Abstract
A célula-tronco cancerosas (CSC) modelo descreve que os tumores são organizadas hierarquicamente e mantido por CSCs que encontram-se no ápice. CSCs foram “identificou” numa variedade de tumores por meio do ensaio de formação de tumor, em que as células tumorais que se distinguem por um determinado marcador da superfície celular (conhecida como um marcador de CSC) foram transplantadas em murganhos imunodeficientes separadamente. Em tais ensaios, as células tumorais positivo, mas não negativa para o marcador CSC (aqui definido como CSC
+ e CSC
– células, respectivamente) têm a capacidade de tumor de formação e geração de ambas as progênies. No entanto, aqui vamos mostrar que a CSC
+ e CSC
– células exibem proliferação semelhante nos estados nativos. Usando um método de rastreio de células, nós demonstramos que a CSC
– células exibem tumorigénese e proliferação semelhante como CSC
+ células quando elas foram co-transplantados em ratinhos imunodeficientes. Através da construção de uma única célula sublinha derivado de série, demonstramos ainda que CSC
+ e CSC
– células do CSC marcador expressando tumores poderia invariavelmente gerar tanto progênies, e as suas características são mantidas entre as diferentes gerações, independentemente das origens (CSC
+ – derivado ou CSC
– derivada). Estes resultados demonstram que as células tumorigénicas não pode ser distinguido por marcadores comuns CSC sozinho e propomos que cuidados devem ser tomados ao usar esses marcadores de forma independente para identificar as células-tronco do câncer, devido à plasticidade fenotípica das células tumorais
Citation:. Huang SD, Yuan Y, Tang H, Liu XH, Fu CG, Cheng HZ, et al. Cells (2013) tumorais positivos e negativos para o cancro da Common Stem marcadores de células são capazes de iniciar o crescimento tumoral e Gerando Ambas as progênies. PLoS ONE 8 (1): e54579. doi: 10.1371 /journal.pone.0054579
editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de novembro de 2011; Aceite: 13 de dezembro de 2012; Publicação: 21 de janeiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (bolsas 30471718, 30801094 e 30872552) eo Shanghai Municipal Natural Science Foundation (concessão 10140902300). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Uma questão fundamental no campo da pesquisa de tumor é que as células podem iniciar tumores. Dois modelos foram apresentadas para explicar o início de tumores [1], [2]. O modelo de evolução clonal (também conhecido como o modelo estocástico) implica que os tumores compreendem células com igual potencial tumorigénico e que qualquer heterogeneidade funcional é atribuível a influências aleatórias ou estocásticos (intrínseca ou extrínseca) que podem alterar o comportamento das células individuais do tumor. Em contraste, a célula estaminal cancro modelo (CSC) (também conhecido como o modelo de hierarquia) alega que, como tecidos normais, que são hierarquias celulares mantidas por células-tronco, os tumores podem ser explicadas pelas organizações hierárquicas, em que CSCs encontram-se no vértice mantenha a capacidade de iniciação do tumor, auto-renovação e geração de células fenotipicamente diversos sem ou com capacidade proliferativa limitada. Os defensores do modelo de CSC propor que CSCs podem explicar comportamentos tumor, tais como metástase [3], [4] e resistência à quimioterapia ou radioterapia [5] – [9]. Assim, a terapia CSC-alvo pode ser a futura direcção do tratamento do tumor [10] – [13].
Através de ensaio de formação de tumor em que as células fenotipicamente diversos foram transplantados separadamente em ratos imunodeficientes, CSC foi a primeira “identificados “na leucemia humana mielóide aguda (AML) uma vez que apenas CD34
+ CD38
– as células foram encontrados para ter a capacidade de iniciação do tumor, auto-renovação e geração de células de outros subgrupos sob essa condição [14]. Desde então, o modelo experimental xenotransplante tem sido amplamente utilizado em estudos CSC. Usando vários marcadores de superfície celular, uma grande quantidade de literatura tem sido publicado que sugere a existência de CSCs numa variedade de tumores tais como leucemia crónica mielóide (LMC) [15], [16], a leucemia promielocítica aguda (APL) [17], [18], o cancro da mama [19], glioblastoma [20] – [23], o cancro do cólon [24] – [26] e melanoma [27] – [30].
controvérsia No entanto, não é instável quanto ao facto de a capacidade de formação de tumor de células de tumores humanos foi correctamente observado em estudos anteriores [31], [32]. Uma vez que a eficiência de xenotransplante, na maioria dos casos é consideravelmente menor do que para os transplantes singeneicos, Kelly et al. sugerido que a capacidade de formação de tumor de células de tumores humanos pode ser seriamente comprometida no ambiente do rato devido a diferenças específicas de espécies na afinidade (ou reconhecimento) de receptores de citocinas e de factores de crescimento para os seus ligandos cognatos [33]. Além disso, de Quintana et al. empregue uma mais altamente imunocomprometidos estirpe de ratinho (NOD /interleucina-2 SCID receptor da cadeia gama nulo [ll2rg – /-]) para o ensaio de xenotransplante e descobriram que isso poderia aumentar drasticamente a frequência detectável de células com potencial tumorigénico em melanoma humano, o que sugere que o capacidade de formação de tumor de células de tumores humanos pode ser grandemente comprometida devido à influência imune no meio exterior [34]. Estes levaram-nos a questionar se a capacidade proliferativa e tumorigénico de células tumorais humanas, especialmente a do “não-CSCs” poderia ter sido subestimado nos estudos anteriores.
No presente estudo, avaliou-se a proliferação e apoptose das CSCs putativos (CSC
+ células) e não-CSCs (CSC
– células) em tumores primários, bem como linhas de células tumorais por citometria de fluxo. Em contraste com os anteriores relatórios de ensaios de xenotransplante convencionais (transplante CSC
+ e CSC
– células separadamente), onde CSC
– as células foram mostrados para ter nenhuma ou limitada capacidade proliferativa [1], [35] , [36], não foram encontradas diferenças significativas na proliferação e apoptose entre os dois subconjuntos no estado nativo. Nós ainda mais empregou uma técnica de rastreamento de células a seguir a proliferação, tumorigenicidade de CSC
+ e CSC
– células. Nós escolhemos estudar as células de várias linhas celulares de tumor, em vez de tumores primários, que podem compor geneticamente diversas células [27], [37]. Verificou-se que a CSC
– células expostas proliferativa semelhante e capacidades tumorigênicos como CSC
+ células quando os dois subconjuntos coexistiram. Além disso, ambos os subconjuntos poderiam dar origem a CSC
+, bem como CSC
– progênies, enquanto as características da CSC
+ (ou CSC
-), as células foram mantidas entre gerações diferentes, independentemente da sua origens (CSC
+ – derivado ou CSC
– derivada). Nossos resultados sugerem que os marcadores CSC deve ser usado criteriosamente para diferenciar as células-tronco do câncer de outras células tumorais devido à sua plasticidade fenotípica.
Resultados
expressão de marcadores CSC varia enormemente em tumores primários humanos e linhagens de células tumorais
estudos anteriores sugeriram que as células leucemogênicos /tumorigênico estavam restritos a uma população rara de células tumorais expressando certos marcadores CSC [35], [36]. Utilizando um protocolo de dissociação livre de tripsina (para manter a integridade do epitopo), foi detectada a percentagem de células positivas CSC marcadoras (por exemplo, CD34
+ CD38
– para a AML, a APL, e LMC, CD44
+ CD24
– para o cancro da mama, CD133
+ para o câncer de glioblastoma e cólon, e CD271
+ para melanoma) em tumores primários humanos, bem como linhas de células de tumor por análise de citometria de fluxo. Descobrimos que um número considerável de tumores primários ou linhas celulares de tumores não expressam estes marcadores CSC (Figura 1A), o que é consistente com o de alguns outros relatórios [38], [39]. Além disso, foi realizada RT-PCR quantitativo e descobriram que as células (tanto CSC
+ e CSC
-) de CSC marcador de tumores que expressam, mas não as células de CSC marcador não-tumores que expressam, expressam ARNm marcador CSC (Figuras 1B-F e Figura S1), sugerindo que o marcador e expressando a CSC tumores não expressam pode ser originário a partir de diferentes tipos de células tumorais. Em tumores primários e linhas celulares tumorais que expressam esses marcadores CSC, a percentagem de células positivas marcadoras CSC variar enormemente, variando de 0,4% numa LMA a tão elevado como 82,7% no cancro do cólon (Figura 1A).
(A) A percentagem de células positivas marcadoras CSC a partir de tumores primários humanos (n = 10 para cada tipo) e linhas de células tumorais. Foram preparadas suspensões de células únicas, seguido por análise de citometria de fluxo. Os pontos representam a percentagem de CD34
+ CD38
– células AML, APL, e CML, CD44
+ CD24
– células do câncer de mama, CD133
+ células do câncer de glioblastoma e cólon , e CD271
+ células em amostras de melanoma. (B-F) O nível de expressão de ARNm marcador CSC de células (CSC
+ e CSC
– células de CSC marcador que expressam linhas de células de tumor e células de linhas de células tumorais não-expressão) foi analisada por meio de qRT-PCR e normalizadas para
GAPDH
. O nível de mRNA CD34 no KG-1 CSC
+ células, CD44 mRNA em células MCF-7 CSC
+ células, o mRNA CD133 em SHG-44 e Caco-2 CSC
+ células, CD271 de mRNA em A375 CSC
+ células, foi arbitrariamente designada como 1.0 para a leucemia, o cancro da mama, glioblastoma, cancro do cólon, as amostras de melanoma, respectivamente. As fotografias mostram os produtos de RT-PCR e os histogramas mostram o nível de expressão de ARNm marcador CSC de células de leucemia (B), o cancro da mama (C), glioblastoma (D), o cancro do cólon (E), e linhas celulares de melanoma (F). Note-se que as células de CSC marcador não expressar linhas de células tumorais (U37, U81, COLO320, LoVo, LS174T) não expressam mRNA marcador CSC
CSC
-. Células tumorais exibem proliferação semelhante como CSC
+ células tumorais nas
estado nativo
Para investigar a proliferação das CSCs putativos (CSC
+ células) e não-CSCs (CSC
– células) no estado nativo, medimos o percentual de proliferação e células em apoptose dos dois subconjuntos no marcador CSC expressando tumores primários (por exemplo, AML, APL, CML, cancro da mama, glioblastoma, cancro do cólon e melanoma) por citometria de fluxo. Como mostrado nas Figuras 2A e 2B, a percentagem de células positivas Ki-67, e a percentagem de anexina V
+ 7-AAD
– células não diferiram significativamente entre os dois subconjuntos. Resultados semelhantes foram obtidos em
in vitro
(Figuras 2C e 2D) e
in vivo
(Figuras 2E e 2F) Estudos de CSC marcador expressando linhas de células tumorais humanas. Estes resultados sugerem que a capacidade proliferativa de CSC
– células é semelhante ao de CSC
+ células no estado nativo
(A, B) foram seleccionados marcador CSC expressando amostra primária de sofrer. expressão Ki-67 e análise de apoptose. Os dados representam a média ± SEM; n = 10 para cada tipo de leucemia, n = 8 para o glioblastoma e para o cancro do cólon, n = 9 para o cancro da mama e de melanoma. (A) Ki-67 expressão da CSC
+ e CSC
– células de tumores primários humanos. As suspensões de células individuais de tumores primários humanos foram coradas com anticorpos específicos para os marcadores de CSC e Ki-67-FITC, seguidos por análise de citometria de fluxo. (B) Ensaio de apoptose da CSC
+ e CSC
– células de tumores primários humanos. As suspensões de células individuais de tumores primários humanos foram coradas com anticorpos específicos para os marcadores de CSC e anexina V-FITC /7-adicionado, seguido por análise de citometria de fluxo. ensaio (C-D) Ki-67 (C) e a apoptose (D) de CSC
+ e CSC
– células a partir de linhas celulares de tumores humanos cultivados em meio contendo soro. Os dados representam a média ± SEM de 3 experiências independentes. ensaio (E-F) Ki-67 (E) e apoptose (F) de CSC
+ e CSC
– células de xenotransplantes derivados de linhas celulares de tumores humanos. Os dados representam a média ± SEM de 3 experiências independentes. (L) DsRed-rotulados CSC
+ e-EGFP rotulados CSC
– células provenientes das mesmas linhas de células de tumor foram misturados de acordo com as suas proporções iniciais e co-cultivados em meio contendo soro durante 20 passagens. Pontos mostram a relação entre a CSC
+ – derivada para CSC
– derivada (DsRed: EGFP) células em diferentes passagens. Os dados representam a média ± SEM de 3 experiências independentes
Para acompanhar a proliferação de CSC
+ e CSC
-. Células, utilizou ainda uma técnica de rastreamento de células projetado para simular o
in situ ambiente
em que ambos os subconjuntos coexistir. DsRed marcado CSC
+ e EGFP marcado CSC
– células originárias das mesmas linhas de células tumorais foram misturados de acordo com suas proporções originais e co-cultivados em meio contendo soro durante 20 passagens (ver Procedimentos Experimentais para detalhes ). Citometria de fluxo análise mostrou que a proporção de CSC
+ – derivada para CSC
– derivada (DsRed: EGFP) células permaneceu praticamente inalterada durante todo o processo (Figura 2G). Estes dados sugerem que tanto CSC
+ e CSC
– células poderiam propagar amplamente
CSC
-. Células tumorais demonstram a capacidade de formação de tumor semelhante ao CSC
+ células tumorais em cima do co -transplantation
à luz das conclusões acima, foi investigada a capacidade de formação de tumor de CSC
+ e CSC
– células por co-transplante, bem como xenotransplante convencional (transplante CSC
+ e CSC
– células separadamente). DsRed marcado CSC
+ e EGFP marcado CSC
– células originadas de as mesmas linhas de células tumorais foram misturados em sua relação original. Diferentes números de CSC
+, CSC
– ou células mistas foram injetados sob a cápsula renal de camundongos NOD-SCID subletal irradiados, respectivamente. Verificou-se que ambos
+ e CSC
CSC – células poderia iniciar a formação de tumores quando transplantadas em separado, embora a frequência de formação de tumores pela CSC
– células foi significativamente menor do que em CSC
+ células (Tabela S1). Quando CSC
+ e CSC
– as células foram co-transplantado, os xenotransplantes foram compostas tanto CSC
+ – derivada (DsRed) e CSC
– células derivadas (EGFP), como mostrado na As figuras 3A e 3B. Importante, citometria de fluxo mostrou que as proporções de CSC
+ – derivada para CSC
– derivados: células (DsRed EGFP) nos xenoenxertos não foram significativamente diferentes dos rácios de CSC
+ para CSC
– (DsRed: EGFP) células nas misturas que tinham sido injectados (Figuras 3C e 3D, a Tabela 1). Realizou-se o xenotransplante para baixo para a terceira passagem. Citometria de fluxo mostrou que as proporções de CSC
+ – derivadas para CSC
– derivados (DsRed: EGFP) células nos xenoenxertos permaneceu praticamente inalterada entre as diferentes passagens (Tabela 1). Estes dados sugerem que, embora CSC
+ células podem ser mais tumorigênico quando estudados separadamente, pré-isolado CSC
– células podem ser sustentadas no modelo de co-transplatation. Os estudos implicam também que a capacidade de formação de tumor de CSC
-. Células poderia ser subestimada, se forem estudadas separadamente num meio externo
(A e B) DsRED-rotulados CSC
+ e EGFP-rotulados CSC
– células provenientes das mesmas linhas celulares tumorais foram misturados a sua relação original e co-transplantados em ratinhos NOD-SCID irradiados subletalmente. As fotografias representam imagens fluorescentes (A) e hematoxilina e eosina (B) das secções em série dos derivados de xenoenxertos de KG-1, as células MCF-7, SHG44, Caco-2 e A375. Barra de escala = 100 pm. (C) de fluxo de citometria de gráficos de contorno mostram a percentagem de células e DsRed EGFP nos xenoenxertos. (D) Os histogramas mostram a relação entre a CSC
+ para CSC
– (DsRed: EGFP) células em injeções e a proporção de CSC
+ – derivada para CSC
– derivada (DsRed: EGFP células) em xenoenxertos. Os dados representam a média ± SEM de 3 experiências independentes.
plasticidade do CSC hierarquia baseada marcador na CSC marcador expressando tumores
Inesperadamente, descobrimos que um número considerável de CSC
+ estavam presentes na CSC
– populações derivadas tanto
in vitro
e
in vivo
ea percentagem de CSC
+ na CSC
+ – e CSC
– populações derivadas eram comparáveis após culta (ou xenotransplantadas) durante várias passagens (Tabela S2), sugerindo que a CSC
– células em CSC marcador expressando tumores podem dar origem a CSC
+ células . Para confirmar que a CSC
+ células em CSC
– população derivada eram de fato progênies de CSC
– células e não em resultado da contaminação celular introduzido durante separação de células [40], medimos (em CSC marcador expressando linhas de células tumorais, utilizando citometria de fluxo) a percentagem de células positivas CSC marcador em um único CSC
+ – derivado ou CSC
– sublinhas derivada. Como mostrado na Figura 4 e Figura S2, tanto CSC
+ e CSC
– células foram capazes de gerar sub-linhas derivadas de uma única célula e dando origem aos dois subconjuntos. Inicialmente, a percentagem de células positivas CSC marcador em um único CSC
– sublinhas de derivados foi significativamente menor do que no único CSC
+ – sublinhas derivados. No entanto, durante um período prolongado de cultura (cerca de 20 passagens, ver Procedimentos Experimentais para detalhes), a percentagem de células positivas marcadoras CSC em cada sub-linha tornou-se estatisticamente semelhante ao das linhas de células de tumor original. Além disso, verificou-se que o clone formando eficiência de CSC
– células variou de 36,1% em células Caco-2 para 70,3% em células THP-1 (Figura S3). Notavelmente, a percentagem de clone formando CSC
– células é muito maior do que a taxa de contaminação por CSC
+ (células negativas falsas, geralmente inferior a 0,1%) no CSC
– população como classificado por FACS. Estes resultados indicam que a CSC
– células podem dar origem a CSC
+ células em CSC marcador expressando tumores humanos
(A-E) CSC
+ e CSC
-. Células a partir do tumor original linhas celulares foram seleccionadas para gerar sub-linhas derivadas de uma única célula (SCDSLs). A percentagem de células positivas CSC marcadoras nas linhas de células de tumor original ou SCDSLs (passagem 1 e a passagem 20) de KG-1 (A), células MCF-7 (B), SHG44 (C), HT-29 (D), e A375 (E) foi analisada por citometria de fluxo. Os diagramas de caixa mostram a percentagem de células positivas CSC marcador em SCDSLs, com os bigodes que representam os valores mínimos e máximos, as linhas centrais que representam o valor mediano e as caixas que representam o percentis 25 e 75. Os histogramas mostram a percentagem de células positivas marcadoras CSC em linhas celulares de tumor original e SCDSLs. Dados de SCDSLs representam a média ± SEM de 100 amostras; Dados de linhas de células de tumor original representam média ± EPM de 3 experiências independentes; **
P Art 0,01 por independentes
t
-test
Realizamos a construção sublinha derivada de uma única célula até a terceira geração (Figura 5A. ). Independentemente das gerações ou origens (CSC
+ – derivado ou CSC
– derivada), cada sub-linha continha um número considerável de CSC
+ células (Figuras 5B e 5C, as Figuras S4A e S4B) e a percentagem de células positivas CSC marcador no único CSC
+ – derivado (ou CSC
– derivados) sublinhas foi comparável entre todas as gerações (figuras 5D e 5E, Figuras S4C e S4D). Especificamente, os dois subconjuntos poderia invariavelmente gerar CSC
+ e CSC
– progênies em todas as gerações, e sem sublinhas composta exclusivamente por CSC
+ ou CSC
– células. Além disso, estudamos a proliferação e tumorigênese do CSC
+ (ou CSC
-) células de diferentes gerações (Figura 6A). Como mostrado nas Figuras 6B, 6C e Figura S5, o percentual de 67 Ki-células positivas, o percentual de anexina V
+ 7-AAD
– células, bem como a frequência de células tumorigénicas foram estatisticamente semelhantes em todas as gerações apesar das origens. Estes resultados mostram que a CSC
-. As células são capazes de gerar CSC
+ células e sugerem que há uma considerável plasticidade destes marcadores comuns CSC nestes tumores
(A) Diagrama esquemático mostra a construção de sublinhas de uma única célula derivadas de série (SCDSLs). CSC
+ e CSC
– foram selecionados células de linhas de células tumorais originais para gerar SCDSLs e arbitrariamente classificados como geração de 1 SCDSLs (incluindo G
1
+ e G
1
-). CSC
+ e CSC
– células de G
1 SCDSLs foram selecionados para gerar G
2 SCDSLs (incluindo G
1
+ L
2
+, G
1
-G
2
+, G
1
+ L
2
– e G
1
-G
2
-). Repetimos o procedimento até que G
3 SCDSLs foram obtidos. (B-E) A percentagem de células positivas marcadoras no CSC SCDSLs de KG-1, as células MCF-7, SHG44, Caco-2 e A375 foi analisada por citometria de fluxo quando a quantidade de células atingiram cerca de 1 × 10
6. Os diagramas de caixa mostram a percentagem de células positivas CSC marcador em um único CSC
+ – derivado (B) e CSC
– derivados (C) sublinhas de diferentes gerações, com os bigodes que representam os valores mínimos e máximos, o centro linhas que representam o valor mediano, e as caixas que representam o percentil 25 e 75. Os histogramas mostram a percentagem de células positivas CSC marcador em um único CSC
+ – derivados (D) e CSC
– derivado (E) sublinhas de diferentes gerações. Os dados representam a média ± SEM de 100 amostras, cada uma de uma construção SCDSL série independente.
(A) Diagrama esquemático mostra a classificação de células com base na geração e expressão do marcador CSC. As células a partir das linhas celulares de tumores originais foram arbitrariamente classificados como (
1 L), as células de geração 1 e classificados em CSC marcador positivo (L
1
+) e negativo (L
1
– ) células. G
1
+ e G
1
– células foram então propagada (de 1 × 10
2 a cerca de 1 × 10
8) para gerar G
2 ( incluindo G
1
+ L
2
+, G
1
+ L
2
-, G
1
-G
2
+ e G
1
-G
2
sub -) células. Repetimos o procedimento até G células
3 foram obtidos. (B e C) CSC
+ e CSC
– células de diferentes gerações foram utilizados para ensaios de proliferação e tumorigênicos. Os histogramas mostram a percentagem de 67 Ki-células positivas, a percentagem de anexina V
+ 7-AAD
– células, bem como a frequência de células tumorigénicas da CSC
+ células (B) e CSC
– células (C) a partir de diferentes gerações em kg-1, MCF7, SHG44, Caco-2 e A375. Frequência de células tumorigénicas foi calculada utilizando extrema Limitando software Análise de diluição. Outros dados são expressos como média ± SEM de 3 experiências independentes.
Discussão
A questão de qual células tumorais contribuir para a progressão do tumor tem implicações fundamentais para a terapia. Principalmente com base nos resultados que as células tumorais apenas expressam certos marcadores de superfície celular poderia iniciar o crescimento tumoral quando transplantadas em ratos imunodeficientes, os defensores do modelo de CSC propor que os tumores são organizadas hierarquicamente e, portanto, a terapia de tumores deve ser dirigido para eliminar as células tumorigénicas (ie, CSCs) [2], [41], [42]. No entanto, aqui vamos mostrar que os marcadores CSC previamente identificados (por exemplo, CD34
+ CD38
– para a AML, APL, e CML, CD44
+ CD24
– para o cancro da mama, CD133
+ para glioblastoma e cancro do cólon, CD271
+ para melanoma) não necessariamente filtrar células tumorigénicas nestes tumores, porque ambos CSC
+ e CSC
– células pode iniciar o crescimento do tumor e dar origem a ambas as progênies ( ou seja, CSC
+ e CSC
– células). Nossos dados levantam questões interessantes sobre a plasticidade da hierarquia do tumor.
O modelo CSC postula que o início da formação de tumores é accionado por CSCs enquanto a não-CSCs, que compõem a maior parte das células num tumor, não têm ou capacidade limitada para a iniciação da formação de tumor [1], [35], [36]. Por outro lado, foi relatada a ser mais CSCs quiescente do que os não-CSCs [41], [43]. Se existir diferenças fundamentais na potencial proliferativo entre CCC e não-CSCs, tais diferenças devem ser facilmente detectado por análise de citometria de fluxo ou imuno-histoquímica da proliferação celular. No entanto, aqui, mostramos que a proliferação e apoptose das CSCs putativos (CSC
+ células) e não-CSCs (CSC
– células) foram notavelmente semelhantes em tumores primários e linhas de células de tumor, o que sugere que a capacidade prolif erativa da CSC
– células podem ter sido seriamente subestimada em estudos anteriores nos quais CSC
+ e CSC
– as células foram transplantadas separadamente para os animais. Portanto, nós estabelecemos um método de rastreio celular projetado para simular o
in situ ambiente
onde CSC
+ e CSC
– células coexistir. Em contraste com os relatórios anteriores que a CSC
– células não tinham nenhuma ou limitada capacidade de proliferação e, portanto, não iniciar o crescimento do tumor [35], [36], mostramos que a CSC
– células exibiram proliferação similar ou sustentabilidade como CSC
+ células quando ambos os subconjuntos foram co-cultivadas
in vitro
ou co-transplantadas para os animais de acordo com as suas proporções originais. Estes dados sugerem fortemente que, em adição para a CSC
+ células, CSC
-. As células são também capazes de proliferação e tumorigénese
O modelo CSC descreve um tumor como uma hierarquia celular no qual apenas CSCs encontrando-se no ápice têm a capacidade de auto-renovação e células de geração do resto. A evidência disponível de suporte ao modelo CSC vem principalmente a partir de estudos de formação de tumores. Como mencionado anteriormente, o ensaio de formação de tumor podem não ser suficientes para demonstrar uma organização hierárquica uma vez que a capacidade de formação de tumor de células tumorais pode ser significativamente influenciada pelos factores intrínsecos e extrínsecos [33], [34], especialmente quando diferentes subconjuntos de As células tumorais são estudadas separadamente num meio externo. Por outro lado, embora alguns estudos mostraram que a CSC
– (CD133
-) células em glioblastoma [38] e câncer de cólon [39] poderia iniciar o crescimento do tumor, ou não existe uma hierarquia baseada CSC marcador estes tumores não foram investigadas exaustivamente. No presente estudo, investigamos o destino das células derivadas de CSCs putativos (CSC
+ células) e não-CSCs (CSC
– células) por célula de rastreamento sob a condição em que os dois subconjuntos coexistiram. Encontramos ambos CSC
+ e CSC
– células poderiam ser detectados em progênies derivadas de CSC
+ (ou CSC
-) células tanto
in vitro Comprar e
em vivo
. Através de uma única célula de construção sub-linha de série derivada com células a partir de linhas de células de tumor, que também demonstraram que a CSC
– assim como CSC
+ células de CSC marcador de tumores que expressam poderia invariavelmente dar origem a ambos os progênies, e a proliferativa ou capacidade tumorigénico do CSC
+ (ou CSC
-) células foi mantida entre diferentes gerações, independentemente das origens (CSC
+ – derivado ou CSC
– derivada). Estes dados fornecem fortes evidências de que não há nenhum marcador hierarquia baseada comum CSC nestes tumores.
marcadores de superfície celular têm sido amplamente utilizados para distinguir CSCs de não-CSCs ea maioria dos estudos anteriores sugeriram que CSCs foram restritos a uma população rara de células de tumor [35], [36]. No entanto, os nossos dados sugerem que a expressão de marcadores de superfície celular é mais complexo do que anteriormente reconhecido. Consistente com alguns outros relatórios [38], [39], que mostrou por análise de citometria de fluxo que a percentagem de células positivas marcadoras CSC variar enormemente (variando de 0,4% em um LMA de tão elevada como 82,7% de um cancro do cólon) no CSC marcador de tumores que expressam e que um número considerável de tumores primários ou linhas celulares de tumor não expressa esses marcadores CSC. Através de RT-PCR quantitativa, que revelou ainda que as células (tanto CSC
+ e CSC
-) de CSC marcador de tumores que expressam, mas não as células de CSC marcador tumores não expressam expressa ARNm marcador CSC, o que sugere que o marcador de CSC e expressando tumores não expressam pode ser originário a partir de diferentes tipos de células tumorais. Notavelmente, em contraste com o modelo de CSC e modelo de evolução clonal, em que a heterogeneidade fenotipica é atribuído a alterações epigenética e genéticas, respectivamente, que mostram que a expressão de marcadores CSC em células de CSC marcador que expressam linhas de células de tumor pode ser dinâmica. Tal fenômeno também foi observado por outros, em alguns tumores primários humanos [44] – linhas [46] e de células tumorais [45], [46]. . Se tal fenômeno existe em outros mandados de tumores primários mais investigação
Os presentes dados mostram que tanto CSC
+ e CSC
– as células têm a capacidade de desenvolvimento de neoplasias e que a expressão de marcadores CSC é reversível . No entanto, não descarta a heterogeneidade funcional entre os dois subconjuntos como CSC
+ células apresentaram maior tumorigenicidade de CSC
– células quando elas foram transplantadas em camundongos separadamente. Anteriormente, CSC
+ células foram relatados para exibir maior tolerância imunológica (por exemplo, CD271
+ células de melanoma humano [29]) e maior secreção de factores de crescimento (por exemplo, CD133
+ células de glioblastoma humano [47] ) do que CSC
– células. Assim, quanto maior a tumorigenicidade de CSC
+ células em xenotransplante pode ser devido à sua melhor adaptação ao ambiente exterior e /ou a sua capacidade para segregar factores de crescimento que são críticos para a sobrevivência e proliferação das células. Se a CSC
+ e CSC
– células podem mostrar diferenças evidentes na iniciação do tumor, metástase e resistência à quimioterapia ou radioterapia no meio humano continua a ser investigado. Uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes a heterogeneidade funcional pode fornecer pistas importantes para o desenvolvimento e avaliação de novas terapias anticâncer.
Conclusões
A presente investigação mostra a limitação do uso de marcadores comuns CSC identificar uma população de células (isto é, os CSCs) que são
exclusivamente
capazes de proliferar e de iniciar o crescimento tumoral em linhas celulares tumorais estudados. Os nossos dados apoiam mais o modelo de evolução clonal em que a maior parte das células tumorais são capazes de proliferação e tumorigénese e a heterogeneidade funcional de células tumorais é atribuível a influências aleatórios ou estocásticos (intrínseca ou extrínseca). Esta conclusão baseia-se nas conclusões que coexistindo CSCs putativos (CSC
+ células) e não-CSCs (CSC
– células) apresentaram capacidade similar para proliferação e tumorigênese e que ambos os subconjuntos poderiam dar origem a CSC
+ e CSC
– progênies. Nossos resultados sugerem as limitações do uso destes marcadores independentemente de diferenciar as células-tronco do câncer de células não tumorigénicas devido à plasticidade fenotípica das células tumorais.
Materiais e Métodos
declaração Ética
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