Abstract

resistência progestina é um grande obstáculo para o tratamento da fase inicial, bem diferenciado cancro do endométrio, bem como o câncer endometrial recorrente. O mecanismo por trás da resposta sub-óptima a progestina não é bem compreendido. O

PTEN

gene supressor de tumor é frequentemente mutado no tipo I endometrial cancro e essa mutação resulta em hiperativação da via PI3K /AKT. Nossa hipótese é que o aumento da ativação da AKT promove uma resposta inadequada a progesterona em células de câncer de endométrio. células de Ishikawa, estavelmente transfectadas com o receptor da progesterona B (células PRB23) foram tratadas com o inibidor de AKT, MK-2206, que efectivamente diminuição dos níveis de P (Ser473) -Akt de maneira dose-dependente (10 nM a 1 uM) e tempo-dependente forma (0,5 h a 24 h). MK-2206 níveis inibiram de p (Thr308) -Akt e um alvo a jusante, P (Thr246) -PRAS40, mas não alterou os níveis de p (Thr202 /Tyr204) ERK ou p (Thr13 /Tyr185) SAPK /JNK, especificidade demonstrando de MK-2206 para AKT. Além disso, MK-2206 o tratamento de células PRB23 resultou num aumento significativo nos níveis de receptor de progesterona B proteína (PRB). análise de microarray de células PRB23 PDK4 identificados como o gene mais altamente regulada entre 70 genes regulados positivamente em resposta a R5020. A inibição da AKT regulada ainda mais expressão mediada por progestina de PDK4 mas não afetou outro gene progestina-responsivo, SGK1. O tratamento de células com PRB23 R5020 e MK-2206 diminuiu de forma independente a viabilidade das células, enquanto a combinação de R5020 e MK-2206 causou a maior diminuição na viabilidade celular. Além disso, os ratos com tumores xenoenxerto tratados com sozinho ou com progesterona MK-2206 sozinha exibiram reduções modestas em seu volume de tumor. A maior diminuição do tamanho do tumor foi observada em ratos tratados tanto com MK-2206 e de progesterona; estes tumores apresentou a menor proliferação (Ki67) e o mais apoptose (caspase-3) de todos os grupos de tratamento. Em resumo, a inibição da AKT estabiliza a progesterona Receptor B e aumenta a resposta de progesterona em células de câncer de endométrio que hyperactivated AKT

Citation:. Pant A, Lee II, Lu Z, Rueda BR, Schink J, Kim JJ ( 2012) Inibição da AKT com o activo por via oral Alostérica AKT Inhibitor, MK-2206, sensibiliza células de câncer endometrial de progesterona. PLoS ONE 7 (7): e41593. doi: 10.1371 /journal.pone.0041593

editor: John P. Lydon, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Março, 2012; Aceito: 22 de junho de 2012; Publicação: 24 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Pant et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

financiamento:. Institutos Nacionais da Saúde R21 CA127674 (JJK), Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional do Câncer T32CA09560 bolsa de formação, e do Programa de Malkin Estudiosos do Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center da Universidade Northwestern (IIL). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer endometrial é a neoplasia maligna ginecológica mais comum nos Estados Unidos. Em 2010, 43,470 novos casos foram antecipados, resultando em 7950 mortes [1]. A grande maioria dos casos de cancro do endométrio estão relacionados à ação estrogênio são referidos como Tipo I endometrial cancros. A mutação genética mais comum, que ocorre em aproximadamente 50-80% de todos os casos de cancro do endométrio Tipo I está no gene supressor de tumores

PTEN

[2], [3]. Uma mutação no

PTEN

gene resulta na activação constitutiva jusante da fosfatidilinositol-3′-quinase (PI3K) /Akt [4]. AKT é uma serina /treonina quinase que activa as vias diferentes que promovem a sobrevivência celular e inibir a apoptose [4], [5]. Foi anteriormente demonstrado que há um aumento dos níveis de AKT activado em cancro do endométrio e que este pode prenúncio de um mau prognóstico nestes doentes [6]. Além disso, tem sido mostrado que a inibição da via do AKT em células de cancro do endométrio resulta num aumento da apoptose, mostrando assim que a modulação desta via pode ter um papel terapêutico importante [7], [8].

cancro endometrial é geralmente tratada com remoção cirúrgica do útero e terapia adjuvante tal como indicado pela patologia específica. Para a doença fase inicial este tratamento resulta em excelentes taxas de sobrevivência de 5 anos de mais de 90% [9]. No entanto, esta cirurgia definitiva impede qualquer outra fertilidade. Como as taxas de obesidade aumentar entre a população, isso resulta em um número crescente de mulheres mais jovens com câncer endometrial e terapia poupadores de fertilidade se tornará mais valiosa. Atualmente, a progesterona são usados ​​como terapia primária na doença avançada ou recorrente, em pacientes que não são candidatos operatório devido a morbidade médica, e em pacientes com a esperança de preservar sua fertilidade futura. Multiple série de casos de pacientes tratados com progesterona têm sido publicados com encorajador, embora não absoluto, resultados. As taxas de resposta para hiperplasia endometrial com atipia variaram de 67-82% as taxas de resposta e para baixo grau gama de câncer endometrial 50-70% (revisto em [10]). Para aqueles pacientes que não respondem à terapia com progestina, histerectomia é recomendado. Essa situação clínica é comum como a porcentagem de pacientes com menos de 45 diagnosticado com câncer endometrial agora varia de 5 a 29% [10],.

A progesterona medeia os seus efeitos inibitórios sobre o endométrio e cancro do endométrio através do receptor de progesterona (PR), receptor de esteróides intracelular com as isoformas a e B. Um aumento nas taxas de resposta à terapia de progestina e melhores resultados de sobrevivência foram relatados em tumores com uma percentagem mais elevada de PR [12]. PRA carece de 164 aminoácidos a partir do terminal N e ambas as isoformas são traduzidas a partir de espécies de ARNm individuais de um único gene sob o controlo de promotores diferentes e são consideradas como funcionalmente distintos [13]. Enquanto os papéis específicos para PRA e PRB permanecem obscuros em cancro do endométrio, estudos sugerem que a PRB pode ser a principal responsável pela isoforma os inibidores do crescimento de tumor e acções supressivas de progesterona in vitro. Em células de Ishikawa PRB-transf ectadas de forma estável, o tratamento MPA resultou na inibição de proliferação, migração e invasão, enquanto que as células de Ishikawa PRA-transfectadas estavelmente não conseguiu inibir estes processos [14], [15]. células Hec50co Além disso, PRB-transfectadas tratados com progesterona demonstraram reduções significativas na proliferação e invasão celular, enquanto que as células que expressam Hec50co PRA tinham efeitos inibidores modestos [16].

MK-2206 é um inibidor, oralmente activo, de alostérico AKT. Numerosos estudos pré-clínicos demonstraram eficácia em inibir AKT e promover a morte de células de cancro como um agente único, bem como em combinação com outros agentes quimioterapêuticos [17], [18], [19], [20]. Os ensaios clínicos estão em andamento utilizando este novo composto para a terapia do cancro para vários tumores sólidos. MK-2206 foi mostrado para ser geralmente bem tolerado em doses até 60 mg por QOD boca e resultou em concentrações no plasma dentro da gama terapêutica aceite [21]. Atualmente, há uma fase II ensaio aberto patrocinado pelo NCI para pacientes com câncer endometrial avançado ou recorrente. Os resultados preliminares são sobrevida livre de progressão e da resposta tumoral objectiva.

Neste estudo, relatamos que a inibição da via AKT por resultados MK-2206 na viabilidade diminuída e aumento da apoptose de células de câncer de endométrio. Além disso, a inibição de AKT aumenta os níveis de proteína PRB, pela modificação da expressão de genes regulados por progestina, e sinergiza com progestina para reduzir o volume do tumor de xenoenxertos. tratamento combinatória com progesterona e inibidores de AKT poderia ser considerado para sensibilizar adenocarcinoma endometrial à terapia progestina.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Northwestern University animal Comissão Care.

células de câncer endometrial

células PRB23 Ishikawa foram obtidos de L. Blok (Universidade Erasmus, Holanda). células de Ishikawa originado a partir de um adenocarcinoma do endométrio bem diferenciado com uma mutação de PTEN conhecido [14]. As células PRB23 foram geradas por transfecção estável do vector de expressão de PRB pcDNA3.1 em células desprovidas de Ishikawa PR endógeno [14]. As células PRB23 foram mantidas em DMEM /F12 com 10% de FBS, piruvato de sódio, penicilina /estreptomicina, higromicina e G418. Em cerca de 60-80% de confluência, as células foram privadas de soro durante a noite em DMEM /F12. As células foram então tratadas no dia seguinte com o veículo, com 100 nM de MK-2206 (2 h antes do tratamento), 10 nM R5020, ou uma combinação do MK-2206 e R5020. MK-2206 (Merck) foi obtido através do Programa de Avaliação de Terapia do cancro.

Western Blot

lisados ​​celulares totais foram obtidos em gelo utilizando a solução de lise Mammalian M-PER (Thermo Scientific) suplementado com inibidores da protease e da fosfatase (Sigma). A concentração da proteína nos lisados ​​foi determinada utilizando o kit micro BCA (Thermo Scientific). As amostras de proteína isolada foram corridas em geles de acrilamida a 8% e, em seguida, transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (Whatman). As membranas foram bloqueadas em 5% de albumina de soro bovino (BSA, Sigma) em TBS-T, à temperatura ambiente durante uma hora. As membranas foram então incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários contra fosforilada (Ser473) -Akt, fosforilado (Thr 308) -Akt, PRAS40 fosforilada, PRAS40, fosforilado (Thr202 /Tyr 204) ERK, ERK, (pThr183 /Tyr185) SAPK /JNK, JNK, PARP clivada da caspase 3 clivada (Cell Signaling), e PR (Dako). As membranas foram lavadas quatro vezes em TBS-T, à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas com anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase secundário ou anticorpo anti-ratinho de cabra durante uma hora à temperatura ambiente. As membranas foram desenvolvidas com o estojo de detecção ECL Super Signal Oeste Femto (Thermo Scientific). As membranas foram cortadas usando Restaurar Ocidental Tampão de descascamento Blot (Pierce) e sondada com um anticorpo para a beta-actina (Sigma) para um controlo de carga.

Viabilidade Celular

Para avaliar a viabilidade celular, foi utilizado o AlamarBlue Viabilidade celular Reagent (Invitrogen). PRB23 células foram semeadas numa placa preta de 96 poços de fundo claro a cerca de 1500 células por cavidade em uma temperatura de 37 ° C incubadora. As células foram deixadas a ligar durante a noite e no dia seguinte, lavaram-se com PBS e, em seguida, privadas de soro durante a noite em DMEM isento de soro /F12. No dia seguinte, as células foram pré-tratadas com 1? M de MK-2206 durante uma hora e, em seguida, tratada com 100 nM de R5020 durante 120 horas. No final do tempo de tratamento, 10 uL de reagente de AlamarBlue foi adicionado a cada poço durante duas horas e, em seguida, o sinal de fluorescência foi medida no leitor de placas Synergy HT da Bio-Tek com o software KC4 3,4 a 530/590 nm para determinar viabilidade celular.

análise microarray e análise estatística

Três culturas de células PRB-Ishikawa separados foram utilizados para análise de microarranjo. As condições experimentais foram veículo ou tratamento com 10 nM de R5020 durante 2 h. Todas as amostras de RNA foram processados ​​no Centro de Genômica do núcleo no Centro de Medicina Genética da Universidade de Northwestern (Chicago, IL). A qualidade do ARN total foi avaliada utilizando o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). 1,5 ug de cada amostra de ARN, com 260/280 e 28S /18S razão superior a 1,8, foi usado para fazer ADNc de cadeia dupla. controlos de qualidade e processamento de nível sonda dos dados de microarranjos Illumina foram ainda feitos com o pacote de R Bioconductor, lumi (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/lumi.html). O processamento de dados também inclui um procedimento de normalização, utilizando o método de normalização quantil [22] para reduzir a variação entre o obscurecimento microarrays, que podem ser introduzidas durante os processos de preparação da amostra, de fabricação, marcação por fluorescência, a hibridação e /ou de varrimento. agrupamento hierárquico e Análise de Componentes Principais foram realizadas nos dados de sinal normalizados para avaliar a relação de amostra e variabilidade. Sondas ausente em todas as amostras foram filtradas de acordo com os valores de p detecção da Illumina na análise a jusante. expressão diferencial de genes entre as diferentes condições foi avaliada por uma análise do modelo linear estatística usando o limma pacote bioconductor, em que um método de Bayes empírico foi utilizado para moderar os erros padrão das mudanças de log vezes estimados de expressão gênica, e resultou em um mais inferência estável e melhorada de energia, especialmente para as experiências com um pequeno número de microarranjos ([23]; https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html). Os valores de p t-estatísticos moderado derivadas da análise limma acima foram ainda ajustados para testes múltiplos por Benjamini e método de Hochberg para controlar a taxa de descoberta de falsas (FDR). As listas de genes expressos diferencialmente Foram obtidos pelos critérios FDR de 5% e dobre mudança de corte de . 1.5, e visualizados por parcelas vulcão

PCR em tempo real

O ARN foi isolado a partir de células utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração e a pureza do RNA extraído foi determinado usando o ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop). Amostras de RNA total foram ADNase I (Zymo Research) tratado para remover qualquer ADN contaminante. O ARN total foi transcrito reverso com transcriptase Smart MMLV (Invitrogen) para a síntese de ADNc utilizando o protocolo do fabricante reversa. PCR em tempo real foi realizada usando iniciadores específicos (Applied Biosystems) para PDK4 e SGK1 e a TBP gene de manutenção. A mudança vezes na expressão foi calculada usando o método ΔΔCt [24], com TBP como um controlo interno. Todas as reacções de PCR foram realizadas num ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) durante 40 ciclos (95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min) após 10 min de incubação a 95 ° C.

xenoenxertos de tumor

Seis semanas ratinhos CD-1 nu idade, fêmeas ovariectomizados foram adquiridos a Charles River Laboratories. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care Universidade Northwestern. Um milhão de células foram suspensos PRB23 01:02 em PBS /Matrigel (BD Biosciences) em um volume total de 100 uL e injectadas subcutaneamente no dorso direita e à esquerda de cada rato. Um total de 32 ratinhos foram injectados de modo a ter 8 ratinhos por grupo de tratamento. Os tumores foram deixados crescer durante 8 semanas. Dos 32 ratinhos, os tumores cresceram em 28 ratinhos. Além disso, 2 ratinhos morreram por razões desconhecidas. Os 26 ratinhos restantes foram divididas em 4 grupos, veículo (6), a progesterona (7), MK-2206 (7), e MK-2206 + progesterona (6). peletes de progesterona (50 mg, 21 dias de libertação de 2,4 mg /dia) foram implantados subcutaneamente. Os ratos receberam 120 mg /kg de MK-2206, 3 vezes por semana durante 9 dias, num volume de 0,3 mL de 30% Captisol. Todos os estudos de toxicidade foram realizados em roedores por Merck e 120 mg /kg é a dose recomendada para estudar os efeitos sobre tumores, sem causar toxicidade [25]. Os ratinhos do grupo de controlo de veículo foram 0,3 ml de 30% Captisol. Os murganhos foram pesados ​​antes e depois dos tratamentos. Os tamanhos dos tumores foram medidos com compassos de calibre, através do curso de 8 semanas, bem como após os tratamentos. Os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula:

O volume do tumor

= 1/2 (

comprimento

×

largura

)

2 [25] . Os tumores foram excisados ​​e processados ​​para imuno-histoquímica.

A imuno-histoquímica

Os tecidos foram fixados em formalina e embebidos em parafina, e 4 uM secções de tecido foram colocadas em lâminas de vidro. As secções de tumor foram de-parafinado. recuperação de epítopo de calor induzida foi, então, realizada num tampão de citrato de 10 nM de sódio com 0,05% de Tween (Sigma) a pH 6,0. O tampão de citrato foi pré-aquecido num banho-maria a 99 ° C e, em seguida, as lâminas foram colocadas no tampão durante 45 minutos. As lâminas foram deixadas arrefecer durante 30 minutos à temperatura ambiente e foram lavadas em TBS-T durante 5 minutos. Foi utilizado o kit Dako EnVision HRP IHC. 3% de peróxido de hidrogénio foi aplicada às secções de tecido, durante 10 minutos, seguido de 2 lavagens de 10 minutos em TBS-T. bloco de proteína foi aplicada durante 30 minutos à temperatura ambiente. As secções de tecido foram então incubadas com anticorpos primários ao PR (Dako) ou caspase 3 clivada (Cell Signaling) durante a noite a 4 ° C numa câmara humidificada. Anti-coelho ou de anticorpo secundário anti-ratinho foi então aplicada às secções de tecido, durante 1 hora à temperatura ambiente e depois lavadas em TBS-T durante 5 minutos duas vezes. DAB solução foi aplicada a cada secção de tecido, durante 5 minutos e, em seguida, enxaguado. Hematoxilina de Mayer foi usada para contracoloração e as lâminas foram enxaguadas. As secções foram então colocadas numa solução de hidróxido de amónio a 28% e, em seguida, enxaguado. As secções foram desidratadas através de 2 mudanças de 95% etanol, 2 mudanças de etanol a 100%, e 2 mudanças de xileno. As secções foram então montados em lamelas utilizando meios de montagem Cytoseal XYL (Richard-Allan Scientific). As lâminas foram então visualizada usando o microscópio de 200 Axiovert (Zeiss) e as fotos tiradas com a câmera Zeiss Axiocam.

Resultados

MK-2206 Inibe AKT

Tem sido previamente relataram que as células de Ishikawa realizar uma mutação PTEN e isto resulta na activação constitutiva de jusante AKT [7], [8]. A fim de determinar se MK-2206 inibiu AKT nas células PRB23, as células foram tratadas com concentrações crescentes de MK-2206 (0-1? M) e incubou-se durante vários tempos (0-24 h) (Fig. 1A, 1B). Fosforilada (Ser473) -Akt foi detectada nas células tratadas com veículo e os níveis progressivamente diminuiu com concentrações crescentes de MK-2206 (Fig. 1A). Os níveis totais de AKT não foram afetados pelo tratamento com MK-2206. Os níveis de P (Ser473) -Akt diminuiu, tão cedo quanto uma hora, e manteve-se mais baixa do que as células tratados com veículo às 24 h (Fig. 1B). Os níveis de P (Thr308) -Akt também diminuiu com 100 nM de tratamento MK-2206, tanto a 4 h e 24 h (Fig. 1C). PRAS40 é um substrato directo de AKT e níveis de P (Thr246) -PRAS40 diminuiu após tratamento MK-2206 em 4 h e 24 h, indicando que a actividade de AKT é diminuída (Fig. 1C). Em seguida, a fim de demonstrar que o MK-2206 era específico para a Akt em células PRB23, os níveis de outras cinases fosforiladas, que não são alvos directos da Akt foram medidos. Níveis de p (Thr202 /Tyr204) -ERK, bem como p (Thr183 /Tyr185) -JNK não se alterou após tratamento MK-2206, quer a 4 h ou 24 h (Fig. 1C).

PRB- células específicas de Ishikawa (PRB23) foram tratados com concentrações crescentes a) 0-1 (UM) do MK-2206, durante 24 h e B) de 100 nM MK-2206 para diversas vezes (0-24 h). Os níveis da proteína de p (Ser473) -Akt, AKT e actina foram medidos por Western blot. C) As células foram tratadas com PRB23 100 nM MK-2206 durante 4 h ou 24 h e níveis de P (Thr308) -Akt, AKT, P (Thr246) PRAS40, PRAS40, P (Thr202 /Tyr204) ERK, ERK, P ( Thr183 /Tyr185) SAPK /JNK, JNK e actina foram medidos por western blot.

a inibição da AKT Aumenta PRB Níveis de proteína

Curiosamente, tratamento com MK-2206 também resultou em um aumento significativo nos níveis de PRB nas células PRB23, indicando que a AKT afecta proteína PR níveis nestas células (Fig. 2A). Dada a função de antagonista de progesterona no endométrio, as implicações de modulação dos níveis de PR são significativas. Em primeiro lugar, um micro-arranjo foi realizada para identificar genes PRB-regulados em células PRB23. Especificamente, as células PRB23 foram tratadas com 10 nM de R5020 durante 2 h e, portanto, seria identificado apenas os genes de resposta precoce à progestinas. Um total de 70 genes foram significativamente regulada positivamente por mais do que 1,5 vezes e 16 genes foram regulados negativamente significativamente (Fig. 2B). Os genes mais altamente regulados positivamente foram PDK4 (9,92 vezes), TIPARP (7,79 vezes), e SGK1 (4,41 vezes). Genes foram ainda analisados ​​com o “funcional anotação cluster ‘ferramenta do banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID) [26]. Genes foram classificados de acordo com o banco de dados SP-PIR-chave. A categoria que incluiu o maior número de genes que foram regulamentadas pelo R5020 foi “fosfoproteínas” eo segundo mais alto foram genes que seus produtos foram associados com o núcleo (Fig. 2C).

A) específico-PRB Ishikawa células (PRB23) foram tratados com veículo, com 100 nM de MK-2206, de 10 nM R5020, ou uma combinação de MK-2206 + R5020 (M + R) durante 4 h e níveis de proteína P (Ser473) -Akt, AKT, PRB , e actina foram medidos por Western blot. B) Análise de Microarray de células PRB23 tratados com veículo ou 10 nM R5020 foi realizada e os genes significativamente regulada de 1,5 vezes ou superior foram identificados. análise C) Categorias Gene ontologia foi feito usando DAVID de genes regulados por mais de 1,5 vezes por R5020.

Em seguida, a influência de AKT em genes alvo Problema foi examinada. PRB23 células foram tratadas com 10 nM R5020, na presença ou ausência de 100 nM MK-2206. Expressão de PDK4 e SGK1 foram então medido por PCR em tempo real. PDK4 e SGK1 foram categorizados como fosfoproteínas. Como representado na Figura 3, ambos PDK4 e SGK1 foram significativamente regulada positivamente por R5020, confirmando os dados de microarray. tratamento MK-2206 sozinho não influenciar a expressão de qualquer dos genes testados em comparação com as células tratadas com o veículo. Quando as células foram tratadas, em combinação com R5020 e MK-2206, de expressão PDK4 aumentou significativamente, no entanto, a expressão SGK1 não se alterou com o tratamento da combinação em comparação com R5020 sozinha. Esta regulação diferencial de genes alvo PRB nas células PRB23 quando AKT é inibido fortemente sugere um mecanismo mais complexo de genes reguladores do que simplesmente os níveis crescentes de proteína PROBLEMA.

PRB23 células foram tratadas com o veículo, 10 nM R5020, 100 nM MK-2206, ou uma combinação de MK-2206 + R5020 (M + R) e a expressão do gene de PDK4 e SGK1 foi medida utilizando PCR em tempo real. Os dados são apresentados como alterações de dobragem a partir de amostras tratados com veículo e representam a média ± SEM de 6 experiências independentes. “*” Indica a significância estatística em relação ao veículo de controlo. P ≤ 0,05.

MK-2206 e progesterona Diminui a viabilidade celular eo tamanho do tumor

A fim de medir os efeitos da AKT e progestina sobre a viabilidade de células de câncer, as células foram tratadas com PRB23 R5020 na presença ou ausência de MK-2206 e a viabilidade celular foi medida. Enquanto R5020 e MK-2206 diminuiu independentemente viabilidade das células ao longo de 5 dias, a combinação de R5020 e MK-2206 causou a maior diminuição na viabilidade (Fig. 4).

PRB23 células foram tratadas com o veículo, 100 nM R5020, 1 uM de MK-2206, ou uma combinação de MK-2206 + R5020 (M + R), durante 5 dias e a viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio Alamar Blue. Os dados são apresentados como% da viabilidade a partir de amostras tratados com veículo e representam a média ± SEM de 4 experiências independentes.

Em seguida, os efeitos da progesterona e MK-2206 foram testados em tumores xenoenxertados que se desenvolveram a partir da injecção subcutânea das células PRB23 em ratinhos nus. Os tumores foram cultivadas durante 8 semanas e subsequentemente tratado durante 9 dias com veículo, progesterona, MK-2206, ou progesterona + MK-2206 (Fig. 5A). Peso de ratinhos não se alterou significativamente com os tratamentos (Fig. 5B). Em comparação com os ratos tratados com o veículo, os ratos tratados apenas com MK-2206 ou progesterona sozinha exibiram reduções modestas em seu volume do tumor com base na mudança vezes do tamanho do tumor antes do tratamento. A maior diminuição do tamanho do tumor foi observada em ratos tratados tanto com MK-2206 e progesterona (Fig. 5C).

Células PRB23

A) foram subcutaneamente xenoenxertado em ratinhos nus CD1. Após 8 semanas, os ratinhos foram tratados com veículo, de 120 mg /kg MK-2206 por via oral, 3 vezes por semana durante 9 dias, a progesterona ou a combinação de MK-2206 e progesterona. B) Os pesos de ratos foram medidos antes e após os tratamentos e tumores C) foram medidos antes e após os tratamentos e o volume foi calculado. “*” Indica a significância estatística em relação ao veículo de controlo. P ≤ 0,05.

A análise imunohistoquímica foi realizada em secções de tumores usando anticorpos para receptor de progesterona, Ki67 e caspase-3 (Fig. 6). Coloração para PR foi evidente nos tumores, embora nem todas as células foram positivas para o PR. O tratamento de progesterona PR diminuição dos níveis de ambos na presença e ausência de MK-2206. Em contraste, MK-2206 tratamento proporcionou um aumento nos níveis de proteína PR nos tumores, semelhante ao que foi observado em células do cancro do endométrio (Fig. 2A). A proliferação das células foi medida por níveis de proteína Ki67, que diminuiu com progesterona, MK-2206, bem como a combinação de progesterona + tratamento MK-2206. Os níveis mais baixos de coloração de Ki67 foi observado com o tratamento combinado, o que sugere que o tratamento combinado diminui mais eficazmente a proliferação das células cancerosas. Os níveis de caspase-3 clivada, um indicador de apoptose, foram negligenciáveis ​​nos tumores dos ratinhos tratados com veículo, enquanto que a coloração era evidente nos tumores de progesterona ou MK-2206 ratinhos tratados. O tratamento combinado resultou na mais alta expressão da caspase-3 clivada, indicativos de aumento da apoptose.

tumores xenoenxerto foram fixadas, embebidas e seccionadas. coloração imuno-histoquímica de tumores para PR, Ki67 e clivada casapse-3 (CC3) foi realizada.

Discussão

Neste estudo, demonstramos que MK-2206 de forma eficiente diminuição dos níveis de p (Ser473) e p -Akt -Akt (Thr308) nas células de Ishikawa mutada-PTEN. Como resultado, os níveis de p (Thr246) -PRAS40, um alvo a jusante de Akt, diminuíram assim, indicativos de que a actividade de AKT foi inibida por MK-2206. Este inibidor não afectou os níveis de outras cinases, tais como pERK e pJNK demonstrando especificidade para este composto para a Akt. A inibição de AKT, também aumentou os níveis de PRB. Anteriormente, foi demonstrado que um inibidor de AKT diferente, API-59CJ-OMe (Merck4Biosciences), também aumentou significativamente os níveis de PR em células de Ishikawa PRB23 [8]. Gu et al., [27], demonstraram recentemente que a inibição de PI3K LY294002 PR utilizando níveis aumentados em células de Ishikawa. A influência da Akt sobre a expressão e função de PR não foi estudada em detalhe e os mecanismos pelos quais este aumento na proteína PR ocorre estão actualmente a ser exploradas no nosso laboratório. Nossa hipótese de trabalho atual centra-se no papel da AKT na diminuição da sensibilidade à progesterona no câncer de endométrio. Diminuição dos níveis de PR foi o primeiro pedaço de evidência de apoio da nossa hipótese. Supõe-se que o aumento dos níveis de PR PR deve melhorar a função da transcrição, no entanto, os dados revelam que a acção da PR é mais complexa, uma vez que nem todos os genes regulados por progesterona foram influenciadas por inibição de AKT. Está bem estabelecido que, tal como outros receptores de hormonas esteróides, a regulação de genes por RP envolve numerosas interacções com outros factores de transcrição, o ADN, coregulators, e complexos de cromatina remodelação. ação PR é gene específico em que os diferentes mecanismos são empregadas em diferentes locais da cromatina. A nossa análise de microarray identificou PDK4 ser o gene mais altamente regulada positivamente (aumento superior a 50 vezes) com o tratamento de curto prazo de progestina. Este foi também um gene que foi ainda aumentada com progestina quando AKT foi inibida, o que indica que a AKT hiperactiva nas células Ishikawa amortece a acção da progesterona sobre este gene em particular. Tem sido demonstrado que PDK4 também é regulada por glucocorticóides, através de GR, em células HepG2 [28]. Eles demonstraram que a sobre-expressão de PKBα revogada a estimulação dexametasona do promotor PDK4 que fortalece os nossos achados. Além disso, demonstraram que FOXO1, que está directamente por AKT fosforilado e exportados para o citoplasma, foi necessária para a regulação positiva mediada por GR da PDK4. Nós demonstramos uma cooperação de PR e FOXO1 em genes que regulam em células estromais do endométrio [29], [30], [31] e, assim, é provável que a regulação positiva por PDK4 progestinas requer tanto PR e FOXO1 em células de cancro do endométrio. Assim, quando AKT está ativo, níveis insuficientes de FOXO1 estão disponíveis para atuar no núcleo e expressão de PDK4 é amortecido. Seria interessante para determinar a significância do PR e FOXO1 cooperação nos outros genes de progesterona-sensível que foram influenciados pela inibição AKT no câncer de endométrio.

PDK4 é uma quinase que inativa o complexo piruvato desidrogenase (PDC) . O PDC gera acetil-CoA, que é o precursor para a síntese dos ácidos gordos e a produção de energia pelo ciclo de Krebs. PDC actividade é regulada por PDKs e fosfatases PDC para fosforilar ou desfosforilar o componente E1a do complexo. Este regulamento é importante para controlar a glicose e metabolismo lipídico. A sobre-regulação de PDK4 por progesterona, e um aumento adicional de este aumento após tratamento MK-2206 sugere que progestinas podem actuar para inactivar o PDC e inibir a conversão de piruvato em acetil-CoA. Esta inibição da produção de acetil-CoA pode, consequentemente, conduzir à utilização de vias metabólicas tais como glicólise alternados. Dado o papel central que PDK4 desempenha na regulação da escolha entre a glicólise e a fosforilação oxidativa, PDK4 tem sido implicada num número de diferentes tipos de cancro. Foi previamente mostrado que a inibição da actividade de PDK é suficiente para inibir a proliferação e induzir a apoptose em células de cancro do pulmão, o que sugere que pode conduzir a tumorigénese PDKs [32]. No entanto, estudos recentes também demonstraram que a sobre-expressão de PDK4 é suficiente para inibir a proliferação de células de cancro da mama e que a expressão é regulada negativamente na PDK4 uma série de tecidos de cancro diferentes [33]. O papel específico que PDK4 desempenha no câncer de endométrio continua a ser decifrado.

estudos pré-clínicos demonstraram MK-2206 para inibir eficazmente a via AKT, bem como a proliferação de diminuição e o crescimento do tumor de várias linhas celulares de cancro [25]. Também tem sido demonstrado que a combinação de MK-2206 e os agentes quimioterapêuticos é mais eficaz na inibição do crescimento do tumor [25]. MK-2206 juntamente com um inibidor da MEK foi demonstrada para ter um efeito sinérgico sobre o crescimento do tumor e levou a taxas de sobrevivência aumentados em ratinhos portadores de tumores de pulmão humano altamente agressivos [34]. MK-2206 foi capaz de restaurar a sensibilidade de células resistentes ao sorafenib, um inibidor da tirosina cinase, para induzir apoptose em células de carcinoma hepatocelular [35]. Em combinação com gefitinib, uma pequena molécula inibidora da tirosina-cinase EGFR, MK-2206 eficaz promovido apoptose em glioma maligno [17].