Humana

Abstract

A heparanase (HPA), uma endo-HD-glucuronidase que cliva a cadeia de heparan sulfato de heparan proteoglicanos de sulfato, é abundante na maioria dos cancros humanos. Evidências recentes sugerem que os pequenos ARN interferente (siRNA) induz o silenciamento do gene da transcrição (TGS) em células humanas. Neste estudo, a transfecção de siRNA contra -9 /+ 10 pb (siH3), mas não -174 /-155 pb (siH1) ou -134 /-115 pb (siH2) região em relação ao local de início da transcrição (TSS) localizando na 101 pb a montante do local de início da tradução, resultou em TGS de heparanase no cancro humano da próstata, cancro da bexiga, e cancro gástrico células de um modo específico da sequência. PCR específicos de metilação e sequenciação bissulfito não revelaram a metilação do DNA de ilhas de CpG dentro de heparanase promotor em células siH3-transfectadas. A TGS de heparanase não implicam alterações de epigenética marcadores histona H3 lisina 9 dimetilação (H3K9me2), histona H3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3) ou H3 marcador acetilação das histonas da cromatina ativa (AcH3). A regulação do splicing alternativo não estava envolvido na TGS siH3 mediada. Em vez disso, siH3 interferiu com a iniciação da transcrição através diminuindo a ligação de RNA polimerase II e factor de transcrição B II (TFIIB), mas não a ligação de factores de transcrição Sp1 ou crescimento precoce de resposta de 1, no promotor de heparanase. Além disso, Argonaute 1 e 2 Argonaute facilitou a diminuição da ligação da RNA polimerase II e TFIIB no promotor de heparanase, e eram necessárias TGS-induzida siH3 de heparanase. transfecção estável da construção RNA hairpin curto segmentação heparanase TSS (-9 /+ 10 pb) em células cancerosas, resultou em diminuição da proliferação, invasão, metástase e angiogénese de células cancerosas

in vitro e em modelos

ratos atímicos. Estes resultados sugerem que pequenos RNAs de segmentação TSS pode induzir TGS de heparanase através de interferência com a iniciação da transcrição, e suprimir significativamente o crescimento do tumor, invasão, angiogénese e metástases de células cancerosas

citação:. Jiang L, Zheng L, Pu J, H Mei, Zhao J, K Huang, et ai. (2012) RNAs Pequenos Segmentação Transcrição Iniciar site Induzir Heparanase silenciamento através da interferência com a transcrição Iniciação em células cancerosas humanas. PLoS ONE 7 (2): e31379. doi: 10.1371 /journal.pone.0031379

editor: Sebastien Pfeffer, Centro Nacional Francês de Pesquisa Científica – Institut de Biologie moléculaire et cellulaire, França |

Recebido: 23 de maio de 2011; Aceito: 06 de janeiro de 2012; Publicação: 20 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 30.200.284, No. 30.600.278, No. 30.772.359, No. 30.972.980, No. 81.071.997, No. 81.072.073), Programa de New Century excelentes talentos em University (NCET-06-0641) , Fundação de Pesquisa Científica para os Retornados ultramarinos estudiosos chineses (2008-889) e fundos de pesquisa fundamental para a Universidades Central (2010JC025). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

heparanase é uma endo-HD-glucuronidase que tem a capacidade para clivar a cadeia de sulfato de heparano de proteoglicanos de sulfato de heparano [1], e facilita a invasão e metástases de células tumorais por deterioração da membrana basal (BM) e barreiras da matriz extracelular [2]. Heparanase também contribui para a angiogénese através da libertação e activação de vários factores de crescimento de ligação de sulfato de heparano-[3], [4]. Além disso, a alta expressão de heparanase é frequentemente observada em um número crescente de tumores humanos primários, como câncer de próstata, câncer de bexiga e câncer gástrico, ea invasão facilitada por heparanase e metástase induzir maus resultados em pacientes com câncer [5] – [8] . Estes estudos sugerem que heparanase pode ser servido como um alvo molecular para a terapia do cancro.

O silenciamento da expressão gênica usando pequeno RNA de interferência (siRNA) representa uma estratégia potencial para o desenvolvimento de produtos terapêuticos [9]. Em adição ao silenciamento pós-transcricional de genes numa vasta variedade de organismos, siARN pode interagir com 3A ADN metiltransferase (DNMT3A) e transcricional directo silenciamento do gene (TGS) em células humanas [10]. siRNAs-alvejado promotor induzir a ilha metilação CpG do gene da ubiquitina C [11], da imunodeficiência humana tipo 1 do vírus terminal longa de repetição [12], Ras família domínio associação 1A [13], e interleucina-2 [14] em células humanas. Além disso, os siRNAs exógenos desencadear TGS em células humanas através da formação de heterocromatina no promotor alvo, que envolve o recrutamento de trimethylation enzimas para resultar em dimetilação da histona H3 em lisina 9, modificadores de cromatina de histona H3 na lisina 27, e histona desacetilação [10], [11], [12]. Além disso, os siRNAs segmentação sequências intrónicas ou ex�icas perto de um exão alternativo pode aumentar a dimetilação da histona H3 em lisina e 9 trimethylation de histona H3 na lisina 27 no local alvo, resultando em processamento diferencial do referido exão [15]. Estes estudos sugerem que os siRNAs afectar não só a transcrição, mas também splicing processo do gene alvo, o que implica uma abordagem viável para desenvolver agentes terapêuticos específicos para o gene.

sítios de início da transcrição (SST) são interruptores essencial para converter o reconhecimento de DNA em genoma síntese ativa de cópias de RNA [16]. Vlodavsky

et al

. identificado no TSS do gene de heparanase de nucleótidos na posição 99 pb a montante do local de início da tradução (ATG) de uma amplificação rápida tradicional ensaio de extremidades (RACE) de ADNc [17]. Ao utilizar o método de RLM-RACE modificado para amplificar selectivamente o fragmento de ADN a partir de ARNm de comprimento completo tampado, Jiang

et ai. relataram o TSS exacta a 101 pb a montante do ATG [18]. Alternativa maior transcrição de heparanase também foi observado no sistema imune humano, no entanto, a localização exacta e promotor a montante da sua TSS permanecem em grande parte desconhecida [19] – [21]. No estudo actual, que mostrou que pequenos RNAs de segmentação de heparanase TSS localizar a 101 pb a montante do local de início da tradução [18], incluindo siRNA e ARN curto hairpin (shRNA), induzida TGS de heparanase através de interferir com a iniciação da transcrição, mas não através induzindo a formação de heterocromatina ou mudanças epigenéticas, e atenuou a proliferação, invasão, metástase e angiogénese de diferentes tipos de células cancerosas

in vitro Comprar e

in vivo

.

resultados

TGS de heparanase

Para examinar se siRNA poderia induzir TGS de heparanase induzida por siRNA, nós projetamos e sintetizados três siRNAs segmentação TSS (localizando em 101 pb a montante do ATG) ou em regiões mais a montante de heparanase promotor, -174 /-155 (siH1), -134 /-115 (siH2), e -9 /+ 10 pb (siH3) (Fig. 1A e Fig. S1). O siRNA alvo a região que codifica + 1496 /+ 1515 pb (SiH4) foi aplicado como um controlo (Fig. 1A). linhas de células de cancro humanas mais comuns, incluindo o cancro da próstata (PC-3), cancro da bexiga (EJ) e câncer gástrico (SGC-7901), foram escolhidos como modelos para o estudo. A transfecção de siH3 e SiH4, mas não da siH1, siH2 ou ARNsi de controlo negativo (SINC), atenuou a expressão de heparanase em PC-3, e células EJ SGC-7901 (Fig. 1B). Além disso, a transfecção de siH3, mas não de Sinc ou mexidos siRNA (siSCb), aboliu os níveis de transcrição e tradução de heparanase de um modo dependente da dose (Fig. 1C). O silenciamento induzido siH3 de heparanase durou até 5 dias, e parcialmente recuperada no dia 7 (Fig. 1D). A transfecção de siM31 e siM32, dois siRNAs incompatíveis do siH3, não suprimir a expressão de heparanase (Fig. 1E), demonstrando que a interferência foi executado por siH3 de um modo dependente da sequência. A falha de siM32 para inibir a transcrição também indicou que a complementaridade parcial com a 5′-terminal do ARNm não era suficiente para o silenciamento de heparanase (Fig. 1E). ADN duplexes análogo ao siH3 não inibiu a expressão, indicando que o reconhecimento deve ser mediada por ARN (Fig. 1E). ensaio de repórter de luciferase promotor mostrou que a transfecção de siH3, mas não siScb, siM31 ou siM32, suprimiu a actividade do promotor da heparanase e a transcrição (Fig. 1F), sugerindo que a expressão reduzida de heparanase foi devido à inibição da transcrição por siH3. Além disso, a expressão de genes não jusante de heparanase, proliferação de antigénio nuclear celular (PCNA) e ciclina D1, não foi afectada por transfecção de siH3 (Fig. S2). Estes resultados indicaram que siH3 selectivamente o TSS e induzida TGS de heparanase de uma maneira específica da sequência em células cancerosas humanas.

Um esquema de segmentação de siRNAs TSS (situando-se 101 pb a montante do local de início da tradução) , promotor e que codifica regiões a montante de heparanase, incluindo siH1 (-174 /-155 pb), siH2 (-134 /-115 pb), siH3 (-9 /+ 10 pb) e SiH4 (+ 1496 /+ 1515 pb). nucleotídicas automatizado pesquisas de base da ferramenta de busca de alinhamento local (BLAST) demonstraram que não houve sequência semelhante à siH1, siH2, ou siH3 na sequência transcrita de heparanase. B, 72 horas após a transfecção de siRNAs para PC-3, e células EJ SGC-7901, 100 nmol /L ou siH3 SiH4, mas não da siH1, siH2 ou sinc, atenuou a expressão de heparanase nas células cancerosas. C, 72 h pós-transfecção de siH3, mas não de Sinc ou siScb, resultou na expressão de heparanase abolida de células cancerosas de uma maneira dependente da dose. D, siH3 (100 nmol /L) silenciamento de genes induzida de heparanase em células cancerosas durou até 5 dias, e parcialmente restaurado no dia 7. E, 72 horas pós-transfecção de 100 nmol /L DNA duplexes análogo ao siH3, siM31 ou siM32 (dois siRNAs incompatíveis de siH3), não aboliu a expressão heparanase em células cancerosas. F, ensaio de repórter de luciferase dupla indicou que 72 horas pós-transfecção de siH3, mas não de siScb, siM31 ou siM32, suprimiu a actividade de heparanase e promotor de transcrição em células de cancro. Os símbolos (# e ô) indicam uma diminuição significativa do controlo não transfectadas (simulada) e um aumento significativo de pGL3 /Basic, respectivamente.

inibição induzida por siRNA de iniciação da transcrição de heparanase

Desde TGS está associada a mudanças epigenéticas do promotor, como a metilação do DNA, a metilação de histonas, e histona deacetylation [10], [11], [12], analisamos primeiro o estado epigenético das regiões a montante de promotor heparanase. As ilhas CpG não metilado eram em PC-3 transfectadas, células EJ e SGC-7901 (simulados) e aqueles em transfectadas com sinc (dados não mostrados). A transfecção de siH1, siH2 ou siH3, não induzir a metilação de ilhas CpG do promotor de heparanase em células de cancro (Fig. 2A e Fig. 2B). A expressão e DNA ligação de histona H3 lisina 9 dimetilação (H3K9me2) e histona H3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3) no promotor heparanase, duas marcas epigenéticas repressivos envolvidos na TGS [10], não se alterou após a transfecção de siH2, siH3, SiH4 ou siScb (Fig. S3 e a Fig. 2C). Além disso, a ligação de histona H3 acetilada (AcH3), um marcador de cromatina transcricionalmente activo [22], não foi afectada por transfecção com estes siRNAs (Fig. 2C). Enquanto isso, não houve produtos de PCR para “não-anticorpo” controlo na cromatina imunoprecipitação ensaio (ChIP) (Fig. 2C). A ligação de H3K9me2 e H3K27me3 foi enriquecida no promotor de p16 genes transcricionalmente silenciados e ácido retinóico receptor beta 2 (RARβ2) [23], quando comparada com a de promotor de heparanase em células PC-3 (Fig. 2D), e a ligação de AcH3 no promotor de heparanase aumentaram significativamente após as histona-desacetilases (HDAC) pan inibidor tricostatina a tratamento (TSA) (Fig. 2E), o que confirma a adequabilidade das condições de ensaio de chip. Além disso, o tratamento de células cancerosas com o DNMT inibidor de 5-aza-2′-desoxicitidina (5-Aza-CdR) ou TSA não afectou o silenciamento de heparanase, indicando que as HDACs DNMTs e não eram susceptíveis de ser associados a este processo (fig. 2F). Além disso, o ensaio ChIP não revelou alterações na ligação de fatores de transcrição de resposta de crescimento precoce 1 (EGR1) e SP1 em região promotora heparanase em torno do local siH3-alvo, descartando seus papéis potenciais na TGS-induzida siH3 de heparanase (Fig. 2G). No entanto, a diminuição da ligação da RNA polimerase II (pol II de ARN) no promotor de heparanase foi observado em células transfectadas-siH3, mas não em siH2-, siH4- ou células siScb-transfectadas (Fig. 2H). Além disso, a ligação do factor de transcrição B II (TFIIB) que dirige a ARN Pol II do promotor nuclear, também foi diminuída em células siH3-transfectadas (Fig. 2H). dados de chip no ARN Pol II ou TFIIB ligação foram confirmadas por PCR em tempo real quantitativa (qPCR) com iniciadores que abrangem o TSS (Fig. 2H). Diminuiu ARN Pol II ou TFIIB ligação foi visto até 7 dias após a transfecção (fig. 2i). Além disso, a proporção relativa de inclusão e de exclusão do primeiro exão de heparanase, que era um exão alternativo perto do local siH3-alvo, não se alterou após a transfecção de siH2, siH3, SiH4 ou siScb em células de cancro (Fig. 2J ), sugerindo que a regulação do splicing alternativo não estava envolvido na TGS siH3 mediada. Estes resultados demonstraram que a iniciação de transcrição de heparanase foi interferida pela segmentação siH3 TSS.

A e B, e sequenciação de bissulfito MSP revelou que a transfecção de ARNsi (100 nmol /L), siH1, siH2 e siH3, não fez induzir a metilação de ilhas CpG do promotor da heparanase nas células cancerosas. C, 72 horas pós-transfecção, chip com conjuntos de iniciadores distintas indicou que não havia produtos de PCR para (n Ab) de controlo “não-anticorpo”, e a ligação de H3K9me2, H3K27me3 e AcH3 no promotor de heparanase não se alterou após a transfecção de siH2, siH3, SiH4 ou siScb em células cancerosas. D, a ligação de H3K9me2 e H3K27me3 foi enriquecida no promotor de p16 e RARβ2 comparado com o promotor de heparanase em células PC-3, respectivamente. E, o tratamento de células cancerosas ou siH3- siScb-transfectadas com TSA (200 nmol /L), resultou num aumento significativo na ligação de AcH3 no promotor de heparanase, quando comparados com os tratados com DMSO controlo do solvente. F, as células cancerosas foram transfectadas com ARNsi e tratados com 5-Aza-CdR (5 umol /L) ou TSA (200 nmol /L), resultando em nenhuma alteração em silenciamento de heparanase-induzida siH3. G, 72 horas após a transfecção, ChIP ensaio indicaram que a ligação de Sp1 e EGR1 no promotor de heparanase, não se alterou após a transfecção de siH2, siH3, SiH4 ou siScb em células cancerosas. H, ensaio de chip com conjuntos de iniciadores distintos indicou a diminuição da ligação de ARN Pol II e TFIIB no promotor da heparanase nas células cancerosas siH3-transf ectadas, mas não em células ou siH2- SiH4-transfectadas. I, Ensaio ChIP indicou que a diminuição do ARN Pol II ou TFIIB ligação foi observada de forma reprodutível e até 7 dias pós-transfecção de siH3 em células cancerosas. J, detecção de qRT-PCR demonstrou que a proporção relativa inclusão-a-exclusão do primeiro exão de heparanase não se alterou após a transfecção de siH2, siH3, SiH4 ou siScb em células cancerosas. O símbolo (#) indica uma diminuição significativa do controlo não transfectadas (simulada) ou siScb. O símbolo (▴) indica um aumento significativo do vincula promotor heparanase. O símbolo (Δ) indica um aumento significativo do controle DMSO.

Envolvimento de ago1 e ago2 na inibição da transcrição induzida siH3 de heparanase

Uma vez que estudos anteriores indicaram o envolvimento de interferência RNA (RNAi) máquinas na TGS, exploramos ainda mais a influência de Argonaute 1 (ago1) e Argonaute 2 (ago2), dois componentes integrais da via RNAi [24], [25], na TGS-induzida siH3 de heparanase. Como mostrado na Fig. 3A e a fig. 3B, derrubando de ago1 ou ago2 suprimiu a TGS-induzida siH3 de heparanase. Além disso, a transfecção de siH3, mas não da siScb, aumentou a associação de ago1 ago2 e no promotor de heparanase, que foi abolido por respectivamente derrubar de ago1 e ago2 (Fig. 3C e Fig. 3D). Além disso, ago1 ou ago2 silenciamento aumentou a ligação de RNA Pol II e TFIIB on promotor heparanase, enquanto transfecção de sinc não tem qualquer efeito (Fig. 3E). run-on nuclear ensaio demonstrou ainda que o mRNA transcrito a montante (contendo o exão 1) apresentada a um nível baixo comparado com o ARNm total de heparanase, e transfecção de siH3 atenuou a transcrição nascente de ARNm total de heparanase, mas não do ARNm iniciado a partir alternativa a montante do TSS , que também foi restaurado batendo para baixo de ago1 ou ago2, indicando que a expressão de heparanase foi reduzida devido à inibição da transcrição iniciada a partir do TSS a jusante (Fig. 3F). Estes resultados indicaram que ago1 e ago2 eram necessárias para a inibição da transcrição induzida siH3 de heparanase em células cancerosas humanas.

A e B, derrubando de ago1 ou ago2 restaurou a TGS-induzida siH3 de heparanase em células cancerosas, respectivamente. C e D, ensaio ChIP indicou que 72 horas após a transfecção de siH3, mas não de siScb, a associação de ago1 e ago2 no promotor heparanase aumentou em células cancerosas, que foi abolido pelo derrubando de ago1 e ago2, respectivamente. E, ChIP ensaio indicou que o silenciamento de ago1 ou ago2 restaurou a ligação do ARN Pol II e TFIIB no promotor da heparanase nas células cancerosas. F, Run-em ensaio nuclear indicou que o mRNA transcrito a montante (contendo o exão 1) apresentada a um nível baixo comparado com o ARNm total de heparanase, e a transcrição nascente de ARNm total de heparanase, mas não do ARNm iniciado a partir alternativa a montante do TSS, diminuiu depois transfecção de siH3 em células cancerosas para 72 horas, que foi restaurado por derrubar de ago1 ou ago2. Os símbolos (# e ô) indicam uma diminuição significativa e um aumento significativo de siScb, respectivamente. O símbolo (*) indica uma diminuição significativa da Sinc.

RNAi máquinas interagiu indiretamente com complexo de pré-iniciação de transcrição na TGS-induzida siH3 de heparanase

Uma vez que a evidência recente mostra uma interação complexa entre a maquinaria RNAi e RNA Pol II no silenciamento heterocromática em

Drosophila

[26], nós supomos que ago1 ou ago2 pode interagir diretamente com RNA Pol II ou TFIIB para participar na TGS-induzida siH3 de heparanase. Consistente com estudos anteriores [27], [28], análise de co-imunoprecipitação indicou que ARN Pol II interagiu com TFIIB em células em cultura. A transfecção de siH3 não atenuam a interacção entre ARN Pol II e TFIIB (Fig. 4A). No entanto, anticorpos anti-ARN Pol II ou anti-TFIIB fez não co-immunoprecipite ago1 ou ago2 a partir de células siH3-transfectadas (Fig. 4A), o qual foi ainda evidenciada por análise de co-imunoprecipitação com suspenso por anti-ago1 ou anti -Ago2 anticorpos (Fig. 4B). Combinando com os factos acima referidos que ago1 e ago2 influenciado a ligação de ARN Pol II e TFIIB no promotor de heparanase, estes resultados indicam que a RNAi máquinas e de pré-iniciação da transcrição complexo foram associados, mas não directamente interactiva, em siH3 induzida TGS de heparanase nas células cancerosas humanas .

a, análise de co-imunoprecipitação com suspenso por anti-ARN Pol II ou anticorpos anti-TFIIB indicou que siH3 ou siScb não atenuam a interacção entre ARN Pol II e TFIIB em células cancerosas. Além disso, ago1 ou ago2 não interagir diretamente com qualquer RNA Pol II ou TFIIB em siScb- e células cancerosas siH3-transfectadas. B, análise de co-imunoprecipitação com pull-down por anti-ago1 ou anticorpos anti-ago2 não co-immunoprecipite RNA Pol II ou TFIIB de siScb- e células cancerosas siH3-transfectadas.

Heparanase TSS -targeted shRNA atenuou a proliferação, adesão, invasão e angiogênese do câncer de células

in vitro

Uma vez que estudos recentes indicam a viabilidade da TGS shRNA mediada em células de mamíferos [29], [30] , a fim de investigar adicionalmente os efeitos do siARN de heparanase TSS-alvo sobre as células cancerosas, as construções shRNA foram estabelecidos e transfectado para PC-3, as células EJ e SGC-7901 (Fig. S4A). Transfecção estável de SHP3 (-9 /+ 10 pb) e SHCD (+ 1496 /+ 1515 pb), mas não de SHP2 (-134 /-115 pb) ou mexidos shRNA (shScb), resultou em níveis de ARNm e proteína de atenuadas heparanase (Fig. S4B, e a Fig. S4C), e diminuiu

in vitro

proliferação de células de cancro (Fig. 5A, Fig. 5B e Fig. 5C). Transwell análise mostrou que as células transfectadas com SHP3 ou SHCD, mas não com SHP2 ou shScb, apresentou uma capacidade de invasão diminuída (Fig. 5D e a Fig. 5E). Além disso, as células cancerosas ou transfectadas com SHP3 SHCD, mas não com SHP2 ou shScb, exibiram acentuadamente reduzidas capacidades na adesão ao pré-revestido com matrigel (Fig. 5F). A formação do tubo de células endoteliais foi inibido pelo tratamento com a forma pré-condicionado por transfecção estável de células cancerosas com SHP3 ou SHCD, mas não com shScb (Fig. 5G e a Fig. 5H). Além disso, a libertação do factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) a partir de células de cancro foi atenuada após a transfecção estável de SHP3 ou SHCD, mas não da shScb (Fig. 5I). Estes resultados indicaram que a transfecção estável de shRNA heparanase TSS-alvo diminuiu consideravelmente a proliferação, adesão, invasão e angiogênese do câncer de células

in vitro

.

A, MTT colorimetria indicou que a transfecção estável de SHP3 ou SHCD, mas não da SHP2 ou shScb, atenuou a proliferação de células, EJ e SGC-7901 PC-3. B e C, o ensaio de formação de colónias indicou que a transfecção de SHP3 e SHCD, mas não da Shp2 ou shScb, atenuou a

in vitro

proliferação de células, EJ e SGC-7901 PC-3. D e E, Transwell análise indicou que as células PC, 3-EJ e SGC-7901 transfectadas com SHP3 ou SHCD, mas não com SHP2 ou shScb, possuía uma capacidade de invasão prejudicada. F, no ensaio de adesão, PC-3, as células EJ e SGC-7901 transfectadas com SHP3 ou SHCD, mas não com SHP2 ou shScb, exibiram acentuadamente reduzida capacidade de adesão ao pré-revestido com matrigel. G e H, as células endoteliais foram tratadas com a forma pré-condicionado por transfecção estável de PC-3, e células EJ SGC-7901 com SHP3 ou SHCD, mas não com shScb, resultando na formação do tubo suprimida em matrigel. I, a libertação de bFGF de PC-3, e células EJ SGC-7901 foi atenuada após transfecção de SHP3 ou SHCD, mas não da shScb. O símbolo (#) indica uma diminuição significativa a partir de células transfectadas com vector vazio (simulada).

Heparanase TSS-alvo shRNA inibiu o crescimento, metástase e angiogénese de células cancerosas

in vivo

a seguir, investigou a eficácia da SHP3 contra o crescimento tumoral, metástase e angiogênese

in vivo

. Transfecção estável de SHP3 ou SHCD em células PC-3, resultou na diminuição do crescimento e o peso de tumores de xenoenxertos subcutâneos em ratinhos nus atímicos (Fig. 6A). Além disso, a transfecção estável de SHP3 ou SHCD resultou em diminuição da microvasos CD31-positivo e significa densidade de vasos no interior dos tumores (Fig. 6B). Além disso, a expressão de genes de heparanase jusante dentro dos tumores, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e metalopeptidase de matriz 9 (MMP-9), foi também reduzida por transfecção estável de SHP3 ou SHCD (Fig. 6C e Fig. 6D).

A, injeção hipodérmica de PC-3 células em ratinhos nus atímicos estabelecida tumores de xenoenxerto subcutâneo. Um mês mais tarde, os ratinhos (n = 6) a partir de cada grupo foram sacrificados. Transfecção estável de células cancerosas com SHP3 ou SHCD resultou numa diminuição do tamanho do tumor, e o peso médio do tumor formado a partir de células ou shP3- SHCD-transfectadas foi significativamente diminuída. B, expressão CD31 ea densidade de vasos média dentro dos tumores diminuiu após transfecção estável de SHP3 ou SHCD. C, ele e coloração imuno-histoquímica revelou que a transfecção estável de SHP3 ou SHCD resultou na diminuição da expressão de heparanase, VEGF e MMP-9 dentro dos tumores. D, a expressão de genes a jusante da heparanase dentro de tumores, o VEGF e MMP-9, foi reduzida pela transfecção estável de SHP3 ou SHCD. E, 3 × 10

6 células PC-3 foram injectadas na cavidade peritoneal de 2 meses de idade, ratinhos nus macho (n = 5 para cada grupo). ratinhos nus que receberam injeção de células cancerosas estavelmente transfectadas com SHCD ou SHP3 mostraram comparativamente menos nódulos. F, PC-3 foram injectados na veia da cauda de ratinhos nus atímicos (0,4 × 10

6 células por ratinho, n = 5 para cada grupo). As células cancerosas estavelmente transfectadas com SHP3 ou SHCD estabelecida significativamente menos colónias metastáticas. O símbolo (#) indica uma diminuição significativa do vector vazio (simulada).

Nos estudos de metástase peritoneal, ratinhos nus que receberam injeção de células PC-3 transfectadas estavelmente com SHCD ou SHP3 mostraram comparativamente menos nódulos (22 ± 9 e 17 ± 7, respectivamente) do que vazio vector grupo (simulada) (106 ± 31) (Fig. 6E). Nos estudos de metástases experimentais, as células PC-3 transfectadas de forma estável com SHP3 ou SHCD estabelecida estatisticamente menos colónias metastáticas pulmão do grupo simulada (Fig. 6F). Combinados com os resultados semelhantes em células EJ e SGC-7901 (dados não mostrados), estes resultados sugerem que a heparanase TSS-alvo shRNA poderia inibir o crescimento, metástase e angiogénese de células de cancro in

in vivo

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Discussão

a via TGS foi inicialmente relatado em plantas de tabaco, como o estado de metilação e expressão de genes foram demonstrados para ser afetada por RNAs [31]. Recentemente, RNAs foram relatados para mediar TGS em células de mamífero através de CpG ADN a metilação e heterocromatina formação [10], [11], [12], [32]. As modificações epigenéticas em silêncio estatais causar a perda de fatores de transcrição de recrutamento [12], [33]. Enquanto isso, siRNAs segmentação regiões de genes internos de fibronectina humana 1 pode inibir alongamento interno e, posteriormente, afetar a escolha do local de união [15]. O promotor de heparanase humana é constituída por uma região básica mínima que se estende proximalmente 300-700 pb no TSS localizar a 101 pb a montante de ATG, o qual é caracterizado pelo conteúdo elevado de GC, observado /esperado proporção de CpG, e os locais de ligação para vários grupos dos fatores de transcrição [18]. factor de transcrição EGR1 está relacionada com a transcrição indutível do gene da heparanase nas células T [34], enquanto que o factor de transcrição Sp1 ubíqua está associada com a sua transcrição basal [18]. No presente estudo, nós concebemos três siRNAs segmentação região promotora de heparanase contendo CpG loci e sítio de ligação SP1, enquanto a região siH3-alvo (-9 /+ 10 pb em torno da heparanase TSS localizar a 101 pb a montante de ATG) foi também adjacente ao local de EGR1 vinculativo. No entanto, nossa evidência mostrou que a transfecção destes siRNAs induzida nem metilação de CpG nem formação de heterocromatina no promotor heparanase. análise ChIP ainda descartou as mudanças na ligação do SP1 e EGR1 on promotor heparanase, e análise variante de processamento descartou a splicing diferencial do exão mais próximo.

Na verdade, siRNAs regiões promotoras alvo deixar de induzir a TGS no determinada instância [35]. Estudos recentes mostram que antigène RNAs (agRNAs) visando o TSS pode bloquear a transcrição do gene do receptor de progesterona humano (PR) [36], [37], receptor de andrógeno (AR) [37], e huntingtina [37], sugerindo que a TSS em ADN cromossómico fornece alvos previsíveis para a inibição da expressão do gene com RNAs. No presente estudo, foi demonstrado que ARNsi e shRNA segmentação do TSS induzida TGS de heparanase nas células cancerosas humanas, enquanto que os pequenos RNAs alvo a região promotora a montante contendo CpG loci não suprimiu a expressão de heparanase, sugerindo que os loci que alvo poder não ser susceptíveis a TGS. Além disso, nós também observou as eficiências semelhantes de siH3 e codificação região-alvo SiH4 em atenuar a expressão ea função da heparanase. Estes resultados indicam o valioso papel de pequenos RNAs TSS-alvo na regulação da expressão gênica por TGS, especialmente quando os RNAs alvo região promotora a montante não conseguem produzir um efeito marcante.

Um mecanismo ao invés de regulação genética e epigenética sublinha a TGS de heparanase induzida por siRNA TSS-alvo de células cancerosas humanas. Da mesma forma, não se observa a metilação em torno do TSS de AR e PR [34], e agRNAs mediada TGS ocorre independentemente de se o promotor contem uma caixa TATÁ [36], [37]. Estudos anteriores indicam que o ADN se liga TFIIB promotor-núcleo e dirige ARN Pol II do TSS, promovendo a montagem do complexo de pré-iniciação da transcrição funcional (PIC) [38]. Neste estudo, mostraram que os siRNAs segmentação do TSS localizar a 101 pb a montante do ATG de iniciação da transcrição interferiu com de heparanase, e a perda concomitante de TFIIB e ARN Pol II sugerem que os siRNAs reduzida a montagem de formação de PIC neste TSS. Foi indicado que, quando a RNA polimerase de mamífero se liga a ADN em TSS, forma-se um complexo aberto, no qual assenta a -9 2 são acessíveis a agentes químicos que modificam o ADN de cadeia simples, o que sugere que TSS pode ser acessível para hibridação [36 ], [37]. Estudos recentes indicaram a presença de RNA não-codificante promotor-associado (pRNA) e as consequências da sua segmentação por siRNAs em células humanas [39], [40]. PRNAs baixo número de cópias são reconhecidos pela cadeia anti-sentido do siARN e funcionar como um motivo de reconhecimento para dirigir complexos de silenciamento epigenética para os promotores-alvo que corresponde ao mediar TGS em células humanas [39]. Além disso, a formação de complexos de siRNA-ARNp com a contribuição de ago2 é responsável pela montagem reduzida de PIC funcional e bloqueio de iniciação de transcrição no promotor c-myc [40]. Assim, se pRNA existe para dirigir siH3 induzida TGS de mandados de heparanase a nossa investigação mais aprofundada. Porque um complexo aberto é formado durante a transcrição de cada gene, é possível conceber directamente agRNAs a qualquer gene que tem uma TSS caracterizado [41]. Portanto, acreditamos que a estratégia TGS via siRNA TSS-alvo também pode ser aplicado a outros genes, que merece o nosso mais investigação.

complexos de proteínas Ago contendo pequenos RNAs de cadeia simples são chamados madura complexo de silenciamento induzido por ARN (RISC) [42]. proteínas atrás estão carregados positivamente superfícies que estão bem adaptados para a ligação de siRNA e alinhando-a com a sequência alvo complementar, o que sugere que as proteínas atrás pode desempenhar um papel central na formação de iniciação induzido por ARN de complexo TGS que inicia a formação de heterocromatina [37] .