar 01:04. Per-CP marcado anti-rato CD8 anticorpo (BD Pharmingen) e o painel de rastreio Vp do TCR (BD Pharmingen) foram usados ​​para detectar o repertório de TCR do CTL.

Epitopo Aperfeiçoamento

Para melhorar a ligação dos epitopos POTE a HLA-A2, que examinaram as sequências de resíduos de ancoragem primários e secundários que podem ser sub-óptima, com base nas âncoras primárias e secundárias definidas [26], [27], e os péptidos sintetizados com substituições AA individuais para corrigir estas deficiências . Estes foram então testadas empiricamente como descrito nos resultados para a ligação e imunogenicidade e para a actividade da CTL induzido.

Declaração de Ética

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê do Animal Care e Uso Instituto nacional do Câncer, do NIH e do Hospital Taipei Veterans general.

Resultados

Predição de HLA-A2.1 restrito epitopos

A sequência protótipo do POTE tem 584 resíduos de AA (número de acesso AY172978, ref [12]). Cinco péptidos 9-mero foram primeiro seleccionadas com base em resíduos de AA de ancoragem que determinam a ligação a moléculas de HLA-A2 e três algoritmos de previsão [22], [26], [28] – [32]. A pontuação Parker baseia-se uma meia-hora prevista de dissociação para moléculas de classe I de HLA, usando uma matriz de AA em cada posição na sequência com base em péptidos de ligação conhecida, e uma pontuação de mais elevada do que 100 é sugerido como um potencial agente ligante. O segundo algoritmo foi desenvolvido pelo Dr. Zhiping Weng, que se baseia na programação linear para prever a ligação de péptidos a HLA-A2 (https://zlab.bu.edu/SMM/). Um Em (IC 50) inferior a 8 está previsto para ser um ligante a HLA-A2. A pontuação SYFPEITHI foi desenvolvido pelo laboratório de Hans-Georg Rammensee [29] (https://www.syfpeithi.de/). Um SYFPEITHI pontuação maior do que 21 prevê um potencial epítopo HLA-A2. Se a sequência foi sugerido como um ligante por qualquer um dos algoritmos de previsão, o péptido foi usado para estudo seguinte. Como mostrado na Tabela 1, as previsões não foram completamente consistente entre as três algoritmos.

Determinar a afinidade de ligação de péptidos a POTE HLA-A2 moléculas

A afinidade de ligação dos péptidos previstos com a molécula HLA-A2 foi medida pelo ensaio de ligação de T2. Como mostrado na Figura 1A, POTE 323-331 e 272-280 POTE mostraram a afinidade de ligao mais forte para a molécula HLA-A2, com um FI

0,5 de 0,8 uM e 0,9 uM, respectivamente. POTE 252-260 e 553-561 POTE eram ligantes intermediários com FI

0,5 de 1,6 mM e 5,6 mM, respectivamente. Porque POTE 222-230 é um ligante fraco com um FI

0,5 torno de 42,4 mM, esta sequência tem pouca chance de ligar e ser apresentado pelas moléculas HLA-A2 para CD8

células + T. ligantes boas e intermédios foram escolhidos para estudos de imunogenicidade em ratinhos transgénicos HLA-A2.

(A). A afinidade de ligação de HLA-A2 do 5 previu epitopos POTE foi confirmada por ensaio de ligação de T2. O FI calculada

0,5 para POTE 222, 252, 272, 323 e 553 eram aproximadamente 42,4 uM, 1,6 uM, 0,9 uM, 0,8 uM e 5,6 uM, respectivamente. A afinidade de ligação dos péptidos substituídos POTE 252 (b), os péptidos substituídos POTE 553 (C) ou os péptidos substituídos POTE 323 (D) para moléculas HLA-A2. Cada ensaio foi realizado em triplicado, e os dados nesta figura são representativos de duas experiências com resultados semelhantes. A imunogenicidade do epítopo em ratinhos POTE 272 DAA (E). Os ratinhos foram imunizados com 50 nmol de POTE 272 em 100 ul de emulsão, e alvos foram pulsadas com 1,0 ^ M POTE272. As manchas foram contadas por um leitor ELISPOT (sistema leitor ELISPOT AID). Os números mostram o número de pontos por milhão de células. (F) a reactividade de CTL a 272 POTE péptido. Em quatro horas

ensaio de libertação de 51Cr, células CIR.AAD foram pulsadas com 1,0 mM POTE 272 peptídeo e marcadas com

51Cr. Depois de se lavar três vezes, as células alvo foram misturadas com números diferentes de células efectoras e então cultivadas durante 4 horas antes da colheita.

Epitopo Aperfeiçoamento para aumentar a afinidade de ligação dos péptidos POTE para HLA-A2 moléculas

células T específicas para auto-péptidos com boa capacidade para se ligarem ao MHC classe I de moléculas são frequentemente seleccionados negativamente [7]. peptídeos associados a tumores que exibem intermediário de MHC de classe I As afinidades de ligação pode ser preferível como candidatos a vacinas. Além disso, o MHC de classe I de ligação e imunogenicidade de tais ligantes de afinidade intermédios pode ser melhorada através de substituição de AA âncora primária ou secundária com aqueles de ligação mais óptimos, um acessório epitopo procedimento chamado. Fizemos péptidos com substituições AA para insert conhecido bons resíduos de ancoragem primária ou secundária, quando estes já não estivesse presente, com base em relatórios anteriores [26], [27]. Por conseguinte, fizemos tais modificações de ligantes intermédios, POTE 252 e POTE 553, e mais uma vez determinada a afinidade de ligação com as moléculas de HLA-A2 por ensaio de ligação T2. Para além dos ligantes intermédios, que também feitas as substituições de AA em um dos melhores ligantes, POTE 323, para examinar se a modificação podia melhorar ainda mais a sua afinidade de ligação a moléculas de HLA-A2. Como mostrado na Tabela 2, as substituições de AA no primário (posição 2 e o terminal C) ou secundário (posição 1, 3 e 7) resíduos de ancoragem para as moléculas de HLA-A2 foram feitas se os resíduos nativas não foram já óptima [22], [ ,,,0],26], [28], [30]. Nós não tentar melhorar POTE 272 como julgamos que era improvável de ser substancialmente melhorado.

Cinco peptídeos modificados foram geradas com base no ligante intermediária, POTE 252. Como mostrado na Figura 1B, tanto POTE 252-9V e POTE 252-1Y teve melhor afinidade de ligação a moléculas de HLA-A2 do que o tipo selvagem, POTE 252. o FI

0,5 de POTE 252-9V e POTE 252-1Y foi de 0,8 uM e 0,9 uM, respectivamente . Ambos eram quase 2 vezes mais baixa (maior afinidade) do que a do péptido POTE 252.

Quatro péptidos substituídos foram feitas para outro ligante intermédia, POTE 553. Como mostrado na Figura 1C, todos os péptidos modificados, POTE 553-1Y, POTE 553-2L, POTE 553-7A e POTE 553-3F teve melhor afinidade de ligação às moléculas de HLA-A2 do que o tipo selvagem POTE 553 peptídeo. O FI

0,5 valores de POTE 553-1Ywas 0,024 uM.

Quatro péptidos também foram modificados a partir do melhor ligante, POTE 323. Tal como mostrado na Figura 1D, única POTE 323-3F poderia aumentar a afinidade de ligação a moléculas de HLA-A2, com a FI

0,5 de 0,09 uM, cerca de 3 vezes melhor do que o ptido de tipo selvagem.

a imunogenicidade de uma boa HLA-A2.1 Binder, POTE 272

Para testar a imunogenicidade do péptido POTE 272, grupos de 3 ratinhos transgénicos AAD foram imunizados com o péptido 272 POTE subcutaneamente. Duas semanas após o reforço, os esplenócitos de 3 ratinhos foram agrupados para medir a sua imunogenicidade por

ex vivo

ensaio ELISPOT de IFN-γ e por ensaio de CTL após uma semana

In vitro

estimulação. Como mostrado na Figura 1E, POTE 272 induziram respostas significativas de IFN-gama seguinte POTE 272 estimulação. Após uma semana

in vitro

estimulação, CTLs induzidos com Pote 272 lisadas células alvo pulsadas com POTE 272 (Figura 1F). Portanto, POTE 272 é um epitopo imunogénico na proteína POTE. No entanto, CD8

+ células T específicas para auto-antigénio com uma boa afinidade de ligação pode ser seleccionado de forma negativa ou auto-tolerante, de modo POTE 272 pode não ser um bom candidato como uma vacina contra o cancro para a proteína POTE, embora este continua a ser testado.

a imunogenicidade do tipo selvagem e Enhanced POTE 252 epitopos e CD8

Respostas + T-Cell Cross-reativa

Ambos POTE 252-9V e POTE 252-1Y tinha melhor ligação afinidade de moléculas HLA-A2 do que o POTE 252 (Figura 1B). Como mostrado na Figura 2A, tanto POTE 252 e POTE 252-9V induziu um significativo número de manchas de IFN-γ com reactividade cruzada com ambos POTE 252 e POTE 252-9V. Embora POTE 252-1Y tinha uma melhor afinidade de ligação a moléculas de HLA-A2 do que POTE 252, não há respostas significativas de IFN-gama foram detectados no ensaio, mesmo na presença de péptido POTE 252-1Y. Após uma semana de estimulação in vitro com o péptido cognato, CD8

+ CTL induzidos com o tipo selvagem POTE 252 e reforçada epitopo POTE 252-9V lisadas células alvo pulsadas com o tipo selvagem POTE 252, bem como POTE 252-9V. Este resultado sugeriu que o TCR de CTLs gerados em murganhos imunizados com o tipo selvagem ou reforçada péptido pode reconhecer o ptido de tipo selvagem (POTE 252) /complexo MHC de classe I (Figura 2B).

(A) Os ratinhos foram imunizados com 50 nmol de POTE 252 em 100 ul de emulsão, e alvos foram pulsadas com 1,0 ^ M POTE252. As manchas foram contadas por um leitor ELISPOT (sistema leitor ELISPOT AID). Os números mostram o número de pontos por milhão de células. (B) a reactividade cruzada de CTL em cada péptido. Duas semanas após o segundo reforço, as células do baço reunidas a partir de três ratinhos foram re-estimuladas com esplenócitos irradiados pulsadas com 1,0 uM de cada péptido durante 7 dias. Em seguida, um 4 horas

ensaio de libertação de 51Cr foi realizada. (C) HLA-A2 /peptídeo tetrâmero coloração e (D) determinação TCR repertório para POTE 252- e CTLs induzidas 252-9V POTE em HHD-2 ratos.

HLA-A2 tetrâmero Stain e análise do repertório Vp do TCR

a CTL induzida por POTE 252-9V foram as mais fortemente reactivo com o antigénio POTE tipo selvagem. Nós ainda compararam a resposta eo uso repertório TCR do POTE específicas de CD8

+ células T de HHD-2 ratos imunizados com POTE 252 e 252-9V. Tal como mostrado na Figura 2C, 9,3% versus 6,8% de CD8

+ células T foram tetrâmero-positivo em grupos de imunização e POTE252 POTE 252-9V, respectivamente. Ao comparar o repertório de TCR da CD8

+ tetrâmero

+ células T entre os dois grupos, os dados (Figura 2D) mostraram que o CTL induzido por POTE 252 foram positivas para Vp 6, 7, 8,1, 8,2, 9, 10, 11, com a maioria sendo quer Vp 6, 9, 10 ou 11, enquanto que as CTL induzidas por POTE 252-9V foram positivos para Vp 8, 9, 10, e 11, mas eram esmagadoramente dominado por cerca de 80% positivos para Vβ10 e apenas uma pequena fração expressando os outros. Assim, os repertórios de TCR da CD8

+ tetrâmero

+ células T eram distintas entre o tipo selvagem e camundongos imunizados peptídicas POTE melhorados.

A imunogenicidade do tipo selvagem e Enhanced POTE 553 epitopos e CD8

+ T-Cell Responses Cruz

Todos os POTE 553 péptidos substituídos mostrou melhor afinidade de ligação às moléculas de HLA-A2 do que o POTE 553 (Figura 1C). Nós escolhemos as duas melhores ligantes entre estes péptidos melhoradas, juntamente com o ptido de tipo selvagem, para testar as respostas de CTL e imunogenicidades de reactividade cruzada. Como mostrado na Figura 3A e B, POTE 553 não induziu qualquer resposta significativa de IFN-gama em qualquer concentração de péptido utilizadas para a estimulação. Após uma semana,

In vitro

estimulação, há também não era qualquer lise celular detectável alvo significativa (Figura 3C). Portanto POTE 553, como um ligante a HLA-A2 intermediário, não é imunogénico. Ambos POTE 553-1Y e POTE 553-2L induzida algum nível de respostas de IFN-y apenas após estimulação com o mesmo péptido (Figura 3A, B). Na Figura 3B, as células alvo foram pulsadas com diferentes concentrações de péptido para demonstrar que o péptido reforçada poderia induzir células T de alta avidez para matar células alvo na presença de baixas concentrações de antigénio. De acordo com o

ex vivo

IFN-y ensaio ELISPOT, nenhuma resposta reactiva cruzada para ptido de tipo selvagem foi detectado em o CTL induzidos pelos péptidos POTE 553-1Y ou POTE 553-2L. No entanto, após uma semana

in vitro

estimulação, CD8

CTLs + induzidos com o epitopo reforçada POTE 553-1Y lisadas células alvo pulsadas com não só POTE 553-1Y, mas também Pote 553 e Poté 553- péptidos 2L, sugerindo que o TCR do CTL reconheceu a POTE 553 /complexo MHC de classe I, em certa medida (Figura 3C). A partir deste ponto de vista, POTE-553-1Y pode ser uma possível vacina contra o câncer alternativa contra o antígeno POTE. Embora POTE 553-2L pode induzir determinadas respostas de IFN-γ após a estimulação com o mesmo péptido (Figura 3A, B), CD8

+ CTL induzidas com POTE 553-2L fez lisam células alvo não pulsadas com POTE 553-2L (Figura sc 3C).

camundongos AAD foram imunizados com uma mistura de péptido e citocinas em adjuvante descrito na secção de Métodos. (A, B), duas semanas após o segundo reforço, os esplenócitos reunidos a partir de três ratinhos foram re-estimuladas com esplenócitos de ratinhos AAD naive pulsadas com 10 nM a 1000 nM de cada péptido em diferentes P /rácios T (1000 nM foi utilizado no painel A) . As manchas foram contadas por um leitor ELISPOT (sistema leitor ELISPOT AID). Os números mostram o número de pontos por milhão de células. (C) CTL de reactividade cruzada em cada péptido. Em quatro horas

ensaio de libertação de 51Cr, células CIR.AAD foram pulsadas com 1,0 mM cada peptídeo e marcadas com

51Cr. Depois de se lavar três vezes, as células alvo foram misturadas com números diferentes de células efectoras e, em seguida, cultivadas durante 4 horas antes da colheita.

A imunogenicidade do tipo selvagem e Enhanced POTE 323 e epitopos CD8

+ T Respostas -cell de reactividade cruzada

POTE 323-3F foi o único péptido modificado com melhor afinidade de ligação de HLA-A2 de tipo selvagem POTE 323 (Figura 1D). Como mostrado na Figura 4A, tanto POTE 323 e POTE 323-3F induzida algumas respostas de IFN-y após estimulação com o péptido idêntico. Embora o péptido POTE 323 foi o melhor ligante a HLA-A2 dentro da sequência POTE, apenas marginal respostas de IFN-y (menos do que duas vezes acima do nível de fundo) foram detectadas pelo ensaio ELISPOT. Após uma semana

in vitro

estimulação, CTLs induzidos por POTE 323 não conseguiram lisar células alvo pulsadas com POTE 323. Esta resposta CTL negativo pode ser devido à perda de uma parte substancial de células com alta avidez responder que poderiam foram mortas durante a incubação com uma concentração elevada relativa de péptido (1,0 uM). POTE 323-3F induzida pontos significativos de IFN-γ sob estimulação POTE 323-3F, e algum grau de resposta de IFN-γ também foi detectado após estimulação com o tipo selvagem POTE 323 epitopo. Após

In vitro

estimulação com o péptido cognato, CD8

+ CTL induzidos com o epitopo reforçada POTE 323-3F lisadas células alvo pulsadas com o POTE 323-3F, bem como o tipo selvagem POTE 323, sugerindo que os TCRs do CTL pode reconhecer o ptido de tipo selvagem (POTE 323) /complexo MHC de classe I (Figura 4B). POTE 323-3F foi mais imunogénico na indução de CTLs específicos para o tipo de epitopo selvagem que era do tipo selvagem epitopo si. Portanto, POTE 323-3F pode ser um excelente candidato a vacina para alvejar as células tumorais expressando POTE.

camundongos AAD foram imunizados s.c. com 50 nmol de péptido em 100 ul de emulsão como descrito na secção de Métodos. (A) dirigir ex vivo ensaio ELISPOT de IFN-γ utilizando células alvo pulsadas com péptido 1,000 nM. Os números mostram o número de pontos por milhão de células. (B) a reactividade cruzada de CTL em POTE 323 e péptidos POTE 323-3F. (C) citotoxicidade anti-tumoral contra uma linha de cancro do pulmão humano expressando POTE células NCI-H522 induzida por POTE 553-1Y, 323-3F e 252-9V. HHD-2 os ratinhos foram imunizados com 50 nmol do péptido indicado, em 100 ul de emulsão e re-estimulados durante 7 dias com 1,000 nM de péptido, antes de ser testado quanto à capacidade para lisar as células de tumor. (D) Síntese da citotoxicidade anti-tumor em POTE-expressando e não expressando POTE células tumorais humanas. NCI-H522 é uma linha de cancro do pulmão humano que expressa tanto POTE e HLA-A2, enquanto HTB-19 é um carcinoma mamário humano que expressa POTE mas não HLA-A2, e células MDA-MB-231 é uma linha de células de carcinoma mamário humano que expressa HLA -A2, mas não POTE. Matar de apenas o primeiro destes mostra a especificidade para POTE em combinação com HLA-A2. (Os valores negativos são devidos a

libertação experimental 51Cr ligeiramente abaixo libertação espontânea sem células efetoras, dentro do erro experimental, e por isso deve ser visto como equivalente a zero).

CTLs induzidos por POTE Modificado péptidos contra células cancerosas humanas

para servir como vacinas tumorais candidato, indução de citotoxicidade para matar células cancerosas humanas é essencial. Três linhas de células cancerosas humanas, NCI-H522 (células do cancro do pulmão de células não pequenas humano, POTE

+ /HLA-A2

+), HTB-19 (carcinoma mamário humano, POTE

+ /HLA A1

+) e MDA-MB-231 (células de cancro da mama humano, POTE

– /HLA-A2

+) foram escolhidas como as células alvo no presente estudo. Tal como mostrado na Figura 4C