Sumário

Os biomarcadores que predizem resposta à terapia-alvo em oncologia são um componente essencial da medicina personalizada. Em estudos pré-clínicos de resposta tratamento que contou com modelos de tipo selvagem

KRAS

ou mutante

BRAF

câncer colorretal tratados com cetuximab ou vemurafenib, respectivamente, que mostram que [

18F] -FLT PET, uma leitura de imagem molecular não-invasivo de salvamento de timidina, reflete intimamente respostas pró-sobrevivência a terapia-alvo que são mediadas pela actividade de PI3K-mTOR. A activação de mecanismos de sobrevivência pro-forma a base de numerosos modos de resistência. Portanto, podemos concluir que [

18F] -FLT PET pode servir um romance e papel potencialmente crítico para prever tumores que apresentam características moleculares que tendem a refletir recalcitrância de MAPK-terapia-alvo. Embora estes estudos focados em câncer colorretal, prevemos que os resultados podem ser aplicáveis ​​a outros tumores sólidos, bem

Citation:. McKinley ET, Zhao P, Coffey RJ, Washington MK, Manning HC (2014) 3 ‘ -desoxi-3 ‘- [

18F] -Fluorothymidine PET Imagiologia Reflete PI3K-mTOR-Mediated Pro-Survival resposta a terapia-alvo no cancro colorectal. PLoS ONE 9 (9): e108193. doi: 10.1371 /journal.pone.0108193

editor: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de fevereiro, 2014; Aceito: 24 de agosto de 2014; Publicação: 23 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 McKinley et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento da investigação : R25 CA136440, CA127349 K25, CA128323 P50, P50 CA095103, CA092043 R25, R01 CA140628, CA145138 RC1, R01 CA046413, DK058404 P30, A Fundação Kleberg. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

com o aumento da capacidade de caracterizar de forma rápida e barata a base genética do tumor de um paciente individual, terapias personalizadas estão rapidamente se tornando generalizada em oncologia. exemplos marco do sucesso da medicina personalizada em oncologia incluem o uso de vemurafenib para tratar

V600EBRAF

melanoma [1] e trastuzumab para tratar

HER2

cânceres de mama com superexpressão [2]. Com uma crescente dependência de terapias molecularmente direcionados, permanece um desafio igualmente fundamental para desenvolver e validar biomarcadores específicos que reflectem a inibição alvo, inactivação caminho, e prever a resposta clínica geral. A maioria dos biomarcadores utilizados em estudos de oncologia exigem amostras de tecido que é altamente suscetível a erro de amostragem e viés devido à heterogeneidade. biomarcadores à base de soro não possuem a capacidade de visualizar directamente o tumor e demonstram que o efeito medido é directamente o resultado da resposta do tumor. imagem não invasivo contorna essas limitações e oferece grandes vantagens sobre biomarcadores tradicionais. Das modalidades de imagiologia clinicamente disponível, a sensibilidade e a capacidade de produzir prontamente moléculas biologicamente activos aos quais isótopos emissores de positrões faz com tomografia por emissão de positrões (PET), uma das modalidades mais atraentes para a detecção de tumores e de perfil respostas biológicas a terapia.

o nosso laboratório tem estudado a base biológica de 3′-desoxi-3 ‘[18F] -fluorothymidine ([

18F] -FLT) acumulação nas células tumorais [3] – [6] e outro tecido doente [7]. Um análogo da timidina, [

18F] -FLT foi originalmente desenvolvido para servir como uma medida não-invasiva da proliferação celular, com utilidade óbvia em oncologia [8], [9] através de relatórios sobre a via de salvamento timidina que fornece precursores de ADN para células em divisão. Após internalização celular, [

18F] -FLT é fosforilada numa reacção catalisada pela enzima citosólica timidina-quinase 1 (TK1) e preso na célula. TK1 actividade está estreitamente correlacionada com a síntese de ADN e tende a ser reduzida em células quiescentes. [

18F] -FLT tem sido amplamente estudada como um marcador da resposta ao tratamento em um espectro de tipos de tumor e tratamentos tanto nas configurações pré-clínicos e clínicos [10]. No entanto, é importante observar que, ao contrário dos marcadores de proliferação mais generalizados, tais como a de Ki67, [

18F] -FLT PET reflecte índices proliferativos em graus variáveis ​​e potencialmente pouco fiáveis ​​[6], [11]. [

18F] -FLT-PET não pode discriminar moderadamente proliferativa, timidina tumores-driven de salvamento dos de tumores altamente proliferativas que assentam fundamentalmente na

de novo

síntese de timidina. Apesar da falta de correlação com a proliferação em algumas circunstâncias, nós imaginou que os níveis de TK1, e, portanto, [

18F] -FLT PET, pode refletir outros eventos moleculares potencialmente importantes associados com a resposta à terapia.

Usando pré-clínico modelos de cancro colorectal demonstramos duas circunstâncias em que [

18F] -FLT PET não se correlaciona com a proliferação, mas sim reflete PI3K-mTOR respostas pró-sobrevivência mediada a terapia-alvo. Nesses ambientes, [

18F] -FLT PET foi discordante 2-desoxi-2 – [

18F] fluoro-D-glicose ([

18F]) PET, o marcador mais amplamente utilizado em oncologia clínica, o que não era sensível a mTOR- ou atividade PI3K-via. inibição Cetuximab mediada da atividade MAPK em um tipo selvagem

KRAS

modelo de linha celular e mediada por vemurafenib inibição da BRAF em um

V600EBRAF

mutante modelo de linha de células não teve efeito sobre [

18F] -FLT PET a menos PI3K-mTOR foi posteriormente atenuadas farmacologicamente ou

via

silenciamento genético. No geral, estes estudos demonstram um novo papel para [

18F] -FLT PET como um meio de prever tumores que resistem à inibição MAPK através da ativação PI3K-mTOR em câncer colorretal e potencialmente outros tumores sólidos.

Materiais e métodos

as linhas celulares e modelos de rato

Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê animal Care Institucional e Use da Universidade Vanderbilt e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal. células humanas DiFi foram uma oferta do Dr. Bruce Boman [12] e células COLO 205 foram obtidas de ATCC (CCL-222). DiFi células de cancro colo-rectal humano foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) e células COLO 205 foram cultivadas em meio RPMI (Cellgro) com 10% de soro fetal bovino, (Biologicals Atlanta), 1% de penicilina e estreptomicina (GIBCO) a 37 ° C e 5% de CO

2. C225 foi obtido a partir da Farmácia Vanderbilt, PLX4032 e PLX4720 foram sintetizados como descrito [13], PP242 foi obtido a partir de Sigma Aldrich, e de BEZ235 Selleck Chem. As soluções de reserva de cada droga foram preparadas e aliquotas para atingir concentrações finais de droga para

in vitro

estudos.

Para

in vivo

estudos, xenoenxertos de linhas celulares foram gerados no atímicos nu camundongos (Harlan), como descrito [3] e tratamento começou quando o volume atingiu cerca de 150 mm

3. Para o tratamento de xenoenxertos DiFi, veículo de solução salina, 20 mg /kg, ou 40 mg /kg administrada i.p. cetuximab foram cada terceiro dia. imagiologia de PET de murganhos de xenoenxerto de rolamento DiFi foi realizada 7 dias após o início do tratamento, 24 horas após o terceiro tratamento. Para COLO 205 de xenoenxertos, os murganhos foram tratados com veículo de DMSO, 60 mg /kg PLX4720, ou 40 mg /kg BEZ235 diariamente por gavagem oral (100 mL de volume total). imagiologia de PET de COLO 205 de xenoenxertos de ratinhos portadores foi conduzida 4 dias depois do início do tratamento, aproximadamente 24 horas após o terceiro tratamento. Os ratos foram sacrificados imediatamente após a conclusão da imagem PET.

métodos de siRNA

Raptor (L-004107-00) e sequência aleatória (D-001810-01) reagentes siRNA foram obtidos a partir Thermo Scientific. siARN foi transfectado em células DiFi usando o kit de transfecção DharmaFect (Thermo Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Em suma, 500.000 células DiFi foram plaqueadas em cada poço de uma placa de 6 poços. Após 24 horas, siARN foi adicionado aos poços apropriados. Depois de 48 horas, com veiculo salino, 0,5 ug /mL ou 5,0 ug /ml de C225 foram adicionados aos poços apropriados. Após mais 24 horas, as células foram recolhidas por transferência de Western e qRT-PCR tal como descrito abaixo.

síntese radiofarmacêutico

[

18F] -FLT foi preparado em dois passos, reacção de um só recipiente, tal como descrito [4], [14]. [

18F] -FLT foi obtido com pureza média radioquímica de 98,3% e atividade específica ≥345.5 TBq /mmol. [

18F] foi sintetizado na Universidade Vanderbilt Medical Center Radiofarmácia e distribuído pela PETNET. A pureza média radioquímica do produto foi de 98,5% e atividade específica foi mais do que 37 TBq /mmol.

pequenos animais imagiologia

pequenos animais imagiologia PET foi realizada utilizando um scanner dedicado microPET ( Concorde Microsystems Foco 220). Os ratinhos foram mantidos sob anestesia de isofluorano a 2% em oxigénio a 2 L /min e mantido aquecido circula através de um almofada de aquecimento de água para a duração do PET scan. Para [

18F] animais imagiologia -FLT PET foram administrados 7.4-9.3 MBq (200-250 uCi) por via intravenosa. Os animais tinham livre acesso a alimento e água durante um período de absorção de 40 minutos, seguida de anestesia e uma aquisição de imagem de 20 minutos. Para [

18F] -FDG imagiologia de PET, os ratinhos foram mantidos em jejum durante cerca de 6 h antes da imagem e aqueceu-se num (31 ° C) câmara aquecida durante 1 h antes de [

18F] -FDG injecção e durante o período de captação para minimizar a absorção de gordura marrom de [

18F]. Os ratos foram administrados 7.4-9.3 MBq de [

18F] por via intravenosa e permitiu o acesso livre a água durante um período de absorção de 50 minutos seguido de uma aquisição de PET 10 min.

Os dados PET foram reconstruídos usando OSEM3D /MAPA. As reconstruções tridimensionais resultantes tinham uma dimensão de voxel x-y de 0,474 milímetros e inter-fatia distância de 0,796 mm. software ASIPro (Siemens) foi utilizado para desenhar manualmente regiões tridimensionais de interesse no volume do tumor. amostras de tumor foram imediatamente recolhidos seguinte [

18F] -FLT-PET e flash congelado em nitrogênio líquido. [

18F] -FLT absorção foi quantificada como a percentagem da dose injectada por grama de tecido (% ID /g) é calculada dividindo a actividade ROI por a dose injectada e multiplicando por 100.

para

in vitro

estudos, as células foram lisadas com CelLytic M (Sigma Aldrich), centrifugou-se a 16000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C, e o sobrenadante foi removido antes da medição da concentração de proteína por ácido bicincon�ico (BCA) ensaio (Thermo Scientific). Para

In vivo

estudos, tecido fresco congelado foi homogeneizado em CelLytic MT (Sigma Aldrich) de tampão de lise, centrif usadas a 16.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C, e o sobrenadante foi removido antes da medição da concentração de proteína por BCA ensaio. Antes da resolução por electroforese, 20-40 ug de proteína de cada amostra foi carregada em 7,5-12% de gel SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (PerkinElmer). As membranas foram bloqueadas durante a noite a 4 ° C em solução salina tamponada com Tris 0,1% Tween-20 (TBST) contendo 5% w /v de leite desnatado em pó seco. Posteriormente, as membranas foram interrogados com anticorpos obtidos a partir de Cell Signaling Technology, salvo indicação em p-ERK 1/2 Thr202 /Tyr204 (# 4370), ERK 1/2 (# 4372), TK1 (Abcam, # 57757), p27 (# 3686 ), p-AKT Ser473 (# 4060), p-AKT Thr308 (# 4056), AKT (# 4685), p-rpS6 Ser236 /236 (# 4858), rpS6 (# 2217), p-4EBP1 Thr37 /46 ( # 2855), p-MEK Ser217 /221 (# 9154), MEK (# 9126), DUSP6 (# 3058), β-actina (# 4970), β-tubulina (Novus Biologicals, # NB600-936). As membranas foram sondadas, durante 1 hora à temperatura ambiente, em TBST com albumina de 3% de soro de bovino (BSA). As membranas foram subsequentemente incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Jackson ImmunoResearch) diluído em TBST 1:5000 contendo 3% de BSA. Ocidental relâmpago Plus-ECL (PerkinElmer) foi utilizado para detecção quimioluminescente em um Xenogen IVIS 200.

imuno-histoquímica (IHQ)

Os animais foram sacrificados e amostras de tumor foram recolhidos imediatamente após a imagem PET, posteriormente fixado em formalina a 10% durante 24 horas. Os tecidos foram então transferidos para etanol a 70% antes da inclusão em parafina. Os tecidos foram seccionados (5 um de espessura) e corou-se para p-rpS6 (Cell Signaling, # 4858, diluição primária 1:100), p-AKT Ser473 (Cell Signaling, # 4060, diluição primária 1:100), Ki67 (Dako, # M7240, 1:100 diluição primária), p27 (Dako, # M7203, 1:100 diluição primária). Resumidamente, as amostras de tecido foram de-parafinado, re-hidratados, e a recuperação de antigénio foi realizada utilizando tampão de citrato (pH 6,0) solução durante 15 minutos a 105 ° C, seguido de um banco de 10 minutos arrefecer. As amostras foram, em seguida, tratada com peróxido de hidrogénio a 3%, para eliminar a actividade da peroxidase endógena. Os cortes foram subsequentemente bloqueados com um reagente de bloqueio de proteína livre de soro durante 20 minutos. detecção do anticorpo primário foi realizada utilizando o seguinte sistema: As secções de tecido foram incubadas à temperatura ambiente durante 60 minutos com as diluições observadas seguido por uma incubação de 30 minutos, utilizando o método de detecção Polímero Envision + Sistema-marcado com HRP (Dako, Carpinteria, CA). A coloração foi concluído depois de incubação com uma solução de substrato-cromogénio 3,3′-diaminobenzidina. lâminas de tecido foram fotografadas na ampliação de 40x e manualmente marcados para determinar a percentagem de células positivas por campo de alta potência.

qRT-PCR

RNA foi coletado usando RNeasy como sugerido pelo fornecedor (QIAGEN) . Tanto cDNA e experiências de PCR em tempo real foram realizadas usando kit de síntese de cDNA iScript e iQ SYBR Green Supermix (BIO-RAD) por instrução fornecedor. As amplificações foram realizadas num tempo real do sistema Bio-Rad CFX96 durante 40 ciclos. Os dados foram adquiridos pelo software Bio-Rad CFX Manager e dobre mudanças foram analisados ​​como descrito por Schefe et al [15]. TK1 humana (5′-AATCAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3 ‘para a frente; 5′-ATCACCAGGCACTTGTACTGAGCA-3′ reverso), P27 humana (5’-AGCAATGCGCAGGAATAAGGAAGC-3 ‘para a frente; 5′-TACGTTTGACGTCTTCTGAGGCCA-3’ reverso) foram obtidas a partir de Integrated DNA Technologies.

Análise

estatística

a significância estatística dos dados foi avaliada utilizando o não-paramétrico de Wilcoxon Rank Sum (Mann-Whitney U) testes usando o pacote de software GraphPad Prism 4. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas se p . 0,05

Resultados

Regulamento do TK1, após o bloqueio de EGFR no tipo selvagem

KRAS

células de câncer colorretal

Anteriormente , mostrámos que as leituras de imagem do EGFR e a ocupação de apoptose, mas não [

18F] -FLT PET, a resposta ao cetuximab em xenoenxertos da linha de células que expressam DiFi de tipo selvagem exibem KRAS e amplificação de EGFR [3] previsto, [12] . Portanto, neste estudo, que primeiro procurou elucidar as relações entre o bloqueio EGFR com cetuximab e regulação TK1. Inicialmente, utilizou-se células cultivadas DiFi para avaliar a relação temporal entre a exposição cetuximab e p-ERK, TK1, e os níveis de proteína p27 ao longo de 24 horas (Fig. 1a). Como esperado, os níveis de p-ERK foram quase imediatamente atenuado, que mostra uma redução dramática na primeira hora de exposição cetuximab (5,0 ug /mL), e permanecendo bem abaixo dos níveis de linha de base durante até 24 horas. Paradoxalmente, os níveis de TK1 aumentou após a exposição cetuximab, que atingiu um máximo de 12 horas, e depois diminuiu rapidamente para abaixo dos níveis basais. Os níveis da proteína do p27 inibidor do ciclo celular aumentou drasticamente e estabilizado por 12 horas. A relação inversa entre os níveis TK1 e proteína p27 implicados p27 como um factor determinante da regulação TK1 em células DiFi.

(A) Western blot de lisados ​​celulares DiFi após a exposição cetuximab (5 mg /mL) resultou em atenuação rápida de metas MAPK a jusante, incluindo p-ERK, que permaneceram bem abaixo dos níveis iniciais até 24 horas. Paradoxalmente, os níveis de proteína TK1 aumentou de 1-12 horas até que os níveis de proteína p27 aumentou, momento em que TK1 caiu de linha de base abaixo. células (B) DiFi tratados com 0,5 ug /mL ou 5,0 ug /mL cetuximab resultou numa redução de 50% e atenuação completa dos níveis de proteína p-ERK, respectivamente, às 24 horas. A 0,5 mg /mL níveis TK1 não foram afetados, apesar de um aumento modesto nos níveis de proteína p27. No entanto, 5,0 ug /ml resultou em cetuximab grandemente diminuída TK1 com um grande aumento nos níveis de proteína p27. actividade de PI3K-mTOR, tal como medido por p-AKT Ser473, p-rpS6, e p-4E-BP1, foi mantida ou elevada a 0,5 ug /ml mas o cetuximab foi atenuada em 5,0 ug /mL cetuximab. (C) qRT-PCR análise mostrou

TK1

ARNm foi significativamente reduzida em 0,5 ug /ml (p = 0,0279) e 5,0 ug /ml (p = 0,0186), enquanto nenhuma alteração em

p27

se observou níveis de mRNA em qualquer das doses. (D) Silenciando mTORC1 facilitado regulação positiva de p27 e atenuou os níveis de proteína TK1 a 0,5 mcg /mL cetuximab sem afetar os efeitos da atividade anti-MAPK de cetuximab. Os níveis de p-AKT Ser473, p-rpS6, e p-4E-BP1 foram reduzidos a 0,5 ug exposição cetuximab /mL com rapina knockdown mas não em ARNsi de controlo scrambled. (E) Como prova da funcionalidade do p27,

TK1

níveis de mRNA foram igualmente reduzidas em 0,5 mcg /mL e 5,0 ng /mL com Raptor knockdown.

Para melhor avaliar a relações entre inibição da via de MAPK, regulação TK1, e p27, as células foram expostas a DiFi duas concentrações (0,5 ug /mL e 5,0 ug /ml) de cetuximab durante 24 horas (Fig. 1B). A 0,5 ug /ml, os níveis de proteína TK1 foram afectadas apesar p27 modestamente elevado e uma redução de aproximadamente 50% de p-ERK e p-AKT Ser473. Por outro lado, o nível de 5,0 ug /mL de exposição resultou em níveis dramaticamente TK1 atenuadas. Semelhante ao estudo de curso de tempo, reduziu TK1 correlacionada com um aumento robusto em p27. Adicionalmente, foi observada a atenuação completa da P-ERK e p-ATK Ser473 a 5,0 ug /mL. Em contraste com a proteína,

TK1 ARNm

tendia a seguir os níveis de p-ERK mais directamente (Fig. 1C), o que não é surpreendente, dado

dependência de transcrição E2F [16] ‘s TK1

, um produto a jusante da actividade da MAPK. Curiosamente,

p27

ARNm não foi afectada pela exposição cetuximab, sugerindo que níveis elevados de proteína p27 resultou de inibição de alvos a jusante que afectam a modificação pós-transcricional da p27, com AKT sendo tipicamente um desses [17]. Para determinar se os níveis de proteína TK1 observado a 0,5 ug níveis /ml de exposição foram mantidos através de uma maior eficiência de translação, medimos p-rpS6 e os níveis de p-4E-BP1, ambos os produtos de actividade de PI3K-mTOR pró-translacional (Fig. 1B) . Encontrámos níveis de p-rpS6 ser atenuada apenas com a concentração mais elevada de cetuximab. Além disso, os níveis de p-4E-BP1 foram elevados na concentração mais baixa de cetuximab, sugerindo um aumento do potencial de tradução ribossomal no tampão [18]. Tomados em conjunto com as

TK1

níveis de mRNA, estes resultados podem sugerir que a eficiência de translação da TK1 no nível mais baixo de exposição cetuximab que provavelmente prosseguir através da ativação de mTOR.

Silenciando facilita a atividade da mTOR-PI3K atenuação mediada por cetuximab dos níveis de TK1 em células DiFi

para explorar o papel de mTOR na regulação TK1 neste contexto, nós silenciados mTOR usando siRNA para Raptor, um membro essencial do Complexo mTOR funcional 1 (mTORC1) [ ,,,0],19]. Na ausência de actividade mTORC1, os níveis de proteína TK1 foram atenuadas em ambas /mL e 5,0 ug /ml de concentração de 0,5 ug de cetuximab, sem um efeito óbvio na actividade da via de MAPK (Fig. 1D). Como esperado, rapina silenciamento resultou em maior atenuação mediada por cetuximab de p-AKT Ser473 e p-rpS6 bem como o bloqueio fosforilação de 4E-BP1. Além atenuada níveis de proteína TK1, mTORC1 inactivação resultou em níveis de proteína p27 aumento que pareceram ser pelo menos parcialmente responsável pela

TK1

regulação da transcrição com o menor nível de exposição cetuximab (Fig. 1E). Curiosamente, como observado anteriormente, o aumento dos níveis de proteína p27 era por si só não é um produto de aumento da

p27

transcrição (Fig. S1). Estes resultados sugerem que a activação de mTOR transmite o seu efeito sobre TK1 através de efectores a jusante, tais como AKT e ERK através de modificação pós-translacional e a degradação dos inibidores de ciclo celular, incluindo p27 [17]. Como prova disso, a inibição mTORC1 em conjunto com bloqueio de EGFR levou a uma profunda redução dos níveis de proteína TK1 não observáveis ​​com a exposição cetuximab sozinho na concentração mais baixa.

[

18F] -FLT PET reflete a inibição da atividade PI3K-mTOR em cetuximab tratados DiFi xenoenxertos de linhas celulares

in vivo

a seguir, foi fotografada DiFi xenotransplante de rolamento camundongos com [

18F] -FLT PET após o tratamento com cetuximab (20 mg /kg ou 40 mg /kg) ou veículo salino. De acordo com os nossos estudos anteriores [3], semelhante [

18F] -FLT acumulação foi observado nos xenoenxertos tratados com veículo ou 20 mg /kg cetuximab. Aumentando a dosagem de cetuximab a 40 mg /kg resultou numa diminuição [

18F] -FLT acumulação (Fig. 2A). Os níveis de proteína diminuíram TK1 foram observados no 40 mg /kg de dosagem em relação ao com veículo e tratados com cetuximab tumores de 20 mg /kg (Fig. 2B). Similar ao

in vitro

estudos, os níveis de proteína TK1 diminuiu correlacionados com a proteína p27 elevada, mas não

p27

níveis de mRNA (Fig. S2). Além disso, os níveis de proteína do tumor P-AKT Ser473 aumentaram com a dose de 20 mg /kg em comparação com veículo e 40 mg /kg cetuximab. Os níveis de proteína TK1 não foram afectados pela dose mais baixa de cetuximab, apesar significativamente reduzida

TK1

ARNm (Fig. 2C), a qual foi reduzida relativamente aos controlos tratados com veículo em ambos os níveis de exposição cetuximab. O IHC de tecidos de xenoenxerto de correspondência de imagem ilustrado que a actividade de PI3K-mTOR, tal como medido por P-Akt Ser473 níveis de p-rpS6 e, foi inibida no mais alto de exposição cetuximab (Fig. 2D, a Fig. S3). Curiosamente, Ki67 foi reduzida em ambos os níveis de exposição cetuximab (Fig 2D, Fig. S4), sugerindo que [

18F] -FLT PET foi dissociado do medidas padrão da proliferação na dosagem mais baixa. Enquanto [

18F] -FLT PET parecia ser sensível a actividade PI3K-mTOR, [

18F] imagiologia -FDG PET não foi sensível a este fenómeno. Observamos redução [

18F] absorção em relação aos controlos de veículos em ambos os níveis de exposição cetuximab (Fig. S5). No geral, estes resultados sugerem que [

18F] -FLT PET fornece informações únicas sobre a sinalização mTOR, que não é capturado por [

18F] PET ou medidas padrão de proliferação, tais como Ki67 IHC.

xenoenxertos tumorais DiFi foram fotografadas no dia 7, de 20 mg /kg ou 40 mg /kg de regimes de tratamento com cetuximab. (A) [

18F] -FLT PET só foi reduzida em xenoenxertos DiFi tratados ao nível de 40 mg /kg (p = 0,0012). (B) análise por Western blot de tecidos colhidos imediatamente após imagiologia confirmou que os níveis de proteína TK1 foram apenas diminuiu o nível de dose de 40 mg /kg. Os níveis de proteína p27 aumento foi observado nos 40 mg doses /kg. Os níveis de proteína p-AKT Ser473 aumentados foram observados ao nível da dose de 20 mg /kg. (C) Semelhante ao

In vitro

observações,

TK1

ARNm foi significativamente reduzida em ambos 20 mg /kg (p = 0,0009) e 40 mg /kg (p = 0,0001) Níveis de dosagem. (D) Análise de IHC de p-rpS6 e p-AKT Ser473 apresentaram níveis ligeiramente elevados de coloração a 20 mg /kg. No entanto, ambos os marcadores foram grandemente reduzida a 40 mg /kg. imunorreatividade Ki67 foi reduzida em ambos os níveis de exposição ao cetuximab.

Os níveis de proteína TK1 não refletem

inibição V600EBRAF em células COLO 205

De forma análoga ao modelo DiFi tratados com cetuximab, avaliamos as relações entre a inibição alvo, efectores a jusante, e os níveis de TK1 em um

linha V600EBRAF expressar celular, COLO 205, tratados com uma

inibidor selectivo V600EBRAF (Fig. 3). PLX4032 exposição durante 48 horas levaram a inibição dependente da concentração dos níveis de p-MEK. Paradoxalmente, os níveis de p-ERK foram aumentados numa forma dependente da concentração, excepto na dose mais elevada (5 mM) (Fig. 3A). A incompatibilidade entre p-MEK e p-ERK não foi observado em períodos de exposição de 2 horas (Fig. S6) ou 24 horas (Fig. S7). Embora os níveis de p-AKT Ser473 foram apenas moderadamente reduzida com exposição PLX4032 às 48 horas, observou-se um aumento dependente da concentração em p-rpS6 que correlacionado com o aumento da P-ERK. Concomitantemente aumento p-rpS6 e níveis diminuídos DUSP6 sugerido que o aumento da P-ERK foi pelo menos parcialmente resultou de actividade de fosfatase diminuída que foi provavelmente relacionado com a activação de mTOR [20]. exposição PLX4032 levou a um aumento modesto nos níveis de proteína p27. níveis de TK1 foram aumentou ligeiramente em concentrações mais baixas e PLX4032 inalterada a partir do veículo a níveis mais elevados de exposição, excepto para a concentração mais elevada (5 uM). Surpreendentemente,

TK1

níveis de mRNA apareceu para ser mais estreitamente relacionado com a inibição da p-MEK e, ao contrário dos níveis de proteína TK1, foram reduzidos de uma maneira essencialmente dependente da concentração (Fig. 3B).

COLO 205 células foram recolhidas 48 horas após a exposição ao PLX 4,032 a 10 nM, 100 nM, 500 nM, 1 uM ou 5 uM. (A) análise de Western blot demonstrou inibição alvo de p-MEK apesar aumento dos níveis de p-ERK. sinalização PI3K-mTOR foi elevada de uma maneira 4032-dependente PLX como exibido por um aumento constante nos níveis de p-rpS6. O DUSP6 ERK-fosfatase diminuiu em conjunto com a sinalização de mTOR e era inversamente proporcional aos níveis de p-ERK. Um ligeiro aumento nos níveis de p27 foram observados concomitantemente com apenas mudanças modestas nos níveis de TK1, exceto na maior dose de PLX4032. (B) Diminuição

foram observados TK1

níveis de mRNA em todas as concentrações de droga acima de 10 nM (p 0,05).

[

18F] -FLT PET, mas não [ ,,,0],

18F] PET, reflete a atividade da mTOR elevada e correlaciona-se com a falta de inibição de p-ERK em COLO 205 xenoenxertos tratados com PLX4720

Os ratinhos portadores COLO 205 enxertos foram tratados diariamente com 60 mg /kg PLX4720 para 4 dias e fotografada com [

18F] -FLT PET ou [

18F] PET (Fig. 4). De acordo com

In vitro

estudos que mostram que a inibição de BRAF teve pouco efeito sobre os níveis de TK1 em células COLO 205, o tratamento com PLX4720 teve pouco efeito sobre a [

18F] -FLT imagiologia PET. Por outro lado, [

18F] PET foi significativamente reduzida nos grupos tratados de modo semelhante (Fig. 4B). De acordo com a imagem, os níveis de TK1 de xenoenxertos tratados com PLX4720 foram semelhantes aos controlos tratados com veículo. Também de modo semelhante ao

In vitro

estudos, foram encontrados níveis elevados de P-ERK e os níveis de p-rpS6 PLX4720 em xenoenxertos em relação aos controlos tratados com veículo tratados, apesar da inibição do efector BRAF, p-MEK.

(A) transversal Representante [

18F] -FLT e [

18F] imagens -FDG PET adquiridas após três tratamentos diários com veículo ou 60 mg /kg PLX4720 (tumor indicado pela seta). (B) Quantificação de dados de PET ilustrado semelhante [

18F] captação -FLT em tumores tratados com veículo e tratados com PLX4720. Ao contrário de [

18F] -FLT PET, a exposição PLX4720 provocou uma redução significativa [

18F] absorção (p = 0,0006). (C) análise de transferência de Western de tecido tumoral com veículo e tratados com PLX4720 PLX4720 confirmou que não teve qualquer efeito nos níveis de proteína TK1 de acordo com [

18F] -FLT PET. Alvo de inibição medida pelos níveis de p-MEK foi observada. No entanto, semelhante ao

in vitro

estudos, tratados com PLX4720 COLO 205 enxertos exibiram níveis elevados de p-ERK e proteína p-rpS6 em relação aos controlos de veículos.

Regulamento do TK1 seguinte mTOR ou inibição dupla PI3K-mTOR e

inibição V600EBRAF em células COLO 205

Para examinar o papel de mTOR na regulação TK1 seguinte

inibição V600EBRAF, as células em cultura Colo 205 foram tratados concomitantemente com 250 nM pp242, uma seletiva inibidor mTORC1 /mTORC2 [21] e as concentrações de PLX4032 aumentando para 48 horas (Fig. 5). Adicionando PP242 teve pouco efeito sobre a inibição dependente da PLX4032 de p-MEK, ainda bloqueou eficazmente a activação de p-AKT em Ser473 e embotados a activação observada previamente de p-rpS6 causada pela exposição PLX4032 (comparar com a Fig. 3A). No entanto, o bloqueio de mTOR foi insuficiente para atenuar p-ERK ou os níveis de p-AKT Thr308 de um modo dependente-PLX4032, nem completamente para atenuar os níveis de p-rpS6 (Fig. 5a). Tal como acontece com um único agente

in vitro

estudos, a ativação p-rpS6 correlacionada com uma ligeira atenuação dos níveis DUSP6 e uma ligeira elevação da p-ERK em concentrações mais elevadas PLX4032. No entanto, a inibição combinada de p-AKT Ser473 e p-MEK resultou em drasticamente diminuída TK1, tanto a nível mRNA proteína e. Na presença de p27 elevada,

TK1

níveis de mRNA caiu drasticamente, com reduções significativas observadas em concentrações PLX4032 tão baixas quanto 10 nM (Fig. 5A). Além disso, sugerindo que a actividade de AKT foi responsável pela modificação e degradação de p27 pós-translacional, na presença de inibição de p-AKT Ser473, a proteína p27 foi dramaticamente elevados mas

p27

ARNm não era (Fig. 5C).

(A) Western blot de 205 células COLO tratados com PP242 (250 nM) e aumentando PLX4032. Semelhante ao único agente PLX4032, p-MEK, mas não p-ERK, foi inibida de um modo dependente da PLX4032. Consistente com mTORC1 inibição /mTORC2, p-AKT Ser473, mas não p-AKT Thr308, foi inibida. Ao contrário do único agente PLX4032, o que resultou na activação dependente da concentração de p-rpS6, tratamento mantiveram niveis de p-rpS6 combinadas em níveis de linha de base, essencialmente, excepto para a concentração mais elevada PLX4032. Da mesma forma, os níveis DUSP6 foram inversamente relacionada com os níveis de proteína p-ERK. Com mTOR combinados e

bloqueio V600EBRAF, p27 e proteína TK1 níveis foram inversamente correlacionados e dramaticamente afetada pela exposição PLX4032. (B) Similarmente,

TK1

ARNm foi significativamente reduzida em concentrações tão baixas como PLX4032 10 nM. (C) Apesar de os níveis de proteína p27 elevadas,

p27

mRNA não foi afetado pela inibição mTOR-

V600EBRAF combinados.

Uma vez que

inibição V600EBRAF-mTOR combinado foi insuficiente para atenuar p-rpS6, e juntamente com a observação de que a actividade de PI3K e a sinalização a jusante tem sido proposta como um mecanismo de resistência à inibição BRAF no cancro colorrectal [22] e melanoma [23], [24], avaliou-se os efeitos de duplo inibição de PI3K-mTOR em 205 células COLO em conjunto com

V600EBRAF inibição (Fig. 6). As células COLO 205 foram tratados com PLX4032, BEZ235, uma pequena molécula duplo inibidor de PI3K e mTOR [25], ou a combinação durante 24 horas. Com efeito, inibindo a actividade da mTOR, tal como medido por p-AKT Ser473, e a actividade de PI3K, tal como medido por p-AKT Thr308, na presença de PLX4032 resultou em maiores níveis de proteína p27 e uma diminuição dos níveis de proteína TK1. Estes resultados levaram nossa avaliação desta combinação

in vivo

.

Agente único PLX4032 resultou em ativação de p-AKT Ser473 após 24 horas de exposição em duas concentrações (100 nm, 1 m).