Sumário

factor de activação de células B (FABF) é uma citocina que pertence ao factor de necrose tumoral (TNF) superfamília. Tem sido relatado que o FABF é elevada em pacientes com pancreatite auto-imunes e contribui para o potencial maligno de cancros do sangue e tumores sólidos. Neste estudo, foi obtida evidência clínica de aumento dos níveis de BAFF em pacientes com adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), e os papéis e mecanismos de BAFF em PDAC foram esclarecidas em tecidos humanos de PDAC e de

in vitro

dados de linhas celulares PDAC. Os níveis séricos de BAFF em pacientes com PDAC foram significativamente maiores do que em indivíduos saudáveis ​​(p = 0,0121). Pacientes com estágio UICC IV PDAC (T1-4, N0-1, M1) tinham níveis significativamente mais elevados de BAFF soro em comparação com pacientes com PDAC (p = 0,0182). BAFF foi notavelmente expresso em linfócitos infiltrantes B circundante do cancro do pâncreas em tecidos pancreáticos humanos, o que sugere que o BAFF pode desempenhar um papel na progressão do cancro pancreático. linhas celulares PDAC foram cultivadas com BAFF humano recombinante, e morfologia ea expressão gênica foram analisados; células de câncer pancreático alterado para uma morfologia de fibroblastos-like, e mostrou a expressão do gene alterado de E-caderina, vimentina e Caracol. Estas alterações induzidas pelo BAFF reflectem a motilidade celular melhorada e invasão. clones de células BAFF-R-superexpressão confirmou a associação entre essas alterações induzidas pelo BAFF e de transição (EMT) genes relacionados com epiteliais-mesenquimais. BAFF foi elevada em pacientes com PDAC metastático avançado e alterações induzidas em células PDAC via regulação de genes relacionados com a EMT. Elucidação do papel preciso e mecanismo de controle de BAFF pode levar a novas abordagens terapêuticas com o objetivo de melhorar a sobrevida do câncer de pâncreas

Citation:. Koizumi M, HIASA Y, Kumagi T, Yamanishi H, Azemoto N, Kobata T, et al. (2013) Aumento B celular Ativando-Factor Promove Tumor invasão e metástase em câncer pancreático humano. PLoS ONE 8 (8): e71367. doi: 10.1371 /journal.pone.0071367

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Janeiro, 2013; Aceito: 28 de junho de 2013; Publicação: 06 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Koizumi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por uma Grant-in-Aid para a Investigação científica (Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência, KAKENHI 24.590.980 para YH) e do Programa de Aperfeiçoamento da educação sistemática na Graduate School (MK) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia, do Japão e por um Grant-in-Aid para a Investigação e Desenvolvimento (para YH) Científico do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão japonês. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é um dos cancros com pior prognóstico em seres humanos. A taxa de sobrevida em 5 anos de câncer de pâncreas é apenas cerca de 6%, devido à dificuldade de diagnóstico em estágios clínicos precoces, bem como a metástases frequentes [1], [2]. Recentemente, novas opções terapêuticas têm sido relatados; no entanto, as opções de tratamento são limitadas e a resposta à quimioterapia permanece baixa [3], [4]. Identificação de novos alvos para câncer pancreático pode melhorar o prognóstico.

Recentemente foi relatado que o fator de ativação de células B (BAFF), uma citocina pró-inflamatória, é elevada em pacientes com pancreatite auto-imune [5]. FABF é uma citocina que pertence a um subconjunto da superfamília do factor de necrose tumoral (TNF). Em uma experiência anterior em que os níveis séricos de BAFF foram examinados em doentes com cancro pancreático [5], os pacientes com metástases pareciam ter níveis mais elevados de FABF.

FABF é uma glicoproteína péptido ácido 285-amino que é expresso como uma proteína transmembranar, e é segregado numa forma solúvel a partir de vários tipos de células (monócitos, células dendríticas, linfócitos T e linfócitos B) [6] – [8]. É conhecido por estar associado com a sobrevivência e a maturação dos linfócitos B. FABF é um ligando para três receptores: receptor de BAFF-(BAFF-R) [9]; activador transmembranar, modulador de cálcio, e interactor do ligando da ciclofilina (TACI) [10]; e antigénio de células B de maturação (BCMA) [11]. Além disso, uma proteína semelhante ao FABF, chamado um ligando indutor de proliferação (abril) [12], pode ser um ligando de TACI e BCMA. A ligação de FABF ou APRIL aos receptores pode activar várias vias de sinalização, incluindo a via de factor nuclear-kB (NF-kB) [13] – [15]. Tem sido relatado que o FABF e APRIL contribuir para o potencial maligno de cancros do sangue e tumores sólidos [16] – [18]. No entanto, os papéis de FABF, APRIL, e os seus receptores no cancro pancreático ainda não foram elucidados.

Neste estudo, foi obtida evidência clínica de níveis aumentados de FABF em pacientes com adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), e o papel eo mecanismo de BAFF no PDAC foi esclarecido a partir de evidências clínicas e de

in vitro

dados de linhas celulares PDAC.

Materiais e Métodos

pacientes e espécimes pâncreas

As amostras de soro foram examinadas a partir de 44 pacientes com PDAC e à idade saudável e indivíduos pareados por sexo. Para o diagnóstico da encenação, foi utilizado o sistema de metástase do tumor da União de Controle do Câncer Internacional (UICC). Todas as amostras de soro foram armazenadas a -80 ° C antes da utilização. Espécimes de PDAC foram obtidas de pacientes submetidos à cirurgia. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes inscritos. O protocolo do estudo conformado com as diretrizes éticas de 1975 Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Institutional Review Board do Hospital Universitário de Ehime (Número de aprovação: 1.107.003). Este estudo envolvendo amostras humanas foi registrado no Hospital Medical University Network Informação (Umin) Registro de Ensaios Clínicos (número de registo 000008654).

ensaio imunoenzimático para BAFF e APRIL

Os níveis séricos de BAFF e abril em todas as disciplinas foram testados utilizando um kit de ensaio imunoenzimático (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA, para BAFF; BioVendor, Candler, NC, EUA em abril). seguindo as recomendações do fabricante

a imuno-histoquímica de PDAC espécimes

tecidos pancreáticos foram fixados em formalina. As secções (3 mm de espessura) foram cortadas a partir de cada bloco e secções adjacentes foram coradas com hematoxilina e eosina padrão (H E) e técnicas de coloração imuno-histoquímica. As amostras embebidas em parafina foram desparafinados e re-hidratadas, e, em seguida, os antigénios foram recuperados em autoclave durante 1 min a 125 ° C em tampão de EDTA (pH 9,0). A actividade da peroxidase endógena foi inactivada por incubação com metanol contendo 1% de peroxidase de hidrogénio durante 20 min. As secções foram então incubadas em soro de bloqueio a 1% durante 30 minutos para reduzir as reacções inespecíficas. Para imuno-histoquímica, as secções foram incubadas com o anticorpo primário correspondente (Tabela S1) a 4 ° C durante a noite. As secções de tecido foram tratadas com o anticorpo secundário marcado com peroxidase (PO Histofine Simplestain Max; Nichirei, Tóquio, Japão) durante 1 h à temperatura ambiente, e incubou-se com simples mancha DAB Solution (Nichirei). Fotomicrografias foram tiradas com uma Nikon Microphot FXA com uma câmera Nikon DXM Digital 1200 (Nikon, Tokyo, Japan).

Para a imunofluorescência, montado e foram utilizadas secções fixadas em formol. As secções foram incubadas com o anticorpo primário correspondente (Tabela S1) a 4 ° C durante a noite. Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato, as secções foram incubadas com anticorpo anti-cabra de burro conjugado com DyLight488 de FABF ou de BAFF-R, e com anticorpo de burro anti-ratinho conjugado com DyLight549 para CD20. Os núcleos das secções foram coradas com 4,6-diamidino-2-phenylindole (Wako, Osaka, Japão). As lâminas foram fotografadas utilizando um microscópio Zeiss Axioskop 2 Plus fluorescência e capturado por uma câmera digital Zeiss AxioCam HRc (Zeiss, Tóquio, Japão) e salvas em um computador. As fotografias coradas para BAFF, BAFF-R e CD20 foram fundidas para avaliar suas localizações nas células.

Células e condições de cultura

Quatro linhas celulares de cancro do pâncreas (PANC-1, BxPC-3 , AsPC-1 e MIA PaCa-2 células), os quais foram inicialmente gerados a partir de pacientes com PDAC, e as células de Ramos foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). O PANC-1 e células MIA PaCa-2 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (Life Technologies) e 1% de penicilina. células BxPC-3, AsPC-1 e Ramos foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% e 1% de penicilina. Microfotografias foram obtidas após vários tratamentos em um microscópio invertido (Olympus IX70, Olympus, Tóquio, Japão) equipado com uma câmera digital Olympus DP12. Depois de ser privadas de soro durante 24 h, as células foram incubadas com FABF recombinante (Reliatech, Braunschweig, Alemanha) e TGF-β recombinante (R D Systems) durante 48 h. Para neutralizar o FABF, anticorpos de cabra anti-BAFF-R anticorpo (R D Systems) foi utilizada, e para o anticorpo IgG de cabra. (R D Systems) foi utilizado como um anticorpo de controlo

extracção de ARN, a síntese de ADNc e em tempo real de RT-PCR

O ARN foi transcrito de forma inversa utilizando kits de RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com uma coluna de oligo d (T)

16 iniciador em condições padrão. Em tempo real a amplificação por PCR foi realizada utilizando um LightCycler 480 (Roche, Basileia, Suíça) e 2 uL de produto de ADNc purificada, 0,5 ul de iniciador de sentido (10 pmoles /ul), 0,5 ul de iniciador anti-sentido (10 pmoles /ul), 1 uL de LightCycler fast Start DNA mestre SYBR Green I (Roche), e 0,8 mL de MgCl

2 (25 mmol /L) (condições experimentais e as sequências dos iniciadores utilizados para amplificar genes humanos estão indicados na Tabela S2). Comercial gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH) conjuntos de iniciadores e conjuntos de iniciadores de p-actina (Roche) foram utilizados para amplificação por PCR de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. GAPDH serviu como um gene de referência interno, e a mudança relativa foi calculada pela quantificação relativa, aplicando a fórmula 2

-ΔΔCt. Os produtos da reacção foram separados em géis de agarose a 2%.

Western blotting

Para Western blot, 20 ug de proteína foi aplicado às faixas de 4% a 12% Bis-Tris Gels (Life Technologies ), em seguida, transferidas para membranas Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA, EUA), e incubadas com o anticorpo primário correspondente (Tabela S1). kits de anticorpos adequados específicos da espécie conjugados secundários foram obtidos comercialmente (GE Healthcare, Tóquio, Japão). As proteínas foram detectadas utilizando o Kit privilegiada ECL ou o kit ECL (GE Healthcare) com um sistema de ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).

Cicatrização de feridas /scratch test

células PANC-1 foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas durante 24 h sob uma condição privadas de soro. Depois de confirmar que uma monocamada completa tinha formado, as monocamadas foram feridos por riscar linhas com uma ponta de plástico. Os poços foram então lavados uma vez para remover todos os detritos, e observadas e fotografadas sob o microscópio. Em seguida, as placas foram incubadas a 37 ° C sob 5% de CO

2 durante 24 h com o BAFF humano recombinante (Reliatech), após o que foram observadas e fotografadas as células. As células foram visualizadas com um microscópio invertido Olympus Modelo IX70 (Olympus) usando uma objectiva de 4 ×. As imagens foram capturadas com uma Olympus DP12 uma câmera digital (Olympus). A distância que as células haviam migrado foi medida nas microfotografias. A área por cento ferido preenchido foi calculado da seguinte forma: {(média amplitude ferido – média permaneceu largura) /média amplitude feridos} x 100 (%) [19]

Invasion ensaio

Para investigar. invasão celular, um kit de ensaio de invasão de células de 96 poços (Cultrex, Trevigen, Gaithersburg, MD, EUA) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante.

Estabelecimento de clones de célula transfectante de BAFF-R humanos

os clones celulares que sobre-expressam BAFF-R foram desenvolvidos utilizando um plasmídeo, que pode expressar o gene de BAFF-R e o gene resistente a G418 (pBCMGS-BAFF-R) [20]. células PANC-1 foram transfectadas com pBCMGS-BAFF-R, usando Lipofectamin 2000 (Life Technologies), e os clones de células transfectadas foram seleccionadas por incubação com G418 (1000 ug /mL, Life Technologies). Finalmente, quatro clones de células que sobre-expressos BAFF-R foram estabelecidos.

Fluxo de análise de citometria de

análise citométrica de fluxo foi realizada para as células PANC-1 manchadas e BAFF-R humano transfectadas clones celulares . De BAFF-R foi detectada com anticorpo primário específico para o BAFF-R (Tabela S1) seguida por uma incubação adicional com anticorpo secundário conjugado com Alexa-488 de IgG de cabra (Abcam, Tóquio, Japão). Essas células coradas foram examinadas utilizando um FACScalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) e analisadas com o software FlowJo (TreeStar Corporation, Ashland, OR, EUA).

A análise estatística

Todos As análises estatísticas foram realizadas utilizando JMP 8.0 (SAS Institute, Tóquio, Japão). Dados expressos são médias e erro padrão (SE) ou média e desvio padrão (SD). As diferenças foram analisados ​​utilizando o teste t de Student, teste de Wilcoxon e χ

2 de teste. A significância estatística foi definida como P 0,05 com base em um teste de duas caudas. Correlações entre duas variáveis ​​foram avaliadas por meio do coeficiente de correlação de Pearson, e valores de p . 0,05 foram considerados para representar significância estatística

Resultados

Os níveis séricos de BAFF em pacientes com PDAC avançada

Os níveis séricos de BAFF e abril foram examinados em pacientes com PDAC e à idade saudável e indivíduos pareados por sexo (Tabela 1). Os níveis séricos de BAFF foram 1,704 ± 1,409 pg /mL (média ± SD) em pacientes com PDAC, significativamente maior do que em indivíduos saudáveis ​​(1147 ± 315 pg /mL; p = 0,0121) (Fig. 1A). Por outro lado, os níveis séricos de Abril em pacientes com PDAC não foram significativamente maiores do que em indivíduos saudáveis ​​(7,7 ± 2,4 vs 7,3 ± 2,2 pg /ml, respectivamente; p = 0,895) (Figura 1B.). O aumento dos níveis séricos de BAFF foi avaliada por fase UICC. Pacientes com PDAC estágio UICC IV (T1-4, N0-1, M1) tinham níveis significativamente mais elevados de BAFF soro do que os pacientes com estágio UICC Ib-III (2063 ± 1736 vs. 1186 ± 328 pg /mL, respectivamente; p = 0,0182) (Fig. 1C). O quadro clínico de pacientes em cada fase é indicada na Tabela 2. No que se refere à relação entre os níveis séricos de FABF e PDAC tamanho do tumor, houve uma correlação positiva significativa, conforme indicado na Fig. 1D (R = 0,348; p 0,001). Isto sugere que o aumento dos níveis séricos de BAFF foi associada com crescimento de tumores e metástases de PDAC.

(A) Os níveis séricos de BAFF foram determinados em pacientes com PDAC (n = 44) e em indivíduos saudáveis ​​(n = 44). (B) Os níveis séricos de abril foram determinados em pacientes com PDAC (n = 44) e em indivíduos saudáveis ​​(n = 44). níveis (C) séricos de BAFF e estágio UICC de PDAC são indicados. (D) Os níveis séricos de BAFF e tamanhos de tumor de PDAC primária foram significativamente correlacionados em 44 pacientes (p 0,001). Os dados são apresentados como médias ± DP (* p 0,05). n.s .; não significativo.

A expressão de BAFF e BAFF-R no tecido PDAC humana

experimentos Imuno-histoquímica foram realizados para determinar se BAFF é expresso em tecido pancreático. tecido pancreático de espécies cirúrgicos obtidos a partir de pacientes com PDAC foi corado para FABF e de BAFF-R (Fig. 2 e 3). Tumor-infiltrantes células imunes células vizinhas PDAC foram encontrados para notavelmente BAFF expresso e de BAFF-R (Fig. 2). coloração adicionais de CD20 (um marcador de linfócitos B), CD3 (receptor de células T, um marcador de linfócitos T) e CD68 (marcador de monócitos /macrófagos) foi realizado para identificar os seus tipos de células infiltrantes que expressam BAFF ou de BAFF-R. A distribuição de BAFF- e células de BAFF-R-positivas pareceu consistente com a distribuição de linfócitos B, que, em vez de de linfócitos T ou de monócitos /macrófagos (Fig. 2). Recentemente, tem sido demonstrado que os linfócitos B podem secretar BAFF [7], [8], [16]. dupla coloração de imunofluorescência com FABF e CD20, CD3, CD68 (Fig. 3A), e coloração com BAFF-R e CD20, CD3, CD68 (Fig. 3B) foi realizada. A distribuição do FABF (verde) e CD20 (vermelho) foi fundida e apareceu amarelo (Fig. 3A). Além disso, a distribuição de BAFF-R (verde) e CD20 (vermelho) e também foi fundida apareceu amarelo (Fig. 3B). No entanto, a distribuição de FABF e de BAFF-R não foram co-localizados com CD3 ou CD68. Estes resultados indicam que os linfócitos B, que expressam níveis elevados de FABF e de BAFF-R, está na infiltrado e proliferar no tecido circundante do PDAC

(A) A coloração com hematoxilina e eosina. (H E) e imuno-histoquímica de BAFF, BAFF-R, CD3, CD20 e CD68 no PDAC e tecidos circundantes são mostrados. Primeiro Ab (-) significa que o controlo sem coloração primeiro anticorpo. Os linfócitos B no tecido circundante PDAC tinha um extraordinariamente elevado nível de expressão de FABF. Ampliação como indicado acima de cada fotomicrografia. barras de escala representam 200 mm em pequeno aumento (x40) e 50 mm sob alta ampliação (x200 e × 400).

(A) imunofluorescência com BAFF (verde), e CD20, CD3, CD68 (vermelho) são mostrados. A imagem mesclada é indicado como “fusão”. Expressões de BAFF e CD20 foram co-localizada (amarelo); No entanto, a BAFF e CD3 ou CD68 não foram co-localizados. (B) coloração por imunofluorescência com BAFF-R (verde) e CD20, CD3, CD68 e (vermelha) são mostrados. Expressão de BAFF-R e CD20 foram co-localizada (amarelo); No entanto, de BAFF-R e CD3 ou CD68 não foram co-localizados. Primeiro Ab (-) indica controle de coloração, sem o primeiro anticorpo

A expressão de BAFF receptores em tecidos PDAC humanos e linhas celulares PDAC humanos

A fim de investigar a expressão dos receptores de BAFF. em PDAC, imuno-histoquímica foi realizada em tecidos PDAC obtidos a partir de pacientes, assim como em linhas celulares humanas PDAC. De BAFF-R foi expressa em células PDAC, que tinham sinais positivos de MIB-1 e CA19-9 (Fig. 4A, coluna da esquerda). No entanto, outros receptores de FABF (TACI e BCMA) não eram expressos nas células PDAC (Fig. 4A, coluna da direita). As linhas de células humanas PDAC, PANC-1, BxPC-3, ASPC-1, e MIA PACA-2, foram utilizados para o

in vitro

estudos. Qualitativa RT-PCR para a expressão do gene de BAFF-R, TACI e BCMA revelado apenas a expressão de FABF-R (Fig. 4B). células de Ramos, conhecido como um tecido que expressa de BAFF-R, TACI e BCMA, foram usadas como um controlo positivo [21]. Além disso, a transferência de Western foi realizada para avaliar a expressão de proteínas destes receptores FABF (Fig. 4C). Expressão de BAFF-R foi confirmada em todas as linhas celulares PDAC, mas a expressão de TACI e BCMA não pôde ser detectado. Tomados em conjunto, estes resultados mostraram que o aumento dos níveis de BAFF resultou a partir dos linfócitos infiltrantes e em proliferação B tecidos circundantes PDAC; estes níveis mais elevados de FABF podem estimular PDAC sinalização através de BAFF-R. Para identificar o papel de BAFF no PDAC, um

in vitro

ensaio foi realizado utilizando a linha PANC-1 PDAC célula, seu transfectante clonado de BAFF-R, e BAFF humano recombinante para análise posterior.

(a) coloração com hematoxilina e eosina (H e) e imuno-histoquímica da MIB-1, CA19-9, BAFF-R, TACI e BCMA no PDAC são mostrados. Primeiro Ab (-) indica coloração controlo sem o primeiro anticorpo. Ampliação é como indicado acima de cada fotomicrografia. barras de escala representam 200 mm em pequeno aumento (x40) e 50 mm sob alta ampliação (x400). (B) A análise qualitativa por RT-PCR de receptores de FABF em linhas celulares PDAC. GAPDH é indicado como um gene de manutenção. ARN isolado a partir de células Ramos foi usada como um controlo positivo. N.C. é um controle negativo sem amostra. (C) análise de transferência de Western de receptores de FABF em linhas celulares PDAC. β-actina é indicada como uma proteína de arrumação. Ramos célula foi utilizado como um controlo positivo. NC é um controle negativo sem amostra.

BAFF induz EMT numa linha celular PDAC

in vitro

ensaio, a morfologia celular de PANC-1 observou-se a mudar após a adição de BAFF humano recombinante para o meio de cultura (Fig. 5A). As células apareceu a adotar uma morfologia mais de fibroblastos-like (tipo spindle) e mostraram redução contato célula-célula. Estas alterações morfológicas eram semelhantes às alterações observadas com o tratamento de TGF-β. A partir deste resultado, foi colocada a hipótese de que o aumento de BAFF pode induzir alterações nos genes relacionados com a transição epitelial-mesenquimal (EMT) em células PDAC. PANC-1 é isolada a partir de tecido indiferenciado PDAC [22] e é positiva para o marcador de E-caderina epitelial e a vimentina proteína mesenquimais. Assim, PANC-1 foi utilizado como um modelo de uma célula PDAC que ainda tem um potencial epitelial. Análise para expressão alterada de genes representativos relacionadas com EMT foi realizada por adição de BAFF humano recombinante para o meio de cultura. Uma regulação negativa significativa de E-caderina de ARNm, bem como a regulação positiva significativa de vimentina e caracol mRNAs, foram observados de uma forma dependente da dose com FABF (Fig. 5B). GAPDH mRNA foi usado como um gene de manutenção para a PCR quantitativa, e confirmou-se que os níveis de ARNm de GAPDH não foram alterados por tratamento com FABF (Fig. S1). resultados de Western blotting para estas moléculas foram semelhantes aos resultados de tempo real de RT-PCR (Fig. 5C). As alterações induzidas por FABF em células PDAC foram semelhantes às alterações observadas durante EMT. Aumento de BAFF em PDAC poderia promover alterações genéticas associadas a EMT através de uma diminuição da E-caderina e um aumento da vimentina através das vias de sinalização de caracol.

(A) A morfologia celular de células PANC-1 alterado após a adição de FABF para o sobrenadante. TGF-β foi usada como um controlo positivo. Semelhante ao TGF-β, adição de BAFF causou a morfologia das células PANC-1 para se tornar fusiforme. (B) Análise em tempo real RT-PCR para marcadores EMT (E-caderina, vimentina e Snail) são indicados. Estes genes foram modulados de um modo dependente da dose com BAFF. Os dados são apresentados como média ± SE de quatro experiências separadas (* p 0,05 vs. BAFF 0 ng /mL). (C) análise de transferência de Western de marcadores EMT indica que a expressão de cada proteína foi modulada pela adição de FABF. β-actina é mostrado como uma proteína de limpeza.

O tratamento com BAFF humano recombinante e motilidade e invasão de células PDAC

Em conjunto com alterações morfológicas, foi sugerido que induz BAFF EMT no PDAC. Estes resultados levaram estudo dos outros efeitos de FABF, tais como motilidade e invasão. células PANC-1 foram incubadas com FABF recombinante humana, e alterações na motilidade foram avaliadas com o teste de cicatrização da ferida /início. Tratamento com BAFF aumento da motilidade das células PANC-1 e resultou em fechamento da ferida acelerada (p 0,01) (Fig 6A e 6B.). Além disso, o tratamento com FABF recombinante humano melhorou significativamente a capacidade das células para invadir a matriz extracelular

In vitro

(Fig. 6C).

(A) A /teste de raspagem cicatrização de feridas indicaram que o motilidade de células PANC-1 foi aumentada por 24 h de incubação com BAFF. (B) A percentagem de área ferida preenchido no teste de cicatrização de feridas /zero é mostrado como um gráfico (* p 0,01 vs. BAFF 0 ng /mL). (C) O ensaio de invasão mostra melhoria de invasão com FABF em células PANC-1 (* p 0,05 vs. BAFF 0 ng /mL). (D) O teste de cura /zero ferida com anticorpos neutralizantes anti-BAFF-R indicam que a motilidade de células PANC-1 com BAFF foi inibida pelo anticorpo. (E) A percentagem de área ferida preenchido no teste de cicatrização de feridas /zero é mostrado como um gráfico. Os dados são apresentados como médias ± DP de seis experiências separadas (* p 0,05, ** p 0,01).

ensaios adicionais foram realizadas utilizando o anticorpo de BAFF-R anti-humana, que pode inibir a ligação de BAFF a BAFF-R [23]. Com adição de BAFF humano recombinante para o sobrenadante das células cultivadas, a percentagem de área ferida preenchido aumentou significativamente (15,1 ± 2,3 vs. 27,2 ± 2,3; p 0,01). Com a adição de ambos FABF recombinante humana e o anticorpo de BAFF-R anti-humano, o fechamento da ferida foi diminuído significativamente em comparação com a adição de anticorpo de controlo de cabra (27,2 ± 2,3 vs. 20,9 ± 2,4; p 0,05). (Figura 6D e 6E ). Estes dados sugerem que a estimulação de BAFF causou aumento da motilidade e invasão de células PANC-1.

clones de células de BAFF-R que sobre-expressam e expressão de genes relacionados com o EMT

Quatro clones de células que sobre-expressam o BAFF pode -R através de transfecção com um plasmídeo (pBCMGS-BAFF-R) [20] e selecção por cultura com G418 foram estabelecidos. A sobre-expressão de FABF-R foi confirmada por estes clones de células por transferência de Western e análise de FACS (Fig. 7A e S2). sinalização funcional de BAFF-R transduzidas nestes clones celulares foram confirmadas por incubação com FABF (Fig. S3). O aumento da expressão da proteína p52 de NF-kB foi visto na transferência de Western, indicando que a via de NF-kB foi activado por sobre-expressão de BAFF-R; esta activação da via NF-kB também se reflectiu na diminuição da expressão de E-caderina e aumento da expressão de vimentina e Snail nestes clones. Estas alterações foram semelhantes aos resultados do ensaio com o BAFF humano recombinante.

Quatro clones de células PDAC, que podem sobre-expressam BAFF-R através de transfecção com um plasmídeo (pBCMGS-BAFF-R), foram estabelecidos. (A) nos quatro clones, a sobre-expressão de FABF-R foi confirmada, e as proteínas associadas com EMT foram encontrados para ser modulado de uma forma dependente do nível de BAFF-R. os níveis de (B) de mRNA de cada gene foram avaliadas com o tempo real de RT-PCR. Os dados são apresentados como média ± SE de quatro experiências separadas (* P 0,05, ** P 0,01 vs. PANC-1). (C) O teste de cura /zero ferida indicou que a motilidade de células destes clones foi melhorada em comparação com o PANC-1 originais. (D) A percentagem de área preenchida ferido de cada um dos clones no teste de cicatrização de feridas /zero é mostrado como um gráfico. Os dados são apresentados como médias ± DP de seis experiências separadas (* p 0,05, ** p 0,01 vs. PANC-1).

Além disso, a expressão de ARNm foi avaliada em tempo real utilizando RT -PCR (Fig. 7B). Uma diminuição da E-caderina de ARNm foi observada em todos os clones de células de BAFF-R que sobre-expressam, enquanto que um aumento no ARNm do caracol vimentina e foi observado na maioria dos clones de células. A motilidade dos clones de células foi confirmado como sendo significativamente mais elevada do que a de células não-BAFF-R-transfectadas PANC-1 no teste de cicatrização de feridas /riscos (Fig. 7C e D). Tomados em conjunto com os resultados dos clones de células, confirmou-se que a estimulação com BAFF induz alterações genéticas associadas a EMT em células PDAC.

Discussão

Este é o primeiro estudo a relatar que os níveis séricos de BAFF estão aumentadas em doentes com PDAC, e o primeiro estudo a investigar o papel do BAFF no PDAC humano. Neste estudo, foi revelado que: i) os níveis séricos de BAFF em pacientes com PDAC (em particular, naqueles com metástase) foram elevados em comparação com indivíduos saudáveis; ii) linfócitos tumor-infiltrantes expressaram B BAFF e tecidos PDAC expresso de BAFF-R; e iii) aumento de alterações do gene de BAFF-induzidas foram associados com EMT numa linha celular PDAC, e com a motilidade de células tumorais e invasão melhorada.

FABF é conhecido por ser expresso em monócitos, células dendríticas, linfócitos T, B linfócitos, células epiteliais e [6] – [8], [24], [25]; No entanto, o seu perfil de expressão precisa em pacientes com PDAC não foi previamente definido. Recentemente, Nakajima et ai. mostrou por meio de imuno-histoquímica que os linfócitos B que expressam BAFF-infiltrar tecidos sinoviais de artrite reumatóide [26]. A maioria das células que se infiltram no tecido circundante PDAC no presente estudo foram BAFF-expressando linfócitos B. Além disso, muitos destes linfócitos B também expresso de BAFF-R. A partir destes resultados, os linfócitos B que expressam BAFF infiltrante pode ser considerado como tendo um papel importante na regulação positiva do FABF em pacientes PDAC. O aumento de BAFF provavelmente desempenha um papel na progressão da PDAC, porque os níveis séricos de BAFF foram notavelmente regulada positivamente nos pacientes com PDAC avançada. BAFF produzidos a partir destes linfócitos B podem também ter um papel importante na sobrevivência, a activação e proliferação de linfócitos infiltrantes B circundantes PDAC.

BAFF pertence à superfamília do TNF, e está estreitamente relacionada com APRIL. Ambos têm um importante papel na activação e proliferação de linfócitos B. FABF se liga a todos os três receptores de BAFF-R (BAFF, BCMA e TACI), ao passo que se liga a abril dois deles (BCMA e TACI). No presente estudo, apenas os níveis séricos de FABF (não abril) foram significativamente regulada positivamente em pacientes com PDAC, e apenas a expressão de FABF-R pode ser detectada em tecidos PDAC. Assim, o papel do FABF e de BAFF-R em PDAC foi ainda explorado. Um dos mecanismos mais importantes induzida por BAFF é a activação de NF-kB. Tem sido relatado que o BAFF-R activa NF-kB induzindo-quinase (NIK), e que a activação da NIK induz a transformação do factor de transcrição NF-κB2 P100 para NF-κB2 p52 [27], [28]. A correlação entre a activação do NF-kB e da expressão de Snail foi previamente relatada [29]. NF-kB parece ter um papel importante na indução de EMT

EMT é o fenómeno em que as células epiteliais converter às células mesenquimais.; é fundamental para o desenvolvimento embrionário e envolve profundas mudanças fenotípicas, incluindo a perda de adesão célula-célula e da polaridade celular e a aquisição de propriedades migratórias e invasivos [30]. Em relatórios anteriores, EMT tem sido caracterizada pela aquisição de uma morfologia fusiforme /fibroblástica, a regulação positiva de marcadores mesenquimais como vimentina e regulação negativa do marcador epitelial como E-caderina [31], [32]. Snail foi considerado ser um gatilho de EMT através da regulação negativa da expressão de marcadores epiteliais e supra-regulação da expressão de marcadores mesenquimais [33]. Estas moléculas foram regulados positivamente por FABF em células PDAC; regulação negativa de E-caderina e a regulação positiva de vimentina foram também observadas nestas células.

A partir dos resultados presentes, propõe-se que o FABF e de BAFF-R induz a sinalização em células EMT PDAC (Fig. 8). células PDAC modulados pelo aumento de BAFF mostram uma morfologia fusiforme, perdem a adesão célula-célula e da polaridade celular, e adquirem a capacidade de motilidade celular e invasão. É amplamente aceite que a caderina-E desempenha um papel crítico na EMT, um evento precoce na invasão de células de cancro e metástase [34]. EMT é considerado para ser um evento importante durante a progressão de tumores malignos e metástase [35], [36].