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Sumário

O aumento indica que vários tipos de células cancerígenas são capazes de produzir IgG. A função exacta de IgG derivadas do cancro tem, no entanto, não foi elucidado. Aqui demonstramos a expressão de genes de IgG com a recombinação V (D) J em 80 casos de cancro colorectal, linhas celulares de cancro do cólon e 4 tendo um tumor modelo de ratinho deficiente imune. expressão IgG estava associada com a diferenciação do tumor, estágio pTNM, comprometimento de linfonodos e infiltração inflamatória e positivamente correlacionada com a expressão da ciclina D1, NF-kB e PCNA. Além disso, foi investigado o efeito de IgG derivada de cancro nos comportamentos malignos de células de cancro colorrectal e mostraram que o bloqueio de IgG resultou num aumento da apoptose e negativamente o potencial para a formação de colónias independentes de ancoragem e a invasão de células de cancro. Estes achados sugerem que IgG sintetizada pelas células de câncer colorretal está envolvido no desenvolvimento e crescimento do câncer colorretal e bloqueio de IgG pode ser uma terapia potencial no tratamento deste tipo de câncer

Citation:. Niu N, Zhang J, Huang T , Sun Y, Chen Z, Yi W, et al. (2012) Expressão IgG no câncer colorretal humano e sua relação com comportamentos de células cancerígenas. PLoS ONE 7 (11): e47362. doi: 10.1371 /journal.pone.0047362

editor: Georgina L. Segure, University of Aberdeen, Reino Unido

Recebido: 09 de junho de 2012; Aceito: 11 de setembro de 2012; Publicação: 01 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Niu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do jovem e de meia-idade cientistas Research Prêmios Fundação da província de Shandong (No. BS2011SW051) e National Natural Science Foundation da China para NN (No. 81.100.885). Os autores também reconhecem National Natural Science Foundation da China para JG (No. 30.971.150). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

recentemente, vários relatórios foram publicados descrevendo a expressão de imunoglobulinas em células não linfóides, incluindo vários sarcomas e carcinomas de [1] – [4]. Antes desses relatórios, imunoglobulinas sempre foi conhecido por ser produzido unicamente por linfócitos B. IgG foi detectada em tecido de cancro do cólon de alguns casos e o fragmento da região constante de IgG foi observado em algumas linhas celulares de cancro do cólon. Com um anticorpo contra CA215, que foi uma parte de imunoglobulinas expressas por células de cancro do ovário, Lee et al detectados IgG regiões constantes da cadeia pesada em tecidos de cancro do cólon, com uma razão positiva de 44% [1], [5]. Em 2003, Qiu et al demonstraram expressão de IgG em tecidos de 6 casos de cancro colo-rectal (CRC) e numa linha celular de carcinoma do cólon (HT29) [3]. Com RT-PCR, Kimoto et al detectada cadeia pesada da região constante de IgG a partir de uma linha celular de cancro do cólon SW116 [2].

In vitro

estudo com um 29 do cólon HT linha celular de carcinoma induzido com ASODN sugeriram que a IgG derivada de cancro suprimiu a apoptose [6], o que estava de acordo com os resultados de Lee et ai [1] e Qiu et al [3], que mostraram a inibição do crescimento tumoral com uma linha de células de carcinoma em animais e em experiências in vitro. Estas observações dão origem à hipótese de que o câncer derivadas de IgG promove o crescimento do câncer de cólon e este é o foco do presente estudo

Até agora, a relação entre a expressão de IgG e características clínico-patológicas e marcadores biológicos [7]. – [9] associada com o prognóstico e resposta terapêutica no CRC não foi investigada. Neste estudo, foram investigados primeiro a expressão de IgG no tecido de 150 casos de CRC e analisada a correlação da expressão de IgG e várias características clinicopatológicas e biológicas. Em seguida, a produção de IgG foi confirmada em quatro linhas celulares de CRC em ambos os níveis de mRNA e proteína. Diversas regiões de IgG cadeias pesadas e leves e enzimas essenciais para a síntese de IgG foram detectados nas amostras. Os efeitos da IgG sobre comportamentos biológicos malignas, como a proliferação, formação de clone, invasão e apoptose foram investigados com experimentos de neutralização de anticorpos e inibição siRNA. Os resultados fornecem insights sobre novos papéis clínico-patológico de IgG derivados de câncer no CRC e fortalecer os fundamentos para o desenvolvimento de terapias que visem IgG derivados de câncer.

Materiais e Métodos

As amostras de tecido

, tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina de 150 casos que tinham sido tratados /analisadas para CRC e as amostras pareadas normais da mucosa retal (usados ​​como controles negativos) e vinte amostras de biópsia frescas de adenocarcinoma colorretal foram coletados do Hospital Filiado da Universidade de Medicina Weifang. estágio pTNM foi feita de acordo com sistema de estadiamento TNM da AJCC /UICC [10]. Diferenciações dos cânceres foram classificados como bem /moderada ou pobre. infiltrado inflamatório foi avaliado de acordo com os critérios de inflamação crônica (infiltração de células mononucleares) descrito anteriormente [11]. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Medicina de Weifang e consentimento escrito foi obtido dos pacientes

As linhas celulares

linhas celulares de CRC Humano de diferenciação diferente (moderadamente diferenciado, HT29 e SW480.; fracamente diferenciado, LOVO e HCT116) [12] e Raji (linha celular de leucemia linfocítica B como um controlo positivo), Jurkat (linha de células T de leucemia linfocítica como um controlo negativo) foram adquiridas da ATCC (12 de Junho, 2008). linhas celulares de CRC foram cultivadas em DMEM com soro fetal de bovino ultrabaixa-IgG (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) em DMEM e apenas 12-24 horas antes da experiência.

A imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica ( IHC) foi realizada em tecidos de CRC e combinados marginais com controlos apropriados, como descrito anteriormente [13], [14]. Detalhes de anticorpos primários de imunoglobulina de cadeia γ (Igγ), imunoglobulina κ cadeia (Igκ), CEA (antigénio carcinoembrionário), CD16 (FcyR III), CD32 (FcyR II), CD64 (FcyR I), P53, PCNA, Bcl-2 , MMP-2, NF-kB, e a Ciclina D1 estão listados na Tabela S1. soro normal de cabra substituído por anticorpo primário foi usado como controlo negativo. a dupla marcação de IgG e NF-kB ou ciclina D1 ou PCNA em células cancerosas foi realizada como descrito anteriormente [15].

Scoring imunorreatividade

Os cortes corados foram examinados e marcou de forma independente por 2 do os autores (NN e WY) sem informação dos dados clínico-patológicos. A avaliação foi realizada em cinco regiões câncer selecionados aleatoriamente com uma ampliação de 400 ×. Níveis de expressão de IgG em células cancerosas foram com base na soma da pontuação da percentagem de células positivas (marcado como: 0 = 5%, 1 = 5-25% 2 = 25-50%, 3 = 50%) eo de intensidade de coloração (pontuada como: 0, ausência de sinal; 1, luz vermelha ou rosa; 2, vermelho, 3, vermelho escuro). Os casos com escores de 0-3 foram rotulados como ‘manchado fracamente’ e os casos com 4-6 como “fortemente manchado ‘. proteínas localizadas nucleares só foram pontuados de acordo com a sua percentagem positiva em células de câncer [16]:. 25% foi agrupado como “negativo”, ≥25% foi agrupado como “positiva”

sonda cRNA preparação e hibridização in situ

O comprimento adequado de sonda para ISH foi de 300-500 bp, e as regiões constantes de κ e da cadeia λ foi muito curta para ser sondas eficazes. Por conseguinte, duas sondas de ARNc anti-sentido específicos dirigidos contra a imunoglobulina G1 humana de cadeia pesada (IGHG1) foram preparadas e a hibridação in situ (ISH) foi realizada como descrito anteriormente [4], [17]. tecido tonsilar e tecidos de nódulos linfáticos na parede colorectal foram utilizados como controle positivo, e desliza tecido tonsilar incubadas com sondas de sentido ou tecido CRC incubados com uma sonda não relacionada foram empregados como controles negativos.

curtas em tandem repeat análise análise

curta repetição em tandem (STR) das linhas celulares de CRC foi realizada por terra · HUAGENE BIOSCIENCES CO., LTD (Guangzhou, China) usando PowerPlex 16 HS System (Promega).

citometria de fluxo

Para a detecção de IgG, a citometria de fluxo com HT29, SW480, HCT116, linhas de células LOVO foram realizados como descrito anteriormente [3]. monoclonal de ratinho anti-humano Igγ (1:500, Sigma) e de cabra marcado com FITC de murganho anti-IgG (1:100, Jackson, West Grove, PA, EUA) foram usados ​​como anticorpos primário e secundário. A linha celular Raji foi usada como um controlo positivo. FITC-CD19 (Sigma) foi utilizado para verificar uma possível contaminação por linfócitos B.

imunofluorescência de dupla marcação

imunofluorescência (IF) coloração dupla com Igγ e Igκ foi realizada em linhas celulares, como descrito anteriormente [4], [13]. De cabra anti-IgG de coelho-TRITC (1:100, Jackson) ou de cabra anti-IgG de ratinho-FITC (1:100, Jackson) foi usado como o anticorpo secundário. IgG de rato normal e IgG de coelho normal (Santa Cruz) foram utilizados em vez dos anticorpos primários. DAPI (azul sinal) (1:500; Sigma) foi usada para visualizar os núcleos

RT-PCR

O ARN total foi isolado a partir das linhas de células utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad,. CA, EUA). RQ1 RNase livre de DNase (Promega, Madison, WI, EUA) foi utilizado para tratar amostras de ARN para excluir contaminação por ADN genómico. Cinco ug de ARN total extraído foi transcrito de forma inversa com oligo (dT)

18 iniciador (Fermentas, Burlington, Ontário, Canadá) usando SuperScript III Transcriptase Reversa (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante.

PCR foi realizado com LA Taq polimerase (Takara, Dalian, China). iniciadores específicos para IGHG1, a terceira região de determinação de complementaridade (CDR3) do gene da cadeia pesada (que inclui a sequência de VDJ), constante (Igκ) e da região variável (VK) de Igκ, a região constante de Igλ (Igλ), Iγ-Cy estéreis transcritos de linha germinal (Iγ-Cy), induzida por activação da citidina-desaminase (AID), a recombinação de genes de activação -1 e 2 (e RAG1 RAG2) foram os mesmos como descrito anteriormente [3], [4]. CD19 foi amplificada a excluir contaminação por linfócitos e β-actina foi amplificada como referência interna [3]. Detalhes dos iniciadores foram listados na Tabela S2. Identificação do produto de PCR foi confirmada por sequenciação de ADN e de detonação.

microdissecação de captura laser (LCM), assistida por RT-PCR

LCM assistida RT-PCR foi realizada em 20 casos de recém-congelado CRC cirúrgica amostras como descrito anteriormente [4]. IGHG1, Igκ, segmento recombinação CDR3, CD19 e β-actina foram amplificados com os mesmos iniciadores para RT-PCR. Os linfócitos de nódulos linfáticos na parede do cólon foram utilizados como um controlo positivo, e água, em vez do modelo de cDNA foi utilizado como um controlo negativo. As amostras com CD19 detectável foram excluídos experimentos posteriores.

Western blot e siRNA para baixo-regulação

As proteínas citosol das quatro linhas humanos CRC celulares (40 ug /pista) foram analisados ​​com 10% de SDS -Page (Igγ sob condições não redutoras e Igκ sob condições redutoras). IgG de soro humano padrão (0,02 ^ g /pista, Sigma) foi utilizado como controlo positivo. Igγ de cabra anti-humano (1:2500; Sigma) ou o Igκ de murganho anti-humano (1:2000, Abcom) foram utilizados como os anticorpos primários

siRNA (5′-CCAAGGACACCCUCAUDAUTT-3 ‘, 5. ‘-AUCAUGAGGGUGUCCUUGGTT-3’) foi desenhado de acordo com a região constante de IgG e transfectado para células LOVO com X-tremeGene SiRNA Transfection Reagent (Roche, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante derivada de cancro. Uma sequência aleatória foi utilizado como controlo negativo. Eficácia da IgG down-regulação foi verificada com Western blot.

Os estudos em animais

células LOVO cultivadas (5 × 10

6) foram inoculadas em SC axilas frontal esquerdo da imunodeficiência combinada grave (SCID). Cinquenta ul de sangue foi obtido a partir da veia do olho utilizando tubos capilares no 0, 7, 14 e 21 dias após a inoculação. 1 uL de soro foi analisado com 10% de SDS-PAGE sob condições com os mesmos anticorpos não redutoras como descrito acima. No dia 21, os tumores foram colhidos e H . E coloração, IHC e ISH foi realizada em secções de tecido

proliferação celular e apoptose análise

Um ensaio de proliferação de célula de MTS (CellTiter 96 AQ Uma solução de Proliferação celular Assay Kit, Promega) foi realizada numa placa de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. Igγ anticorpo anti-humano de rato (10-1000 nM, Sigma) foi adicionado ao meio de cultura isento de soro e incubadas durante 48 horas e DO490 foi analisada [18]. anticorpo de rato anti-IgM humana (cadeia μ específica, 10-1000 nM, Sigma) foram utilizados como controlo negativo. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. A neutralização de anticorpos IgG com IgG anti-ratinho de coelho foi realizada com concentrações crescentes (0-1000 nM) de IgG anti-ratinho de coelho adicionado ao sobrenadante imediatamente a seguir à adição de 100 nM de rato anti-humano Igγ.

para a análise por apoptose, as células de CRC foram incubadas durante 48 h em meio de cultura isento de soro com 100 de IgG nM e analisados ​​com o kit de anexina V-PI (Human Disease Universidade de Pequim Genomics Research Center, Pequim, China), como descrito anteriormente [3]. Anticorpo de IgM (100 nM, Sigma) foi utilizado como um controlo negativo. células LOVO transfectadas pelo siARN foi também investigada para propriedade proliferativa e apoptótica, tal como descrito acima.

ensaio de agar mole na formação de clones

ensaio em agar mole foi realizado como descrito anteriormente [19]. Rato Igγ anti-humano (100 nM, Sigma) foi usada e anticorpo IgM anti-humano (100 nM, Sigma) ou PBS em vez do anticorpo Igγ foi usado como controle.

ensaio de invasão celular

ensaio de migração celular de modificação foi realizada com células LOVO e anticorpo IgG de 100 nM de murganho anti-humano (Sigma), como descrito anteriormente [20]. A membrana foi corada com H E. Cinco campos aleatórios por membrana foram fotografadas com um microscópio BX51 (Olympus) no × 400 ampliações. As células foram contadas e invadiram números médios foram calculados para cada membrana. células LOVO transfectadas por siRNA foi também examinada.

A análise estatística

diferença na expressão IgG entre as amostras normais da mucosa e tumores primários, diferença na expressão IgG entre as várias características clinicopatológicas, e a correlação entre IgG expressão e as diversas variáveis ​​biológicas relacionadas com o cancro foram testados usando o χ

2 de teste. foram considerados estatisticamente significativos valores de dois lados de p de menos do que 5%. A maioria dos cálculos foram realizados com SPSS 12.0.

Resultados

Expressão e distribuição da proteína IgG e seu mRNA no tecido CRC

humana

Em todos os casos investigados, tanto Igγ e Igκ foram detectados principalmente no citoplasma das células cancerosas e dos linfócitos B no estroma (Figura 1A-e), e também no tecido conjuntivo mesenquimal (mas não o músculo liso) de tecidos de cancro (Figura 1A, e). A co-expressão de CEA com IgG e seu ARNm foi detectada em secções de tecido consecutivos (Figura 1A). Nas amostras emparelhadas de mucosa normal, a IgG não era detectável no epitélio glandular (Figura 1B). Igγ foi fracamente expresso em 83 (55,3%) e fortemente expresso em 67 (44,7%) dos 150 adenocarcinomas. receptores de IgG foram detectadas apenas nas células inflamatórias do estroma, mas não nas células cancerosas

A:. A co-expressão de CEA, proteína e ARNm de IgG IGHG1 em células de CRC. B-D: Expressão de IgG (sinais vermelhos) no tecido do cólon normal (B), bem diferenciado (C) e pouco diferenciado (D) CRC. E: A expressão de IgG em células de câncer de ninhos (setas) infiltrando na camada muscular profunda da parede do cólon. O nível de expressão de IgG é superior à infiltração de células cancerosas (E) do que nas células cancerosas do tumor “primário” mostrada em D. F: ninhos de CRC (CRC) e nó de linfa (LN) antes e depois de LCM. L: electroforese em gel de agarose de amplificação por RT-PCR de células de CRC microdissecadas e dos gânglios linfáticos. H: co-localização de proteína IgG expressa no citoplasma (sinal vermelho) e ciclina D1 (painel esquerdo), o NF-kB (painel do meio) e PCNA com localização nuclear (painel da direita) (sinais púrpura-azul). ML: camada muscular. Bares = 50 mm (A-E, G), 20 mm (F).

Para adenocarcinoma, a expressão de IgG diferiu entre os graus de diferenciação. Geralmente, apenas algumas células cancerosas isoladas ( 25%) foram positivos em adenocarcinomas bem diferenciados (Figura 1C), enquanto que mais células cancerosas individuais ou aqueles agrupados foram positivos em adenocarcinomas moderadamente diferenciados, ea maioria das células cancerosas ( 50% ) foram positivos em adenocarcinomas pouco diferenciados (Figura 1D). Nos ninhos de cancro infiltrantes na camada muscular mais profunda, a razão positiva foi mais elevada e a intensidade de coloração mais forte do que nas células de cancro infiltrantes não localizadas na mucosa (Figura 1E e D).

ARNm de IgG (IGHG1 ) foi detectada no citoplasma das células cancerosas com hibridação in situ (Figura 1A, painel da direita; Figura S1 a). A especificidade das sondas e o rigor para ISH foi bem estabelecida com 2 pares de sondas (anti-sentido e com sentido) para diferentes regiões da região constante de IgG e uma sonda não relacionada aleatória. Todos os 2 sondas antisense deu completamente identitical na distribuição e intensidade dos sinais positivos. No controlo positivo, os nódulos linfáticos da parede rectal (Figura S1 B), IGHG1 foi localizado no citoplasma dos linfócitos B. Nos controlos negativos (sonda aleatória aplicada a tecidos de CRC e detectar sondas aplicadas ao tecido de amígdalas), não foi detectado sinal positivo (Figura S1 C e D). Todos os casos testados positivos para IgG imunocoloração também foram positivas para o ARNm IGHG1 hibridação in situ. A presença de ARNm de IgG foi também confirmado com LCM assistida por RT-PCR (Figura 1F e G). IGHG1 e Igκ foram amplificados com êxito após o isolamento das células de cancro a partir de amostras congeladas de CRC. Todos os vinte amostras testadas positivamente. Além disso, CDR3, incluindo a sequência de V-D-J, foi também amplificado com sucesso a partir destas amostras. Sem transcritos de CD19 eram detectáveis, desse modo, excluindo a contaminação do linfócito B. CD19, IGHG1, Igκ, e CDR3 foram todos amplificados a partir de amostras de controlo positivo. Nenhuma banda era detectável quando foi utilizado o controlo negativo.

Correlação de expressão IgG com características clínicas e biológicas da CRC

A Tabela 1 mostra a correlação de expressão IgG em células cancerosas primárias com os vários aspectos clínicos variáveis. Houve uma maior freqüência de forte expressão IgG no adenocarcinoma pouco diferenciado (67,3%) do que nas mais diferenciadas (bem e moderadamente diferenciado, 33,7%, P = 0,035). expressão IgG não mostrou diferença significativa entre os estágios pTNM individuais (P = 0,091). No entanto, quando comparamos a expressão de IgG na fase I-II neoplasia com que no estadio III-IV, o último teve uma maior frequência de coloração forte do que o anterior (59,7 vs 32,5%, P = 0,027). Quando os cancros com infiltração inflamatória fraca foram comparados com aqueles com forte infiltrado inflamatório, houve uma tendência para a ex para ter uma maior frequência de coloração forte do que o último (49,5 vs 33,3%, P = 0,041). Em termos de linfonodo encenação, CRC de estágio N

1 e N

2 ocuparam uma proporção significativamente maior IgG-positivos (54,8, 63,9 vs 32,5%, P = 0,042). Não houve correlação significativa de expressão IgG com a idade, sexo, localização câncer ou padrão de crescimento (todos P 0,05)

A Tabela 2 apresenta a relação entre a expressão de IgG e as expressões de vários marcadores biológicos.. expressão de IgG mostrou correlação positiva com expressões da ciclina D1 (P = 0,046), o NF-kB (P = 0,019), e o PCNA (P = 0,037), e a correlação negativa com a expressão de Bcl-2 (P = 0,041), e nenhum correlação significativa com as expressões de MMP-2 e p53 (tanto P 0,05). Co-localização de ciclina D1, NF-kB ou PCNA (coloração nuclear) e IgG (coloração citoplasmática) foi claramente estabelecida com cama de imunocoloração (Figura 1H).

A expressão da proteína IgG e seu mRNA em linhas celulares de CRC

as identidades das linhas celulares de CRC empregues foram verificadas através do teste STR e os perfis mostraram% de confirmação 100 com os fornecidos por ATCC (Figura S2 a e B). A concentração de IgG em ultrabaixa-IgG de FBS para a cultura de células foi confirmado como sendo de 2,3 ± 0,9 ug /ml, suficientemente baixo para a experiência. a expressão da proteína IgG foi demonstrado em todas as quatro linhas celulares de CRC com SE. A co-expressão de Igγ e Igκ também foi confirmada (Figura 2A). Igγ e Igκ foram localizadas principalmente no citoplasma, e parcialmente nos núcleos das células cancerosas. Não há sinal de IgG foi detectada em células Jurkat

A: Igγ e Igκ são detectados em todas as quatro linhas CRC por imunofluorescência coloração duplo. (Igγ, TRITC; Igκ, FITC; fundir, amarelo.). Barras = 50 pm. B: Percentagem de células positivas de IgG em Raji, HT29, SW480 e LaVO. C: electroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação por RT-PCR. R, tratada com DNase de ARN como molde; C, o ADNc como molde. D: detecção de IgG através de Western blot em todas as quatro linhas celulares. E: proteína e ARNm de IgG são detectados com IHC e ISH em tumores colhidos em 21 dias de células LOVO em ratinhos SCID. IgG é detectável no soro ao dia 7, 14, e 21.

A contaminação dos linfócitos B foi excluída usando marcado com FITC imunocoloração de CD19 (Figura S2 C). A percentagem de células positivas para IgG foi determinada por FACS com anticorpo Igγ. A percentagem de células positivas para IgG era de 75,2%, 20,04%, 24,4%, 39,54% e 30,91% em Ra j i, HT29, SW480, LOVO e linhas de células HCT-116, respectivamente (Figura 2B). A percentagem média de células de IgG-positivo de HT29 moderadamente diferenciado e linhas celulares SW480 (22,22%) foi mais baixa do que a de linhas de células LOVO pouco diferenciados e HCT116 (35,23%, P = 0,043).

Em RT-PCR , sensibilidade e especificidade foram bem estabelecido em vários experimentos. Em primeiro lugar, a DNase livre de RNase foi usada para eliminar o possível efeito de ADN genómico. CD19 foi amplificado para descartar a possível contaminação do linfócito B. Em segundo lugar, várias regiões de IgG cadeias pesadas e leves e enzimas essenciais para a síntese de IgG foram investigados. Em terceiro lugar, extensivos controles positivos e negativos foram utilizados para o mesmo amplificação. Adiante, todos os produtos amplificados foram sequenciados e o identitied dos produtos amplificados foram confirmadas. Usando transcritos por RT-PCR, IGHG1, Igκ, VK, e Igλ Iγ-Cy foram detectados em todas as quatro linhas de células, com as intensidades das bandas positivas que são mais fracos do que os das células Raji. Além disso, CDR3, incluindo o V (D) J sequência de recombinação e RAG1 e RAG2 também foram detectados, enquanto a ajuda foi detectada apenas em LaVO e linhas de células HCT116 (Figura 2C e Figura s1e).

Quarenta (40) ug de proteína total foi extraído de cada linha celular. A proteína total foi corrida num gel de Western blot e reagiu com o anticorpo de IgG. Uma banda com o mesmo peso molecular, mas com menos intensidade do que, foi detectada a banda obtida com 0,02 ug de IgG humana (Figura 2D). Quanto melhor as linhas de células foram diferenciadas, a menos de IgG foi expressa. Sob condição reduzida, bandas Igκ foram detectados em 25 KD em HT29, SW480, LaVO e linhas de células HCT116. Similar às observações por Huang et al [21], também detectada uma banda adicional, a 23 KD em HT29, linhas de células SW480, LOVO e. As quantidades de Igκ eram menos do que as de IgG de soro padrão.

Expressão e secreção de IgG em ratinhos SCID com tumor

No dia 21 após a inoculação de células LOVO cultivadas em ratinhos SCID, o os tumores foram colhidos. O tumor consistiu em células cancerosas em cluster com bordas de célula indistintas sem estroma. Todas as células cancerosas foram IgG positiva, com sinais positivos granular no citoplasma. A distribuição de mRNA IGHG1 detectada por meio de hibridação in situ foi semelhante à da proteína IgG detectado por IHC (Figura 2E).

de SDS-PAGE mostrou que, como o cancro tornou-se maior, bandas significativamente mais fortes de IgG humana foram detectadas no soro de ratinhos SCID (Figura 2E).

bloqueio da IgG afecta as funções biológicas de células derivadas do cancro da BF-

em comparação com os controlos negativos (e soro de ratinho anti-IgM humana) , IgG anti-humano mostraram um aumento significativamente a inibição da proliferação de células LOVO, especialmente nas concentrações de 100 e 1000 nm (Figura 3A). Para a experiência que se segue, nós escolhemos 100 nm como a concentração mais eficaz. Como a IgG de coelho anti-rato podem impedir a ligação de IgG anti-humano de rato para moléculas de IgG humana como um resultado do impedimento estérico [22], foi ser usado para antagonizar os efeitos de anti-IgG humana. O tratamento com IgG anti-ratinho de coelho diminuiu eficazmente a inibição do crescimento de células cancerosas por ratinho anti-IgG humana (Figura 3B)

A:. MTS com uma série de concentrações de anti-IgG humana (10-1000 nM ) anticorpo. B: O tratamento com IgG de coelho anti-rato aumenta as taxas de apoptose em células LOVO. C: apoptótica percentagem de células LOVO é mais elevada depois da incubação com o anticorpo de IgG de anticorpo IgM ou com soro de ratinho. D: Bloqueio dos derivados de câncer IgG resulta em alterações morfológicas. E: anticorpo IgG reduz o crescimento independente de ancoragem de células malignas CRC. F: Bloqueio da IgG-cancro derivados suprime a capacidade de invasão de células de CRC. Bares = 50 mm.

A análise apoptose (Figura 3C) mostrou que o tratamento com o anticorpo IgG resultou em uma taxa mais elevada de células LOVO apoptóticos (40,16%) em comparação com aqueles tratados com o anticorpo IgM (13,7% , P = 0,0364) ou soro de ratinho (10,9%, P = 0,0417).

características morfológicas de células LOVO também foram afetados pelo tratamento com anticorpo IgG (Figura 3D). Quando incubada com anticorpo anti-IgM (100 nM), as células LOVO cresceram livremente durante o desenvolvimento de vários processos celulares. Em contraste, incubadas com anticorpo anti-IgG (100 nM), tornou-se células LOVO rodada com muito menos número de processos celulares e mostraram um padrão de crescimento orientada para o conjunto limitado.

análise agar mole mostrou que as células cancerosas co LOVO -cultured com anticorpo anti-IgG humana cresceram mais lentamente e gerou colónias significativamente menores, que não eram transparentes e tiveram fronteiras celulares borradas, do que aqueles das mesmas células cancerosas LOVO tratados com anticorpo anti-IgM humana (Figura 3E). O tratamento com PBS, em vez do anticorpo IgG deu resultados semelhantes aos tratados com anticorpo anti-IgM humana. O número médio de formação de colónias em células LOVO tratados com IgG anti-humana (23,7 ± 5,2 /35 plano mm) foi significativamente menor do que a de células LOVO tratados com anticorpo IgM (46,1 ± 3,2 /35 plano mm, P = 0,0374).

o ensaio de invasão de células demonstraram que o número médio de células invadidas foi menor nas células LOVO incubadas com anticorpo anti-IgG humana (32,3 ± 3,9) do que naquelas incubadas com anticorpo IgM (116,5 ± 5,2, P = 0,0293) (Figura 3F).

Efeito de interferência IgG sobre os comportamentos biológicos das células CRC

para investigar possíveis papéis de IgG em comportamentos biológicos ainda mais, baixo regulação da expressão de IgG com a interferência siRNA foi realizada. Como mostrado na Figura S3 A, a síntese de proteínas de IgG mais do que 50% foi reduzido de forma eficaz com o siARN. Em MTS, IgG sub-regulação suprimiu a proliferação de células LOVO (Figura S3 B). Anexina V-PI imunofluorescência de dupla marcação mostrou que as células precoce (Anexina V +) e tardia (PI +) apoptótica foram aumentados com IgG knockdown por siRNA em comparação com Si-controlo (Figura S3 C). Enquanto isso, IgG knockdown também diminuiu transpo� células (Figura S3 D).

Discussão

níveis séricos de IgG e IgA são muitas vezes detectados em pacientes com cancros epiteliais [23], [24] incluindo aqueles com CRC [25], [26]. Além disso, IgG e IgA foram encontrados para ser expresso em linhas celulares e tecidos de vários tipos de cancro epiteliais, incluindo CRC [3], [4], [6], [27], [28]. Embora o fenômeno de expressão Ig em cancros estabeleceu-se, a função de Ig derivadas de câncer permanece incerto. Além disso, pouco se sabe sobre as relações entre IgG derivados de câncer e as características clinicopatológicas e comportamentos biológicos de carcinomas. Chen et al. relataram recentemente que a expressão de IgG em sacomas de tecidos moles foi associada com o grau do tumor e expressão de PCNA, Ki-67 e Ciclina D1 [29]. No presente estudo, foi confirmada a presença de expressão de IgG em células colorrectais, tanto a proteína e os níveis de mRNA. A falta de expressão do receptor de imunoglobulina e a detecção do mRNA de IgG em células de CRC excluída a possibilidade de que a IgG circulante foi recolhido por estas células cancerosas. Nós demonstramos uma correlação positiva entre a expressão de IgG, grau de diferenciação do tumor, estágio pTNM e comprometimento de linfonodos. Expressão de IgG foi mais forte nos tecidos de CRC com pobre diferenciação ou com pTNM estadio III-IV, do que naqueles com melhor diferenciação ou pTNM I-II. expressão IgG pode estar associada negativamente com infiltrado inflamatório, como cancros com infiltração inflamatória mais leve mostraram expressão IgG mais forte. Nossos achados em tecidos de câncer colorretal são consistentes com nossas observações em linhas de células colorretal, mostrando uma menor quantidade de IgG em células de câncer de diferenciação moderada (HT29 e SW480), quando comparados com os de baixa diferenciação (LaVO e HCT116). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a IgG derivada de cancro pode estar envolvido no processo de desdiferenciação, infiltração e metástase de CRCs, e que pode desempenhar um papel auto-proteger durante o desenvolvimento do cancro. Na verdade, em certas condições de imunoglobulinas foram encontrados para promover o crescimento do cancro [30], [31], e este fenómeno tem sido sobretudo atribuída à blindagem de epitopos alvo na superfície de células cancerosas por anticorpos “anti-tumor” [32 ], [33]. Um estudo de pacientes com cancro do ovário sugeriram que tais anticorpos de bloqueio pode ser aberrante glicosilada moléculas de IgG, que são incapazes de desencadear respostas imunitárias [24]. Além de cadeias pesadas de imunoglobulina, receptores de células T (TCR, tais como-um e TCR-b), imunoglobulina -like moléculas de adesão celular (tais como CD47, CD54, CD58) foram também encontrados para ser expresso em células cancerosas [34]. Os anticorpos IgG e TCR levou a citotoxicidade dependente do complemento e a apoptose de linhas celulares de cancro. Assim, estas “proteínas superfamília das imunoglobulinas” foram hipótese de ser auto-protecção e envolvida na proliferação de células cancerosas [34]. Uma alternativa, papel indirecto de IgG na estimulação do crescimento do tumor pode envolver factor de crescimento transformante beta (TGF-β) que é transportada por imunoglobulinas e tem sido demonstrado para impedir respostas de células T citolíticas [35].