Abstract

proteína arginina metiltransferase 5 (PRMT5) desempenha várias funções em um grande número de processos celulares, e sua localização subcelular é regulado de forma dinâmica durante o desenvolvimento do mouse e diferenciação celular. No entanto, pouco se sabe sobre as diferenças funcionais entre PRMT5 no citoplasma e no núcleo PRMT5. Aqui, demonstramos que PRMT5 predominantemente localizada no citoplasma das células de cancro da próstata. Os ensaios de localização subcelular concebidos para abranger toda a grelha de leitura aberta da proteína PRMT5 revelou a presença de três sinais de exclusão nucleares (Ness) na proteína PRMT5. PRMT5 e p44 /MED50 /WD45 /WDR77 co-localizar no citoplasma, e ambos são necessários para o crescimento de células de cancro da próstata em uma maneira dependente da actividade PRMT5 metiltransferase. Em contraste, PRMT5 no núcleo inibiu o crescimento celular de um modo independente de actividade de metiltransferase. Consistente com estas observações, PRMT5 localizada no núcleo em epitélio da próstata benigna, ao passo que ela localizada no citoplasma em tecidos pré-malignas da próstata e cancro. Descobrimos ainda que PRMT5 sozinho metilado tanto histona H4 e proteínas SmD3 mas PRMT5 complexada com p44 e pICln metilado SmD3 mas não histona H4. Estes resultados implicam um novo mecanismo pelo qual PRMT5 controla o crescimento celular e contribui para tumorigênese prostática

Citation:. Gu Z, Li Y, Lee P, Liu T, Wan C, Wang Z (2012) Protein Arginina Metiltransferase 5 funções de maneiras opostas no citoplasma e núcleo das células cancerosas da próstata. PLoS ONE 7 (8): e44033. doi: 10.1371 /journal.pone.0044033

editor: Hari Koul, University of Colorado, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de fevereiro de 2012; Aceito: 01 de agosto de 2012; Publicado: 27 Agosto 2012 |

Direitos de autor: © Gu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão 1R01 DK065156 01 do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e renais, os Estados Unidos National Institutes of Health (NIH) (a ZW), pelo Centro de Suporte do Câncer (core) CA16672 subsídio do Instituto Nacional do Câncer , NIH para The University of Texas MD Anderson Cancer Center, por NYUSOM Urology Center of Excellence financiamento para PL e pela National Science Foundation Natural da China (81171922) e Key Fundo de Investigação Projeto de Shaanxi Provincial Ciência e Tecnologia Programa, China. (2008K27G01) para ZP. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

proteína arginina metiltransferase 5 (PRMT5) é uma metiltransferase arginina proteína de tipo II que catalisa a dimetilação simétrica de resíduos de arginina no prazo de proteínas-alvo [1]. PRMT5 é altamente conservado entre leveduras, animais e plantas superiores, e tem sido implicada em diversos processos celulares e biológicas, incluindo a regulação da transcrição [2], [3], [4], o metabolismo de RNA [1], [5], biogénese ribossoma 6], de Golgi manutenção da estrutura do aparelho de [7], e a progressão do ciclo celular [2]. PRMT5 também está envolvido na formação de células germinativas, especificação, e manutenção [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Em células de mamíferos, PRMT5 se localiza no citoplasma e o núcleo, e metila múltiplos histona e proteínas nonhistone [1]. No núcleo, PRMT5 foi encontrado nas SWI /SNF e NURD complexos de remodelação da cromatina [14], [15], em que metila histonas, bem como factores de transcrição /reguladores [2], [3], [4]. No citoplasma, PRMT5 forma um complexo metiltransferase arginina 20S proteína, denominada o “methylosome,” que consiste em spliceosomal snRNP proteínas Sm, PRMT5, pICln, e WD de repetição da proteína (MEP50 /WD45) [16], [17], [18] . Neste complexo, PRMT5 metilado proteínas Sm [16], [19], e tais metilação aumentou a afinidade de ligação dessas proteínas Sm para o neurónio motor sobrevivência (SMN), o produto do gene da doença atrofia muscular espinal [20], [21] . Subsequentemente, o PRMT5- e SMN-complexos cooperar para carregar as proteínas Sm Onto L snRNAs, formando L snRNPs [22]. Embora

in vitro

evidências bioquímicas indicaram que simétrica dimetilação arginina é essencial para o splicing-mRNA pré [23], em que medida PRMT5 afeta splicing

in vivo

permanece indefinida. PRMT5 é crucial para o desenvolvimento embrionário do rato [8].

Nós purificado e clonado um novo receptor de andrógeno (AR) -interacting proteína, p44 designada [24], [25]. A sequência da proteína de p44 é idêntico ao de um componente (MEP50) do complexo methylosome [18] e uma subunidade (WD45) do complexo SMN [17]. A proteína p44 contém 342 resíduos de aminoácidos e sete putativos repetições WD-40 e é também designado WDR77 no banco de genes (Adesão: AAH9411.1). Interage com o AR e regula a expressão de um conjunto de genes alvo de androgénio na glândula da próstata e no cancro da próstata [24], [25], [26], [27]. A proteína p44 localiza no citoplasma das células epiteliais da próstata de ratos mais jovens do que 28 dias; P44 translocação nuclear começa na idade de 28 dias e é completada em 45 dias [28] idade. translocação nuclear de p44 está correlacionada com uma diminuição dramática na taxa de proliferação de células epiteliais [28] e com citodiferenciação funcional de células luminais, que ocorre com a expressão das proteínas secretoras específicos da próstata [29], [30], [31] , [32]. Assim, P44 localização citoplasmática está associada à proliferação de células epiteliais da próstata, enquanto que a sua localização nuclear está associada com a diferenciação celular epitelial. coloração imuno-histoquímica de espécimes da próstata mostraram que a proteína p44 localiza no núcleo das células epiteliais benignas e no citoplasma de células de cancro da próstata [25]. A translocação da p44 a partir do núcleo para o citoplasma ocorre em neoplasia intraepitelial prostática e lesões de cancro da próstata [25], [26]. localização nuclear Forçado de p44 inibiu o crescimento de células de cancro da próstata em cultura de tecidos [25] e completamente abolido o crescimento de xenoenxertos de tumores da próstata em ratinhos nus [26]. Esta inibição do crescimento foi associada com a regulação positiva de

p21

e

expressão p27

gene; downregulation de

ciclina A

,

ciclina B

, e

a expressão do gene CDK2

; e interrupção do ciclo celular no G

1 /G

0 fase [25], [26]. Assim, a função da p44 é regulada pela sua localização subcelular.

células PC3 e LNCaP (A) foram imuno-histoquimicamente coradas com anti-PRMT5 -p44 e anticorpos (painéis AG) ou anti-PRMT5 mais anticorpos -coilin (painel h ). Os sinais fluorescentes foram observadas sob um microscópio confocal com um filtro vermelho (para detectar PRMT5) ou filtro verde (para detectar p44 ou coilina). painéis da direita mostram imagens fundidas de PRMT5 e p44 ou coilina coloração. Branco e pontas de seta indicam PRMT5 verdes e sinais de p44 ou Coilin no núcleo, respectivamente. (B) Western blot de frações citoplasmáticos e nucleares de LNCaP e células PC3 com anti-PRMT5, -p44, -HSP90, ou anticorpo anti-lamin B. C, citoplasma; N, núcleo.

PRMT5 forma um complexo estequiométrico com p44 /MEP40 /WD45 /WDR77 em várias células [33], [34], [35], e sua localização subcelular é regulado dinamicamente durante rato desenvolvimento [8]. O papel funcional da PRMT5 no citoplasma e núcleo e a relação da sua localização subcelular para o cancro da próstata não foram investigadas. No presente estudo, verificou-se que PRMT5 citoplasmática é essencial para o crescimento de células de cancro da próstata, ao passo que PRMT5 nuclear inibe o crescimento de células de cancro da próstata. Consistente com estas observações, PRMT5 localiza no núcleo em células epiteliais da próstata benigna e, em contraste, se localiza no citoplasma em lesões pré-malignas e tecidos próstata cancerosa. Por conseguinte, a função PRMT5 é regulada pela sua localização subcelular, e este transporte nucleocitoplasmático pode desempenhar um importante papel na tumorigénese da próstata.

(A) Diagramas de as truncagens PRMT5 expressas como proteínas de fusão GFP-. As percentagens de células com truncagens GFP-PRMT5 no citoplasma (C), núcleo (N) ou citoplasma mais núcleo (C /N) são mostrados no lado direito. (B) Localização subcelular de sinais de exportação nuclear isolado. As células foram transfectadas com pcDNA-F: GFP-PRMT5, -PRMT5 (1-90), -PRMT5 (500-560), -PRMT5 (576-637), ou pcDNA-GFP e observados sob um microscópio confocal. (C) análise de transferência de Western de fracções nucleares e citoplasmáticos de células transfectadas com pcDNA-F: GFP-PRMT5, -PRMT5 (1-90), PRMT5 (500-560), ou PRMT5 (576-637) com anti-FLAG, -HSP90, ou anticorpo -lamin B.

Materiais e Métodos

Nossa pesquisa não envolveu os participantes humanos e animais, apenas o uso de tecidos de câncer de próstata humanas. Os pacientes não pode ser identificado, directa ou indirectamente, através de identificadores ligados aos sujeitos. Assim, o projeto de pesquisa foi isenta ao abrigo Isenção 4 (45 CFR Part 46) e uma declaração de ética não é necessária.

(A) Esquemas das truncations PRMT5. As células foram transfectadas com pcDNA-GFP-p44 e pcDNA-PRMT5 ou truncagens pcDNA-PRMT5, e as percentagens de células com GFP-p44 no citoplasma (C) ou citoplasma mais núcleo (C /N) são mostrados no lado direito. (B) translocação citoplasmática de GFP-p44 impulsionado por PRMT5. As células foram transfectadas com pcDNA-GFP-p44 sozinho ou em conjunto com pcDNA-F: PRMT5, -f: PRMT5 (91-637), ou f: PRMT5 (325-637), e o GFP-p44 localização subcelular foi observada sob um microscópio confocal. (C) Análise de Western blot de frações citoplasmáticos e nucleares de células Cos 7 descritos no B com anti-p44, -HSP90, ou anticorpo -lamin B.

amostras de câncer de próstata e imunohistoquímica

tecidos benigno da próstata e cancerosos foram obtidos a partir de amostras de prostatectomia radical de 19 pacientes com cancro da próstata tratados na New York University Medical Center, eo protocolo do estudo foi aprovado pelo seu conselho de revisão institucional. identidades de pacientes foram removidos de todas as amostras e uma isenção da necessidade de consentimento foi concedido pelo conselho de revisão institucional da New York University School of Medicine, de modo que não era necessário o consentimento informado. Os tecidos foram fixados em formalina a 10% tamponada neutra e embebidos em parafina. A análise imuno-histoquímica foi realizada nas amostras de cancro da próstata humanas 19 como descrito anteriormente [36], [37]. Os anticorpos (anticorpo anti-p44, 1:50; anticorpo anti-PRMT5, 1:20; a partir de BD Transduction Laboratories) foram aplicados às secções de deslizamento e incubadas durante a noite. Um sistema de detecção de peroxidase de estreptavidina-biotina com 3,3′-diaminobenzidina como substrato foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante (DAKO S /A, Grostrup, Dinamarca).

(A) As mutações em p44 abolida PRMT5-driven P44 translocação citoplasmática. As células foram transfectadas com pcDNA-GFP-p44 (WT) ou pcDNA-GFP-p44 (MT), isoladamente ou em conjunto com pcDNA-PRMT5. O núcleo foi corado com Far-vermelho, e a localização subcelular de GFP-p44 foi observada em um microscópio confocal. (B) As mutações em p44 aboliu a interacção da p44 com PRMT5. As células foram transfectadas com pcDNA-F: p44 (WT) (pista 1) ou pcDNA-F: p44 (MT) (pistas 2-5), e os lisados ​​de células inteiras foram preparados para imunoprecipitação com anticorpo anti-FLAG (M2 de agarose) . Western blot com anti-PRMT5 foi realizada para detectar a PRMT5 precipitado (painel inferior). O painel superior mostra a expressão de tipo selvagem (WT) ou mutada p44 (MT) nos lisados ​​utilizados para a imunoprecipitação.

Células cultivadas foram crescidas em lâminas de câmara e fixas com metanol frio (-20 ° C) durante 10 min. proteínas não específicas foram bloqueadas em 4% de gelatina de peixe em PBS durante 20 min. incubação durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários foi realizada seguida por uma incubação de 1 h com anticorpo anti-rato ou um anticorpo anti-IgG de coelho marcado com Alexa 595 (1:500; Invitrogen), à temperatura ambiente. As amostras foram lavadas em PBS e depois contra-coradas com TOPRO 3, far-vermelho, verde ou Sytox (Molecular Probes) durante 10 min à temperatura ambiente, montadas em Histogel (Linaris Histogel), e analisadas directamente por microscopia de fluorescência confocal. Para a coloração dupla, anti-PRMT5 e anti-p44 ou anti-PRMT5 e anti-coilina (1:100, Proteintech) foram incubadas com as células durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos secundários (IgG anti-coelho marcado com DyLight 488, 1:1,000, e anti-IgG de ratinho marcado com DyLight 649, 1; 1000) foram usadas

(A) O silenciamento mediado shRNA de PRMT5. ou a expressão da p44 em células de câncer de próstata. A análise Western blot dos lisados ​​de células inteiras a partir de células LNCaP feitas infectadas com lentivírus expressando o não-alvo (NT) shRNA (pistas 1, 5), PRMT5 (pistas 2-4), ou p44 (pista 6) shRNAs. O PRMT5 resistente shRNA (pista 3) ou mutante R368A PRMT5 (pista 4), foi expresso nas células LNCaP que expressam PRMT5. (B) Curvas de crescimento de células cancerosas da próstata expressando NT shRNA, PRMT5 shRNAs, p44 shRNA, PRMT5 shRNAs mais PRMT5, p44 shRNA além de p44, ou PRMT5 shRNAs mais PRMT5mt.

cultura de células e ensaio de crescimento

LNCaP, as células PC3, e COS 7 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Cellgro) com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (Hyclone). Para o ensaio de crescimento celular, as células (5000 por poço) foram plaqueadas em placas de 24 poços, e os números de células foram contadas todos os dias durante 7 dias.

(A) Silenciamento expressão PRMT5 diminuiu os níveis de proteína p44 no citoplasma . As células LNCaP foram infectadas com NT-shRNA ou PRMT5 shRNA e histoquímica com anti-PRMT5 ou anticorpo -p44. O núcleo foi contrastado com Sytox verde (painéis de média, verde). As amostras foram observadas através de um microscópio confocal. (B) Western blot de citoplasmática (C) e nuclear (N) frações de células LNCaP que expressam NT-shRNA, PRMT5 shRNA ou p44 shRNA com o anticorpo anti-p44 ou anti-PRMT5.

DNA Constrói e transientes Transfecção

os fragmentos de ADNc PRMT5 foram amplificados a partir do pcDNA-PRMT5 construção [24] e subclonado no pcDNA-F: GFP construção [28] para expressar o N-terminal de proteínas de f: GFP-fusão de truncations PRMT5. Todas as construções foram verificadas por digestão com enzimas de restrição e por sequenciação de ADN. O sinal de localização nuclear forte (RKKKRKV) foi fundido na extremidade N-terminal de PRMT5 para expressar a proteína de fusão NLS-PRMT5. As construções de ADN (1 micrograma de cada constructo) foram transientemente transfectados em células LNCaP, PC3, ou células COS 7 (1 × 10

5) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. As células transfectadas foram fixadas com frio (-20 ° C) de metanol durante 10 minutos, coradas com TO-PRO 3 (10 microgramas /mL) (Molecular Probes), montado em Histogel (Linaris), e analisadas directamente por microscopia confocal.

(a) a proteína PRMT5 em células LNCaP que expressam PRMT5, PRMT5mt, NLS-PRMT5, ou NLS-PRMT5mt foi imunocorada com o anticorpo anti-PRMT5. As amostras foram observadas através de um microscópio confocal. PRMT5mt, NLS-PRMT5, ou NLS-PRMT5mt com anti-PRMT5, -p44, -lamin B, ou -HSP90 anticorpo: fracções de células LNCaP que expressam PRMT5, f (B) Western Blot de citoplasmático (C) e nuclear (N) . (C) Curvas de crescimento de células de cancro da próstata LNCaP expressando PRMT5, f:. PRMT5mt, NLS-PRMT5, ou NLS-PRMT5mt

RNA Interferência

P44 shRNA (p44-shRNA) (sequência alvo: 5′-GGGAACTAGATGAGAATGA-3 ‘), PRMT5 shRNA (sequência alvo: 5′-GGATAAAGCTGTATGCTGT-3′), e um nontargeting shRNA (NT-shRNA) (sequência alvo: 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘) foram projetado com um hairpin e extremidades coesivas (Ciai e MluI). Os oligonucleótidos foram hibridados para o vector de transferência do gene de lentivírus, pLVTHM, utilizando os locais de enzimas de restrição MluI e ClaI. As construções de ADN foram sequenciadas para testar a inserção correcta e comprimento dos elementos de encaixe. O lentivírus, em seguida, foi produzida por transfecção de células de rim embrionário humano (293FT; Invitrogen) com o vector de PLVTHM verificou-sequência, o plasmídeo de empacotamento (MD2G), e o plasmídeo envelope (PAX2), que são necessários para a produção virai. Três dias mais tarde, o sobrenadante virai foi recolhido e filtrado para remover os restos celulares. células LNCaP (1 × 10

5) foram plaqueadas em placas de seis poços e transduzida com partículas de vector lentivírus. Após 16 h, o meio contendo o vírus foi removido e substituído com meio de crescimento normal. Três dias após a infecção, as células divididas em 01:06 e foram cultivadas durante 3 dias. Os lisados ​​de células inteiras (5 microgramas de proteína) feitas a partir das células infectadas foram analisados ​​por Western blot.

(A) SDS-PAGE dos complexos PRMT5 produzidas por co-expressão de

E.

coli. (B) A metilação de SmD3 e substratos de histona H4 por PRMT5 e PRMT5 contendo complexos. Topo: autorradiografia do gel. Resumindo:. Coomassie coloração azul do gel

Nontargetable PRMT5 e p44 Expressão

Para criar vetores PRMT5 e expressão p44 nontargetable, as sequências de nucleótidos alvo de shRNAs foram mutados usando um oligo kit mutagênese direta. O GGATAAAGCTGTATGCTGT sequência alvo de PRMT5 shRNA foi mutado para GGATAAAattaTATGCTGT. O GGGAACTAGATGAGAATGA sequência alvo de p44 foi mutado para GGGAAtTgGAtGAGAATGA. O ADNc da p44 mutante ou PRMT5 foi subclonado no vector de expressão de lentivírus (dsRed-OG2). O lentivírus recombinante foi produzido com 293T, tal como descrito acima. Para resgatar PRMT5 ou expressão da p44, LNCaP PRMT5-shRNA ou células p44-shRNA foram plaqueadas em placas de seis poços e transduzidas com o vírus contendo o PRMT5 ou expressão da p44 nontargetable vector ou vector vazio. Após 48 h, as células foram re-plaqueadas, e a expressão PRMT5 ou P44 foi confirmada por Western blot.

. coloração imuno-histoquímica de p44 e PRMT5 em benignos (painéis superiores) humanos, hiperplasia prostática epitelial (PIN, painéis de média) e de próstata maligno (APC, Gleason grau 4, painéis inferiores) tecidos.

Citoplasmáticos e extracto nuclear Preparação

citoplasmática e fracções nucleares foram preparados a partir de células em cultura usando o Kit de extracto nuclear (catálogo # 40010 e 40410, o Active Motif) tal como descrito anteriormente [28].

Análise Western Blot

PRMT5 e p44 foram detectadas em extractos celulares totais (5 microgramas) por 10% de SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de transferência Immobilon-P (Millipore). As membranas foram lavadas em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 8, NaCl 150 mM, e Tween 20 a 0,05%) de solução salina e bloqueadas com 5% de leite desnatado em Tris com Tween 20 durante 1 h . As membranas foram então sondadas durante a noite com anticorpos primários em diluições de 1:2,000 (anti-p44), 1:1,000 (anti-PRMT5), 1:1000 (anti-HSP90, Santa Cruz Biotechnology), 1; 500 (anti-lamin B, Santa Cruz Biotechnology), e 1:1,000 (anti-β-actina, Sigma-Aldrich). Após 1,5 h de incubação com o anticorpo secundário conjugado com peróxido de rábano, proteínas imunorreactivas foram detectados por quimioluminescência aumentada, utilizando o sistema de detecção ECL segundo as instruções do fabricante (GE Healthcare). As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de proteína de Bradford (Bio-Rad).

Co-imunoprecipitação

células PC3 (3,6 × 10

6) foram transfectadas com 6 microgramas de pcDNA- f: p44, -f: p44 (26-27AAA), f: p44 (29-31AAA), f: p44 (35-37AAA) ou -f: p44 (42-44AAA) com Lipofectamine 2000. O conjunto -cell lisados ​​foram preparados a partir das células transfectadas 48 h após a transfecção e foram incubadas com 15 microlitros de M2 ​​de agarose (Sigma) durante 2 h a 4 ° C num volume final de 0,5 ml contendo 20 mM de HEPES (pH 7,9), EDTA 0,2 mM , 20% de glicerol, DTT 2 mM, KCl a 300 mM e 0,1% de NP40. As contas foram lavadas cinco vezes (1 mL de cada) com o tampão de incubação. As proteínas ligadas foram eluídas com 30 microlitros de péptidos FLAG (0,2 mg /ml) durante 30 min a 4 ° C e analisadas por transferência de Western com anticorpo anti-PRMT5.

Protein Expression and Purification

PRMT4, p44, pICln, ADNc ou SmD3 foi clonado no pET15d (Novagen) para ser expressa como uma sua

6-tag no terminal amino. Para a co-expressão PRMT5 com p44 ou pICln, PRMT5 foi clonado pACYCDuet (Novagen) com um grupo amino-terminal de A

6 etiqueta, e o p44 ou região de codificação pICln foi clonado no segundo sítio de clonagem múltiplo do mesmo vector com uma etiqueta de epitopo-FLAG N-terminal. Para a co-expressão PRMT5 com p44 e pICln, PRMT5 foi clonado pACYCDuet com um amino-terminal de A

6 tag, a região codificadora de pICln foi clonado no segundo sítio de clonagem múltiplo do mesmo vector, e a região de codificação de P44 foi clonada num vector pET com uma etiqueta de epitopo-FLAG N-terminal. As proteínas foram expressas em células BL21 (DE3) células a 30 ° C durante 3 h após a indução com 0,1 mM de isopropil-1-tio-β D-galactopiranósido. As células foram lisadas por sonicação três vezes durante 5 minutos cada em tampão de lise (HEPES 10 mM, pH 7,9, 0,3 M de KCl, 0,1% NP40, 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 2 βg /ml de pepstatina A e 2 microgramas /mL de leupeptina). As proteínas foram purificadas usando agarose Ni-NTA (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante, com eluição de imidazole e, subsequentemente, purificado em agarose M2 (Sigma-Aldrich) com a eluição péptido FLAG para PRMT5 contendo complexos. As histonas foram purificados a partir de células HeLa como descrito anteriormente [24].

Metiltransferase Ensaio

reacções de metilação foram realizados como previamente descrito, com algumas modificações [24]. As reacções que contêm 6 fmol de PRMT5 ou complexos contendo PRMT5, 1 micrograma de SmD3 ou histonas, e um microCi de S- [metil-

3H] adenosymethionine (Perkin Elmer) foram incubadas em 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM de EGTA, e EDTA a 1 mM a 30 ° C durante 1 h. As reacções foram fervidos em tampão de amostra de SDS e separados num gel de poliacrilamida a 15%. Os géis foram fixados durante 30 minutos em 40% de metanol-10% de ácido acético, incubadas em 20 ml de Amplify (Amersham Life Science) durante 10 min, secou-se, e exposta a filme de raios-X a -80 ° C.

resultados

PRMT5 e p44 Co-localizada no citoplasma das células do cancro da próstata

a localização subcelular de PRMT5 é regulado de forma dinâmica durante o desenvolvimento do mouse [8]. Ele localiza no núcleo durante o desenvolvimento inicial e é encontrada no citoplasma das células pluripotentes epiblasto da massa celular interna por dia embrionário 6,5. PRMT5 localiza principalmente para o citoplasma em células somáticas, tais como 293T, Cos-1, U2OS, e as células B normais [35], [38], [39]. No nosso estudo, a imunocoloração com o anticorpo anti-PRMT5 indicou que PRMT5 é predominantemente citoplasmático em PC3 cancro da próstata e células LNCaP (Fig. 1A, os painéis A e D).

Western blot das fracções nucleares e citoplasmáticos confirmou a sua localização sub-celular (Fig. 1B, painel superior). PRMT5 também foi detectado nos núcleos das células PC3 e LNCaP como corpos separados nucleares (Fig. 1A, os painéis C, F e G, indicadas pelas setas brancas).

O núcleo contém muitas estruturas nucleares dinâmicos, incluindo corpos de Cajal [40]. Embora a função do corpo de Cajal permanece desconhecida, existem evidências consideráveis ​​de que sugere que pode estar envolvido na maturação snRNA /biogénese, histona de processamento de pré-ARNm, e o conjunto dos transcriptosomes [41], [42]. O corpo Cajal contém muitos componentes, incluindo coilina (o marcador de corpos de Cajal), snRNPs e SMN. proteínas PRMT5, MEP50, pICln e SM formar o complexo methylosome que medeia a montagem de spliceosomal snRNP [18], [20]. SMN-complexo, contendo as proteínas Sm e PRMT5, é necessária e suficiente para a montagem de UsnRNA [21], [43]. Nós imunocoradas células LNCaP utilizando um anticorpo de coelho anti-coilina e um anticorpo anti-rato PRMT5. A imagem mesclada demonstrou que PRMT5 não está co-localizada com corpos de Cajal no núcleo (Fig. 1A, o painel h).

De acordo com nossos dados reportados anteriormente [25], a proteína p44 localizada predominantemente no citoplasma de PC3 câncer de próstata e células LNCaP (Fig 1A, painéis b e e;. A Fig. 1B, segundo painel). As imagens fundidas demonstraram uma boa co-localização de PRMT5 com p44 no citoplasma, ao passo que esta co-localização não foi observada no núcleo das células PC3 e LNCaP (Fig. 1A, os painéis C, F e G).

PRMT5 Contém três sinais nucleares de exclusão

o N-terminal reforçada proteína verde fluorescente (GFP) tagged PRMT5 (GFP-PRMT5) foi transitoriamente expressa em PC3, LNCaP e células COS 7, eo resultado proteína de fusão GFP-PRMT5 tinha uma localização citoplasmática predominante (Figura 2B, pains a e e;. dados não mostrados para as células PC3) nessas células, semelhante à da proteína endógena PRMT5 (Figura 1A, o painel d.). A proteína GFP localiza em ambos citoplasma e núcleo nestas células (Fig. 2B, os painéis i e j). Para identificar o determinante molecular para a localização subcelular de PRMT5, fragmentos que abrangem toda a grelha de leitura aberta do PRMT5 (Fig 2A). Sobrepostos foram clonados em quadro para gerar pcDNA-f: construções de fusão GFP-PRMT5. Estas construções foram transfectadas em células COS 7 para determinar as regiões críticas de PRMT5 necessário para a exportação nuclear ou importação

.

Dois fragmentos de proteína, PRMT5 (1-324) e PRMT5 (325-637), foram encontrados dentro do citoplasma em 100% das células transfectadas (Fig. 2A), sugerindo que estes fragmentos contêm sinais requeridos para a localização citoplasmática. A deleção de 144 ou 234 resíduos de aminoácidos da extremidade C-terminal do (1-324) fragmento PRMT5 não afectou a sua localização citoplasmática. Outras eliminações de seis ou sete resíduos de aminoácido a partir do N-terminal ou C-terminal levaram à completa perda de localização citoplasmática, indicando que estes resíduos de aminoácidos são críticos para a localização citoplasmática deste fragmento. A região PRMT5 (1-90) foi encontrada no citoplasma em 100% das células transfectadas (Fig 2A;. 2B, painel b) e é um romance NES, designado NES1. O NES1 não se parecem com os NES ricas em leucina convencionais [44].

análise de deleção Além disso identificou as outras sequências de dois NES na parte C-terminal da PRMT5. O aminoácido região que abrange os resíduos 500-560 localizados no citoplasma em 100% das células transfectadas (Fig 2A;. 2B, painel C). Assim, o PRMT5 (500-560) fragmento é também um NES funcionais, designadas NES2. O aminoácido região que abrange os resíduos 576-637 localizados no citoplasma em 98% das células transfectadas (Fig 2A;. 2B, painel d), e é outro NES funcionais designados, Nes3. A análise da sequência indicou que estas duas sequências de NES são novos e também não se parecem com os NES ricas em leucina clássicos [44]. A análise Western blot das fracções nucleares e citoplasmáticos de células transfectadas confirmou a localização citoplasmática das proteínas PRMT5 de comprimento completo identificado e Ness (Fig. 3C, painel superior). Não há sinais de localização nuclear (NLSs) foram detectadas na proteína PRMT5 por esta análise. O Ness identificado funcionaram de forma semelhante em células LNCaP (Fig. 2B, os painéis do meio) e células PC3 (dados não mostrados).

PRMT5 Promove citoplasmática translocação de p44

PRMT5 interage fisicamente e forma um complexo com p44 /MEP40 /WD45 /WDR77 em várias células, incluindo células de cancro da próstata [33], [34], [35], e co-localizada com p44 no citoplasma de células de cancro da próstata (Fig. 1A). Em seguida, investigaram se a expressão PRMT5 influencia localização subcelular de p44. As células COS 7 foram transfectadas com pcDNA-GFP-p44 sozinho ou em conjunto com pcDNA-PRMT5. Consistente com resultados anteriores publicados [28], os sinais de GFP-p44 fortes eram evidentes no núcleo em células COS transfectadas 7 (Fig. 3B, painel a). No entanto, a co-expressão de PRMT5 resultou na localização citoplasmática exclusiva de GFP-p44 em 100% das células transfectadas (Fig 3A;. 3B, painel b). A análise de deleção indicou que a parte C-terminal (resíduos de aminoácidos 325-637) é essencial e suficiente para promover a GFP-p44 translocação citoplasmático (Figura 3A;. 3B, painel d). A translocação citoplasmática-driven PRMT5 de P44 foi confirmada por análise Western blot das fracções nucleares e citoplasmáticos de células transfectadas (Fig. 3C, painel superior). Observações semelhantes foram obtidos com LNCaP e PC3 células (Fig. 3b, fundo dois painéis). O resíduo arginina conservada (R368) é essencial para a actividade de metiltransferase PRMT5 [45]. A mutação de R368A em PRMT5 aboliu a sua actividade de metiltransferase [24], mas não afectou a sua capacidade para promover a p44 citoplasmática translocação (fig. S1). Assim, PRMT5 é a força principal na determinação da localização citoplasmática da proteína complexa PRMT5-p44.

O Interaction PRMT5-p44 é necessária para o orientado a PRMT5 citoplasmática translocação de p44

A análise de deleção indicaram que os resíduos de aminoácidos 26 a 45 da proteína p44 eram críticos para a translocação citoplasmática-driven PRMT5 de p44 (Fig. S2). Nós mutado os resíduos de aminoácidos (

26CME

28

29RQL

31

35RYR

37 ou

42LLL

44) para alaninas na proteína p44 e examinou a consequência destas mutações sobre a translocação citoplasmática-driven PRMT5 de GFP-p44 (Fig. 4A). Estas mutações não alterou a localização subcelular de GFP-p44 em células COS 7 (Fig. 4A, os painéis G, M, S,-y versus a). No entanto, mutações (

35RYR

37

35AAA

37 e

42LLL

44 a

42AAA

44) aboliu PRMT5-driven translocação citoplasmática de GFP-p44 (Fig. 4A, painéis v, b “versus d).

Estas mutações foram expressos como proteínas marcadas no epitopo FLAG em células PC3. As mutações diminuição dos níveis de expressão da proteína p44 (Fig. 4B, painel superior, pistas 2-5 contra a pista 1). Imunoprecipitação com o anticorpo anti-FLAG imobilizada em pérolas de agarose (M2-agarose) indicou que as mutações (

35RYR

37

35AAA

37 e

42LLL

45 a

42AAA

44) em p44 aboliu a sua interação com PRMT5 (Fig. 4B, painel inferior, pistas 4 e 5 contra pistas 1-3). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a interação entre p44 e PRMT5 é essencial para a localização citoplasmática-driven PRMT5 de p44.

Ambos PRMT5 e p44 são necessários para o crescimento de células cancerosas da próstata

Para determinar se PRMT5 desempenha um papel no cancro da próstata, testámos se silenciar a expressão em células LNCaP PRMT5 iria afectar o seu crescimento. Para isso, foi elaborado um curto RNA interferente hairpin (shRNA) dirigido contra a sequência PRMT5. Para testar se a expressão de shRNA poderia suprimir PRMT5, que infectaram células LNCaP com o vetor lentiviral transdução de um segmento de ADN tal sequência especificando shRNA. Como mostrado na Fig. 5A, o shRNA dramaticamente reduzida expressão de proteína PRMT5 em células LNCaP de 4 dias após a infecção por lentivírus (pista 2, painel superior), em comparação com que a expressão por um não-alvo (NT) shRNA (pista 1, painel superior), cuja sequência fez não encontrou nenhum gene humano conhecido.