Abstract

O câncer cervical (CC) é causada por de alto risco papilomavírus humano persistência devido ao microambiente do tumor imunossupressora mediada por citocinas. microflora vaginal determina a presença de certas citocinas localmente. Foi avaliada a associação entre a diversidade microbiota do colo do útero e o diagnóstico histopatológico de cada fase de CC, e avaliou-se ARNm de níveis de IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α e IFN-γ através de expressão cervical o diagnóstico histopatológico e aglomerados de bactérias específicas. Foi determinada a microbiota do colo do útero por uma elevada taxa de transferência de sequenciamento amplicons 16S rDNA e classificou-o em tipos State Community (CST). A diferença média entre as análises alfa-diversidade e diagnóstico histopatológico foram realizados, assim como uma análise β-diversidade dentro do diagnóstico histológico. expressão do mRNA das citocinas do colo do útero foi analisada através dos OCS e os diagnósticos histopatológicos. Nós encontramos uma diferença significativa na diversidade da microbiota em mulheres NCL-HPV negativos vs aqueles com lesões intraepiteliais escamosas (SIL) e CC (p = 0,006, p = 0,036) .Quando β-diversidade foi avaliada, as amostras CC apresentou a maior variação dentro grupos (p 0,0006) e a maior distância em comparação com os negativos NCL-HPV (p 0,00001). As bactérias predominantes em mulheres com citologia normal foram

L

.

crispatus

e

L

.

iners

, enquanto que para SIL, foi

Sneathia spp

. e para CC,

Fusobacterium spp

. Encontramos mais elevados níveis cervicais medianas de IL-4 e TGF-β1 mRNA na CST dominada pelo

Fusobacterium spp

. Estes resultados sugerem que a microbiota cervical pode estar implicado na patologia do cancro do colo do útero. Mais estudos de coorte são necessários para validar esses achados

Citation:. Audirac-Chalifour A, Torres-Poveda K, Bahena-Román M, Téllez-Sosa J, Martínez-Barnetche J, Cortina-Ceballos B, et al . (2016) Cervical Microbiome e citocinas perfil em várias fases do cancro do colo do útero: um estudo piloto. PLoS ONE 11 (4): e0153274. doi: 10.1371 /journal.pone.0153274

editor: Maria Lina Tornesello, Istituto Nazionale Tumori, ITALY

Recebido: 04 de dezembro de 2015; Aceito: 25 de março de 2016; Publicação: 26 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Audirac-Chalifour et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Salud Pública, México e subsídios do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (MX) (CONACYT) Fondo SEP CB -2011-01-169552, CONACyT-Fondo E0013 APOYO complementario Cátedras-2014-C01-245520 e CONACyT-FONSEC SSA /IMSS /ISSSTE-2014-C01-234149, México. Audirac-Chalifour graças do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) para a bolsa de mestrado 2976418945. K Torres Poveda é CONACyT Research Fellow-Instituto Nacional de Saúde Pública (INSP), Cuernavaca, Morelos, México.

concorrentes interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical (CC) é o quarto tipo de câncer mais comum em mulheres eo sétimo no geral em todo o mundo, com uma estimativa de 485 000 novos. casos e 236 000 mortes em 2013. CC causados ​​6,9 milhões de anos de vida ajustados por incapacidade (DALYs) em 2013 [1], e foi a segunda causa mais comum de morte por câncer entre as mulheres mexicanas em 2011 (10,4%) [2 ]. CC é causada por uma infecção persistente com vírus do papiloma humano de alto risco (HR-HPV). No entanto, uma infecção HR-HPV é considerada uma condição necessária, mas não uma causa suficiente para o desenvolvimento CC [3]. fatores mecânicos, como ducha vaginal ou relação sexual, e os fatores biológicos, como a vaginose bacteriana (VB) [4, 5], ou infecções sexualmente transmissíveis (IST) [6] alterar o microambiente vaginal e foram identificados como cofatores na persistência de uma infecção pelo HPV [7].

a grande maioria das mulheres infectadas por HPV-RH nunca desenvolvem CC causa uma resposta imunitária adequada é capaz de controlar a infecção e impedir a sua progressão para lesão pré-cancerosa [8]. Isto sugere que factores adicionais actuam em conjunto com o HPV para influenciar o risco de desenvolvimento de CC. Até agora, os seguintes co-fatores determinantes têm sido associados ao aparecimento de CC: fatores sócio-ambientais (barreiras culturais, a pobreza extrema, as áreas de saneamento pobres, e acesso limitado a cuidados de saúde) [9], fatores epidemiológicos (multiparidade, o uso de contraceptivos orais há mais de cinco anos, múltiplos parceiros sexuais e tabagismo) [10, 11], e fatores genéticos relacionados ao hospedeiro (polimorfismos em genes de resposta imune, que determinam uma resposta imune deficiente e imunossupressão local) [12 a 14] . Portanto, CC é uma doença multifatorial complexa, e é necessária mais investigação para melhorar a nossa compreensão da sua etiologia.

Foi recentemente proposto que a microbiota vaginal anormal desempenha um papel importante no desenvolvimento da neoplasia cervical [15] . Um estudo epidemiológico identificou

Chlamydia trachomatis

como um co-fator para o desenvolvimento de CC [16]. Da mesma forma, outros estudos mostram que algumas espécies bacterianas parecem estar associados com o desenvolvimento de outros cancros, tais como cancro do cólon; esses estudos também sugerem que várias espécies bacterianas preferencialmente habitam locais de tumor [17, 18].

Há ainda várias lacunas no conhecimento sobre a associação entre microbiomes vaginal e cervical e desenvolvimento de CC [19]. evidências baseadas em cultura bacteriana indica que alguns patógenos potenciais pró-oncogênicos, que podem ser membros da microbiota comensal, contribuem para a iniciação e desenvolvimento [20, 21] tumor.

CC é uma doença de longa data, e há são etapas anteriores a ele durante o qual as condições do meio ambiente cervical e vaginal são modificados, incluindo padrão de acidez e de citocinas vaginal que levam a um estado de imunossupressão local. A presença de lactobacilos, um pH vaginal baixo ( 4,5) e péptidos antimicrobianos fazem parte dos mecanismos de defesa presentes no microambiente vaginal [22]. Quando um desequilíbrio do sistema de defesa ocorre, surgem alterações físico-químicas e produzir alterações histológicas da mucosa vaginal e o epitélio cervical, todos os quais as condições de uma pressão selectiva sobre a microbiota [23]. Num microambiente CC, a presença de citocinas imunossupressoras (TGF-SS1, IL-10) favorece a persistenceof a infecção por HPV [24, 25, 26, 27]. A maioria dos estudos sobre a microbiota tracto genital feminino foram realizadas ao nível vaginal e alguns estudos envolvem os perfis de citocina e microbiota do colo do útero. Uma análise comparativa do genoma da microbiota vaginal identificou alterações na microbiota diversidade entre as mulheres com infecção genital pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), com ou sem a vaginose bacteriana (BV) [28] e em mulheres grávidas [29]. Além disso, foi proposto que o ecossistema microbiano vaginal e o perfil de citoquinas desempenham um papel na promoção de displasia cervical [30], uma vez que uma microflora vaginal anormal tem sido associada com a aquisição de uma infecção pelo HPV [31]. No entanto, poucos estudos têm sido realizados sobre a microbiota do colo do útero, como um modificador da história natural do HPV no que diz respeito ao desenvolvimento de lesões cervicais e neoplasia cervical [32].

Considerando que ficou provado que as espécies específicas da microbiota cérvico modular a resposta imune inflamatória no trato genital feminino das mulheres sul-Africano negros saudáveis ​​[33], é possível que o microbioma cervical está envolvida na promoção da expressão de citocinas imunossupressoras [34] .que têm a hipótese de que a infecção pelo HPV eo desenvolvimento de SIL e CC estão associados a mudanças na diversidade da microbiota e com padrões de expressão de citocinas ao nível cervical. O nosso estudo examinou a associação entre a diversidade microbiota do colo do útero e a composição, de acordo com um diagnóstico histopatológico de cada fase da história natural de CC, e os níveis de expressão do colo do útero de IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF -α e IFN-γ mRNA.

material e Métodos

desenho do estudo e população

um estudo transversal foi realizado, utilizando amostras de um banco biológica construída entre 2008 e 2011 a partir de novos casos diagnosticados de lesões intraepiteliais escamosas (SIL) (n = 268 amostras HPV-positivos); mulheres com um Papanicolaou negativo e uma colposcopia normal, como controles (n = 205, 81 amostras HPV-positivos de HPV-negativos e 124), recrutados a partir das Mulheres Centro de Saúde no Estado de Morelos (

Centro de Atención para la Salud de la Mujer del Estado de Morelos

) no México entre junho de 2008 e novembro de 2011 e, a partir dos casos de carcinoma de células escamosas do colo do útero (n = 171 amostras HPV-positivos), recrutados a partir do Serviço de Ginecologia do Instituto Nacional do Câncer (inca) na Cidade do México, entre setembro de 2010 e dezembro de 2011. os Bioética e pesquisa Comitês pelo inca (número de referência. inca /CC /326 /10CB /609) e no Instituto Nacional de Saúde Pública (

Instituto Nacional de Salud Pública

-INSP; número de referência: CI814) aprovou o estudo de linha de base durante o qual o banco biológica foi construída. Além disso, todos os participantes deram o seu consentimento informado para usar suas amostras biológicas para estudos de investigação. Cada sujeito foi entrevistado para estilo de vida, fatores sócio-demográficos e reprodutivos conhecidos por estarem associados com risco aumentado de CC [12].

Por conveniência metodológica, foram selecionados 32 casos para este estudo, as lesões não-cervicais (NCL : n = 10, HPV-negativo; n = 10 HPV-positivo), SIL (n = 4 por HPV-positivo) e CC (n = 8 HPV-positivo). Os critérios de inclusão para a seleção sub-amostra relacionada com a história médica foram: recrutamento do paciente no mesmo dia do período menstrual (sete pós-aposentadoria menstruais dias de período), o não uso de duchas e nenhuma atividade sexual em dias anteriores da amostragem. Além disso, não ter registros de uso de antibióticos ou antifúngicos nos últimos 30 dias anteriores à amostragem. Outros critérios de inclusão foram: HPV molecular + diagnóstico; DNA e RNA pureza e integridade adequados para sequenciação e mRNA quantificação por qRT-PCR, e sendo mexicana com pais e avós mexicanos para garantir ascendência similar. O único critério de exclusão foi não ter suficiente lê. “Nós consideramos 1 000 como o limiar, após a realização da análise da sequência de bioinformática. características sócio-demográficas e reprodutiva-sexuais da população estudada são apresentados na Tabela 1. Todos os sujeitos do estudo eram mulheres mexicanas, cuja idade variou de 22 a 61 anos. Houve diferença significativa entre os grupos em relação ao método contraceptivo e o teste HPV positivo. pacientes CC não relataram uso de métodos contraceptivos mais frequentemente do que os pacientes NCL. Em relação aos casos SIL, os genótipos de HPV mais prevalentes foram HR-HPV (não-HPV16 ou 18), enquanto que entre os pacientes CC o genótipo mais prevalente foi o HPV 16.

Características do banco de amostras biológicas

As amostras foram retiradas das mulheres colo sete dias após a menstruação retirada. O banco biológico utilizado para este estudo é composto por amostras de DNA e cDNA extraído de epitelial cervical raspagem cotonetes de mulheres diagnosticadas com NCL e de biópsias de células frescas de mulheres diagnosticadas com SIL e CC. DNA genômico foi extraído de raspagens epiteliais cervicais e biópsias previamente digerido com proteinase K, usando a Genomic DNA Purification Kit (Fermentas Ciências da Vida, Vilnius, Lituânia). foram tomadas todas as medidas possíveis para evitar a contaminação cruzada de amostras durante a extração de DNA. a concentração e a pureza do ADN foram avaliados pela Thermo Scientific NanoDropTM 1000 espectrofotómetro (260/280) e a integridade do DNA foi determinada por electroforese em géis de agarose a 1%. O ARN total foi isolado a partir de amostras cervicais utilizando o reagente Trizol de Invitrogen. síntese de cDNA foi levada a cabo na presença de 200 U de M-MLV de transcriptase reversa e 2,5 ug de ARN total, utilizando condições padrão. As reacções de PCR foram realizadas num volume reaccional de 25 ul contendo 1 uL de ADNc, 0,2 mM de dNTPs, 15 pmol de cada iniciador, 2,5 mL de tampão de reacção and1U de ADN polimerase Taq recombinante. Os iniciadores para a arrumação de GAPDH humano gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (450 pb) foram utilizados para verificar a integridade do ADNc.

amostras cervicais foram previamente testados para HPV. Os fragmentos de ADN viral a partir de amostras foram amplificadas por PCR utilizando iniciadores de consenso MY09 /MY11 [35], LIC1 /LIC2 [36], e GP5 /GP6 [37], que flanqueiam a região L1 do HPV cápside. A amplificação por PCR de GAPDH (556pb) foi usada como um controlo interno para a qualidade do ADN. As linhas celulares que expressam de HPV-16 (SiHa) e HPV-18 (HeLa) foram utilizados como controlos positivos. Deionizada H

2O serviu como controle negativo. Todos os produtos foram analisados ​​por electroforese em géis de acrilamida a 6%. As amostras positivas foram visualizados num gel de agarose a 1,5%. A banda de DNA obtido foi extraído e purificado com o MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) e sequenciado utilizando o método de Sanger. As sequências de HPV foram analisados ​​pelo BLAST. HPV foi categorizada de acordo com seus padrões filogenéticos em tipos de alto risco e baixa: HPV16 e HPV18. estatuto de HPV foi confirmada com o ensaio de detecção de HPV II RH Anyplex

TM de Seegene

®, com base no multiplex PCR em tempo real, e TOCE RPD tecnologia de pares de iniciadores, de acordo com as instruções do fornecedor. [38]

Ética declaração

Este estudo foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Foi aprovado pela Research, Comitês de Ética e Biossegurança no INSP (CI: 1143). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes

Análise do colo do útero expressão do mRNA das citocinas

A amplificação qRT-PCR foi realizada em duplicado para a análise de expressão gênica com as seguintes sondas TaqMan:. GAPDH (ID -Hs99999905_mL), IL-4 (ID-Hs00174122_mL), IL-6 (ID-Hs00174131_mL), IL-10 (ID-Hs00961622_mL), TGF-β1 (ID-Hs00961622_mL), TNF-α (ID-Hs00174128_mL) e IFN -γ (ID-Hs00174143_mL). A mistura de amplificação foi preparada por adição de 100 ng de cada amostra de ADNc a uma mistura de reacção final de 10 ul contendo 5 ul de TaqMan PCR Master Mix para expressão, 0,5 ul de sonda e 3,5 l de água de grau molecular DNase-livre. Os ciclos de amplificação (realizada em um StepOnePlus ™ da Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) foram como se segue: 94 ° C durante 10 minutos, 40 ciclos a 94 ° C durante um minuto, 54 ° C durante um minuto, 72 ° C durante um minuto e 30 segundos, seguido por 72 ° C durante 15 minutos. GAPDH foi utilizada para normalizar a quantidade de IL-4, IL-6, IL-10, ARNm de TGF-p 1, TNF-a e IFN-y presente em cada amostra [39]. As células mononucleares de sangue periférico, estimuladas com fito-hemaglutinina durante 72 horas foram utilizados para determinar as curvas gama dinâmica de IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α e a expressão de IFN-γ; Todas as curvas padrão foram realizadas em triplicado. O nível de expressão de ARNm para cada citoquina estudado foi calculada usando a quantificação relativa com o Ct comparativa (2-ΔCt) método, tendo GAPDH como gene endógeno. As amostras foram analisadas em duplicado.

de alta capacidade de sequenciamento do 16S rDNA amplicons

amplicons de ~ 456 pb contendo as regiões variáveis ​​V3-V4 de 16S genes rRNA foram obtidos para DNA bibliotecas preparação. Os iniciadores directo 5′-347F GGAGGCAGCAGTRRGGAAT-3 ‘e 5′-803R reversa CTACCRGGGTATCTAATCC-3’, descrito pela Nossa, foram utilizados [40]. Uma primeira, por PCR foi realizada com as seguintes condições: 50 ng de modelo a partir de cada amostra de ADN foram adicionados a uma mistura de reacção final de 30 ul contendo tampão de reacção 1X, MgSO 2,5 mM

4, 1 mM de dNTPs, 0,2 U Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) e 5 pmol /uL dos iniciadores. O programa de amplificação foi o seguinte: 94 ° C durante 3 minutos, depois 30 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, 68 ° C durante 30 segundos, seguido por 68 ° C durante 5 minutos. Amplicões foram visualizados por electroforese em gel de agarose a 1%. As bandas de DNA obtidos foram purificados por MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha).

amplicons foram re-amplificado e processado com os mesmos iniciadores ligados ao adaptador A do protocolo de sequenciação 454 seguido por um 6- mer identificador multiplex e pelo iniciador 347F. O iniciador inverso foi o mesmo para todas as reacções ligados a adaptador B do protocolo de sequenciação 454. As condições reaccionais eram como se segue: 0,0625 ng de cada amostra de ADN a uma mistura de reacção final de 30 ul contendo 1X tampão de reacção, MgSO 2,5 mM

4, 1 mM de dNTPs, 0,2 U Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) e 5 pmol /mL de iniciadores de 347F e 803R. Os ciclos de amplificação foram os seguintes: 94 ° C durante 3 minutos, depois 15 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, 68 ° C durante 30 segundos, seguido por 68 ° C durante 5 minutos. A electroforese em gel foi realizada em gel de agarose a 1,5% para visualizar a integridade dos produtos amplificados. Os fragmentos de ADN foram purificados por MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) e depois quantificadas e avaliadas. Amplicões foram reunidas em oito bibliotecas e misturado de forma equimolar. Subsequentemente, as bibliotecas foram purificados com Ampurebeads PE (Beckman Coulter, Inc.). Foram então realizadas cálculo titulação e produção de emulsão de PCR para determinar o volume de esferas para carregar em placas de sequenciação. Subsequentemente, maciço sequenciação foi realizada num sequenciador da plataforma Genoma titânio Roche-454 (AppliedScience).

Bioinformatics análise

As matérias-sequências de região V3-V4 a partir do gene 16S rRNA para cada amplicon gerado foram processados ​​com o software complementar Roche-454, e * arquivos .sff foram gerados. De alta qualidade lê foram selecionados os seguintes critérios: lê com mais de cinco bases consecutivas com pontuação inferior a 20 na escala Qphred em um 30 bases janela móvel foram descartados. controle de qualidade (QC) foi supervisionado com roteiro de Thomas R Girke que usa um fastq biblioteca Quality.R para traçar a distribuição da classificação atribuída a cada base de acordo com a sua posição na escala logarítmica Qphred [41]. Uma vez que os arquivos de qualidade e sequências foram obtidas separadamente dos * .sff arquivos raw, demultiplexing foi realizado em QIIME para identificar as sequências pertencentes a cada amostra de acordo com seu identificador molecular (MID) [42].

As sequências foram agrupados em unidades taxonômicas operacionais (Otus) usando o algoritmo PyNAST para alinhamento de sequências. Todas as sequências que tinham uma semelhança de 99% ou mais foram considerados como um único OTU [43]. Uma seqüência representante de cada OTU foi escolhido para identificação taxonômica mais tarde. Taxa foram designados com o algoritmo Uclust [44], usando o banco de dados de genes verde (libertação de 99% em Maio de 2013) como referência, de modo que qualquer sequência representante alinhado com uma similaridade de 99% com uma sequência de referência seria atribuído o nome mesma espécies [ ,,,0],45].

as sequências que não se alinham com a referência foram extraídos para outro arquivo para

de novo

montagem e deve ser considerado no cálculo diversidade. Para determinar se a composição da microbiota foi capaz de agrupar as amostras de diagnóstico, um agrupamento hierárquico não supervisionado baseado na dissimilaridade de Bray Curtis entre OTU abundância de cada amostra (S1 Table) foi realizada com pacotes R e plotados como um mapa de calor. Alpha diversidade foi descrito usando uma diversidade filogenética (PD) árvore inteira e cálculo de um índice de diversidade de Shannon (H’) e sua rarefação. A matriz de distância e de componentes principais (PC) foram calculados com UniFrac definir a diversidade beta [46]. Além disso, uma análise coordenada (PCoA) foi representada graficamente com scripts QIIME e visualizados no Imperador [47].

Nós classificados composição da microbiota acordo com o tipo de estado comunidade (CST) com base na taxa predominante encontrado nas amostras. A CST cervical é um conjunto de estados comunitários (composição e abundância de espécies de uma comunidade cervical) que são semelhantes em termos dos tipos e abundância relativa das filotipos observados [48]. O agrupamento de estados da comunidade foi realizada por meio de um agrupamento hierárquico baseado na dissimilaridade de Bray Curtis entre todos os pares de estados comunitários e uma ligação média.

A análise estatística

variáveis ​​relevantes foram comparados entre NCL vs SIL e NCL vs CC, usando

χ

2 e Kruskal-Wallis para variáveis ​​categóricas e contínuas, respectivamente. testes t de Student foram realizados para determinar a diferença média entre o índice de diversidade de Shannon ou a árvore inteira diversidade filogenética e diagnóstico histopatológico. Modelos de regressão logística foram usados ​​para determinar a associação entre o diagnóstico histopatológico eo índice de diversidade de Shannon eo diagnóstico histopatológico (NCL, independentemente do estatuto HPV e SIL /CC) e toda PD árvore, ajustando por idade, paridade, método contraceptivo e HPV-genótipo .

Nós estimamos risco alfa diversidade como uma razão de chances (OR) com intervalo de confiança de 95% (CI). A diferença média estimada de unidades de bits (Shannon índice de diversidade) no colo entre SIL ou CC e NCL, independentemente do estatuto HPV foi avaliada por uma análise de regressão linear de ajuste por idade, método contraceptivo e HPV-genótipo. Foram avaliados a variação das distâncias UniFrac ponderados utilizando um teste de Kruskal-Wallis para verificar a diversidade beta dentro de cada grupo diagnóstico histopatológico. Um teste de Wilcoxon Mann-Whitney foi realizado para avaliar a significância estatística das distâncias UniFrac ponderada entre SIL /CC vs NCL-HPV negativo.

expressão do colo do útero de IL-4, IL-6, IL-10, TGF -β1, TNF-α e ARNm de IFN-γ foi analisada por diagnóstico histopatológico (NCL vs SIL e NCL vs CC) utilizando o teste de Wilcoxon Mann-Whitney. cervical expressão de IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α e IFN-γ ARNm foi analisada em aglomerados CST por meio do teste de Kruskall Wallis. Finalmente, foi realizada análise de correlação directa entre o índice de diversidade Shannon e a expressão do colo do útero da IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α e ARNm de IFN-γ. Realizamos todas as análises estatísticas usando o software estatístico Stata, versão 13.0 (StataCorp, Estação de colagem, TX, EUA).

Resultados

padrão geral das Comunidades cervicais amostrados

após QC, havia 311.863 de alta qualidade lê repartidos de forma desigual através das amostras. Para abordar esta questão, 1000 subamostras aleatórias foram obtidos a partir dos dados brutos de cada amostra, e eles foram utilizados para análise mais bioinformática. curvas Alpha diversidade de rarefação (Fig A em arquivo S1) mostram que, após o cálculo H’in mais de 400 leituras, a diversidade subamostra não aumentou; Portanto, sequências de 1000 tinha profundidade suficiente sequenciação para este estudo. No mapa de calor sem supervisão (Fig 1), a partir de amostras do cluster NCL em conjunto e independentemente do estatuto de HPV, mostrou que as mulheres HPV-negativa tinha uma proporção mais elevada de

Lactobacillus crispatus

(46%) e um menor de

iners Lactobacillus

(14,9%), enquanto as mulheres HPV-positivos tinham proporções de 13,3% e 2,1%, respectivamente. Interessantemente, estas proporções pareceu mudar com a presença do HPV. Além disso,

L

.

crispatus

foi encontrado em menores proporções no SIL (14,4%) e CC (1,3%), enquanto

L

.

iners

caiu para 2,1% em SIL e não foi detectada em CC.

heatmap Unsupervised da abundância relativa de taxa microbiana encontrada nas comunidades microbianas cervicais de 29 indivíduos, com base no Bray Curtis dissimilaridade métrica. As espécies presentes na abundância relativa de 1% em pelo menos uma amostra estão listados no eixo X. A primeira barra no lado esquerdo representa o tratamento como se segue: vermelho-HPV-negativo, sem lesão; blue-HPV-positivos sem lesão; orange-escamosas lesão intraepitelial cervical; cancer verde-cervical. CST estão representadas na segunda Barside esquerda; rosa-CST III, dominada pela

Pseudomonas oleovorans

; cyan-CST II dominada pelo

L

.

iners

; orange-CST I dominada pelo

L

.

crispatus

; verde-CST IV dominada pelo

Sneathia

; blue-CST V dominada pelo

G

.

vaginalis

; yellow-CST VIII dominada pelo

Fusobacterium spp

.; red-CST VI dominada pelo

S

.

agalactiae

, púrpura-CST VII dominada pelo

Fusobacterium necrophorum

. nomes da amostra aparecem no lado direito do gráfico. Os cladogramas no topo dos nomes das espécies indicam as relações evolutivas aproximados entre as espécies. CST: Comunitária Tipo de Estado. Dx:. O diagnóstico histopatológico

Outras espécies de

Lactobacillus

,

L

.

jensenii

e

L

.

vaginalis

foram encontradas somente em amostras de mulheres com NCL.

Gardnerella vaginalis

foi encontrada principalmente em mulheres HPV-negativos com NCL (11,5%), e diminuiu gradualmente entre os HPV-positivo (6,9%), grupos SIL (8,1%) e CC (3,3%).

S

.

agalactiae

representava mais de 90% da composição da microbiota de duas das amostras.

Pseudomonas oleovorans

foi observada em uma abundância relativa de 19% somente entre as mulheres HPV-positivos com NCL. Bactérias do

Fusobacteriales

ordem foram encontrados apenas nos grupos SIL e CC. No grupo SIL,

Fusobacterium spp

. apresentada uma abundância relativa de 6,3%;

Sneathia spp

, 26,6%.;

Shuttleworhia satelles

, 8,7%; e

Megasphaera elsdenii

, 10,4%; Considerando que a abundância relativa dos mesmos microorganismos no grupo CC foi como se segue: 14%, 12,9%, 0% e 2,2%, respectivamente.

Fusobacterium necrophorum

só foi observada no grupo CC (14,2%). Isso aponta para o fato de que a diversidade da microbiota e composição são diferentes entre os grupos analisados. Para confirmar isso, foram analisados ​​alfa e beta diversidade.

As comunidades cervicais foram classificadas em oito OCS acordo com as bactérias dominantes, como mostra a Tabela 2. CST I isdominated pelo

L

.

crispatus

(21%), CST II pelo

L

.

iners

(17%), CST III pelo

Pseudomonas oleovorans

(10%), CST IV por

Sneathia spp

. (17%), CST V pelo

G

.

vaginalis

(7%), CST VI pelo

Streptococcus agalactiae

(7%), CST VII por

F

.

necrophorum

(7%) e CST VIII pelo

Fusobacterium spp

. (14%). Exceto para CST VI, todas as amostras foram agrupados de acordo com o diagnóstico histopatológico. CST I foi composta principalmente de mulheres HPV-negativos com NCL; CST II e III foram predominantemente composto por mulheres HPV-positivos com NCL; CST IV foi predominantemente composta por casos SIL; CST V foi composta principalmente por mulheres com NCL, independentemente do seu estatuto de HPV; CST VIII foi composta predominantemente de casos CC e CST VII incluiu apenas casos de CC (Fig 2).

Gráfico de barras com abundância relativa das espécies por grupo.

comparação da diversidade da microbiota do colo do útero através de estágios CC

diversidade Alpha.

apesar de curvas de rarefação para o índice de Shannon (Fig a em arquivo S1) mostrou uma diversidade maior nos grupos CC e da SIL que entre as mulheres HPV-negativos e -positivas com NCL, descobrimos que a diversidade, por si só, o que representa apenas riqueza e abundância relativa, não é suficiente para determinar a fase de CC developmentof. No entanto, quando se trata de índices que consideram métricas filogenéticas como um todo árvore PD, encontramos uma diferença significativa em relação à diversidade filogenética entre HPV-negativo NCL e SIL e entre HPV-negativo NCL e CC (valores de p: 0,006 e 0,036, respectivamente) (Tabela 3). Em outras palavras, a composição da microbiota do colo do útero é diferente entre os grupos. Os diagramas de caixa na Fig 3 mostram a distribuição do índice de diversidade de Shannon e toda a árvore de PD em todos os grupos diagnóstico histopatológico. O índice de diversidade de Shannon mostra uma tendência crescente, mas não é significativo. toda a árvore PD mostra uma diferença significativa entre NCL HPV-negativo e SIL e entre NCL HPV-negativo e CC. grupos SIL e CC exibir a microbiota do colo do útero mais diversas. Nós não encontrou uma associação entre o diagnóstico histopatológico eo índice de diversidade de Shannon (NCL independentemente do status de HPV e SIL /CC), nem entre a árvore inteira PD eo diagnóstico histopatológico de acordo com a análise de regressão logística (Tabela 4). Ao avaliar a associação entre o índice de diversidade de Shannon para as amostras microbioma cervical e diagnóstico histopatológico, a média estimada diferença de unidades de bits entre CC e NCL foi de 1,11 (95% CI, 0,057-2,165, (p = 0,04) (Tabela 5) . Isto confirma que a diversidade na microbiota CC casos é maior do que no grupo NCL.

os boxplots mostram a distribuição do H ‘(unidades de bit) e valores de PD em todas as amostras.

β-diversidade.

o PCoA resulta consistentemente mostrou que o microbioma cervical é notavelmente diferente em cada fase da história natural da CC (Fig 4A). os três PCs, onde plotados em 2D para comparação aos pares; PC1 foi responsável por 33,44% da variância entre as amostras; PC2 para 26,85% e PC3 para 10,38% a presença de

Fusobacterium spp

,

Sneathia spp

. e

Megasphaera spp

. estava relacionada com PC1. a presença de

Bifidobacteria spp

. e

Pseudomonas spp

. estava relacionada com PC2. a ausência de

Pseudomonas spp

.,

Fusobacterium spp

. ea presença de bactérias do

Bifidobacteriaceae

família estavam relacionadas com PC3, de acordo com a matriz de carga fator calculado (Tabela A em arquivo S1).

A. perfil PCoA do diagnóstico histopatológico exibido com distâncias UniFrac ponderadas. Cada figura representa uma amostra de cor de acordo com o seu diagnóstico histopatológico. círculos vermelhos representam amostras NCL HPV-negativos; quadrados azuis representam amostras NCL HPV-positivos; triângulos laranja representam SIL e triângulos verdes representam CC. A1. componente principal (PC) -1 representaram 33,44% da variação na composição da microbiota, devido à presença de

Sneathia

spp. e

Fusobacterium spp

. A2. PC-2 foram responsáveis ​​por 26,85% da variação inthe composição da microbiota, devido à presença de

Bifidobacteria spp

. e

Pseudomonas spp

. A3. PC-3 foram responsáveis ​​por 10,38% de variação na composição da microbiota, devido à presença de

Lactobacillus spp

. e

Streptococcus spp

. B. B1. Variação das distâncias UniFrac ponderadas dentro de cada grupo diagnóstico histológico. B2.