Abstract

A expressão por células tumorais de proteínas com contas estrutura aberrante, expressão ou de distribuição para o desenvolvimento de uma resposta imune humoral. Os auto-anticorpos (AAB) dirigidos contra antigénios associados a tumores (TAA) podem, assim, ser particularmente relevante para a detecção precoce do cancro. análise do proteoma sorológico (Serpa) visa identificar tais AAB que circula através do immunoblotting das proteínas de células tumorais 2D separados com soro paciente de câncer ea identificação MS consecutivo de proteínas em pontos reativos. Este método tem a vantagem de utilizar proteínas modificadas pós-tradução como uma fonte potencial de TAA. Aqui, nós aplicamos esta estratégia, utilizando células tumorais colorretais pré-expostos a hipóxia, a fim de promover a expressão de um padrão de TAA mais provável para representar

in vivo

condições. Foram utilizadas duas linhas celulares de cancro colo-rectal HCT116 e HT29 humanas expostas durante 48 horas a 1% O

2. Manchas positivas depois de imunotransferência de lisados ​​2D separadas de células hipóxicas com os soros de ratinhos portadores de tumor, foram recolhidas e analisadas por MS para a identificação de proteínas. Entre as proteínas imunogênicas específicas de hipóxia, identificamos uma forma fosforilada de eucariótica fator de tradução de alongamento 2 (fosfo-Thr56 eEF2). Confirmou-se o aumento da fosforilação da proteína em células de tumor colorectal hipóxicos, bem como em tumores de ratinho. Usando um imunoensaio específico, que pode detectar a presença do correspondente anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB no soro de murganhos portadores de tumores (

vs ratos saudáveis ​​

). Nós ainda documentado que a detecção destes AAB precedeu a detecção de uma massa de tumor palpável em ratinhos e validou a presença de anticorpos anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB no soro de pacientes com pólipos adenomatosos e carcinoma colorrectal. Em conclusão, este estudo valida a forma fosforilada de eEF2 como um novo TAA e, mais geralmente, fornece evidências de que a integração hipóxia montante de Serpa oferece um repertório mais relevante do TAA capaz de desmascarar a presença de AAB em circulação.

Citation : Grandjean M, Sermeus A, branders S, Defresne F, Dieu M, Dupont P, et al. (2013) hipóxia Integração no tumor Antígenos sorológica Proteome Análise desmascara e promove a identificação de Anti-Phospho-eEF2 Antibodies como potenciais Cancer Biomarkers. PLoS ONE 8 (10): e76508. doi: 10.1371 /journal.pone.0076508

editor: Masaharu Seno, Universidade de Okayama, Japão

Recebido: 24 Março, 2013; Aceito: 27 de agosto de 2013; Publicação: 10 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Grandjean et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Fonds National de la Recherche Scientifique (FRS-FNRS), o Fonds de la Recherche Scientifique Médicale (FRSM), uma acção de Recherche Concertée da Communauté française de Belgique (ARC 09 /14-020), o Interuniversitário pólo de atração (IUAP programa P7.03), eo Maisin Fundação J.. M. Grandjean é um FRIA (Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture) Research Fellow. A instalação do MS-URBC NARILIS foi apoiado pelo FNRS (Bruxelas, Bélgica). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a contribuição do microambiente do tumor para a progressão do câncer hoje em dia é bem reconhecida [1]. A hipoxia é um desses parâmetros do microambiente que representam alterações fenotípicas em tumores [2] – [4]. baixa concentração de oxigênio nos tumores resulta de um desequilíbrio entre a oferta eo consumo de oxigênio, principalmente devido à imaturidade da vascularização do tumor e a proliferação de células cancerosas rápida, respectivamente [5]. Em resposta a hipoxia do tumor, as células tumorais irão retardar a sua maquinaria de síntese de proteína, enquanto, ao mesmo tempo, a indução de factores de transcrição, tais como o HIF (factor de hypoxia-inducible) vai promover programas de expressão de genes específicos [6], [7]. As células de tumor hipóxicas, assim, apresentar um perfil proteomic distinta de células tumorais normóxicas, com a expressão preferencial de proteínas necessárias para suportar mecanismos adaptativos, incluindo as que a angiogénese e o interruptor glicolítica [8] – [10]. Curiosamente, hipoxia também desempenha um papel na carcinogénese como uma consequência da proliferação de células tumorais epiteliais no início em superfícies que são separados a partir do fornecimento de sangue subjacente por uma membrana basal intactas [11]. Além disso, a relação entre a inflamação e cancro é proposta para integrar o ambiente hipóxico devido ao aumento do volume e do metabolismo celular durante rede microvascular é (ainda) não adaptada [12]. Curiosamente, na carcinogénese colorrectal, a sequência adenoma-carcinoma foi relatado para ser associada com a indução de HIF-1α em lesões pré-malignas [13], bem como com displasia [14]; HIF-2α também foi relatado para promover a progressão de adenoma para carcinoma de [15].

Embora hipoxia é reconhecida como uma marca de tumor que representam alterações no fenótipo de células de tumor, que foi até agora, em grande parte como um subestimada fonte de modulação do padrão de antigénios propensos a dar origem a uma resposta imunogénica. antigénios associados a tumores (TAA) são descritas como proteínas libertadas por células de tumor ou péptidos expostos na superfície de células tumorais ou células apresentadoras de antigénio de MHC de classe I e moléculas II, respectivamente [16] – [19]. Mutação, truncamento, o enrolamento incorrecto, a sobre-expressão e a expressão ectópica de proteínas em células de tumor são propostos para explicar a imunogenicidade destes TAA [20] – [22]. Curiosamente, auto-anticorpos (AAB) dirigidos contra estas proteínas modificadas representam potenciais biomarcadores para detecção precoce do câncer ou mesmo prognóstico [23] – [26]. A especificidade e a estabilidade dos anticorpos em conjunto com uma relativa facilidade de detecção representam vantagens principais em comparação com outros componentes do sangue que circulam [19]. Serpa (Análise serológica proteoma) técnica explora a separação de lisados ​​proteicos derivados a partir de células de tumor em duas dimensões géis e imunotransferência consecutiva utilizando soros recolhidos a partir de doentes com cancro [25], [27], [28].

Aqui, pelas razões expostas acima, que escolhemos para integrar hipóxia como um parâmetro ambiental no fluxo de trabalho SERPA por células de câncer colorretal pré-incubação em 1% o

2, a fim de desmascarar TAA ausente ou indetectável em lisados ​​de normóxica células tumorais. Foram identificados diferentes antigénios tumor-específico e por hipoxia, incluindo a forma fosforilada Thr56 do factor de alongamento 2 eucariótica (eEF2). Um imunoensaio dedicado foi desenvolvido e está habilitada para validar fosfo-eEF2 como um

bona fide

TAA e correspondentes AAB como potenciais biomarcadores de câncer em camundongos e humanos induzida por hipóxia.

Métodos

Ética Declaração

Todos os experimentos envolvendo ratos e células tumorais recebeu a aprovação da

Comité d’Ethique Facultaire

do

Université Catholique de Louvain

(UCL) ( ID aprovação 2012 /UCL /MD005); mouse estudos foram realizados de acordo com os regulamentos nacionais de cuidados de animal.

Todos os pacientes foram internados no Universitair Ziekenhuis Brussel (Bélgica) e deu consentimento informado por escrito concordando com a política do hospital. Isso inclui o uso anônima de material do corpo residual para fins de investigação científica em estrita conformidade com a Declaração de Helsínquia e do artigo 20.2 da Lei belga (19-12-2008), relativamente à compra e uso das corporal humana Materiais para aplicações médicas Humanos e para a Investigação Científica. Este artigo da lei estabelece que o consentimento para o uso de materiais biológicos humanos pesquisa é considerada a ser dada se o doador não comunicou uma objecção a esse uso. Praticamente, todos os pacientes submetidos a colonoscopia submetidos a uma análise de sangue para avaliar o seu hemograma e coagulação; este procedimento é obrigatório para permitir a ressecção endoscópica em pólipos de casos são encontrados. Nenhum dos autores foi envolvido nas coleções de amostras:. Amostras de sangue residuais foram recolhidos por uma enfermeira e de-identificadas por um gerenciador de dados antes do envio para o laboratório para a estrita finalidade do estudo atual

Células

carcinoma colorrectal humano HCT 116 e linhas de células HT29 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC), armazenados de acordo com as instruções do fornecedor e utilizada dentro de 6 meses após a reanimação de alíquotas congeladas. Ambas as linhas celulares foram rotineiramente cultivadas em meio de McCoy 5A (Invitrogen, Paisley, UK) suplementado com soro fetal bovino a 10% e antibióticos. As células foram mantidas a 37 ° C em normóxica (21% O

2, 5% de CO

2) condições expostas a hipoxia (1% de O

2, 5% de CO

2) num Invivo2 500 câmara hipóxica durante 48 h (Ruskinn, Bélgica).

ratos

masculinos 7 semanas de idade ratos NMRI machos (nu /nu) (Elevage Janvier, Le Genest Saint-Isle, França ) foram injectados subcutaneamente com 2,10

6 células HCT116 ou HT29; diâmetros tumorais foram rastreados semanal com um paquímetro eletrônico. Os soros foram recolhidos para ensaios sorológicos através de punção retro-orbital no dia 0 e cada semana até que o tumor atinge o diâmetro de 8 mm. No final de um conjunto de experiências, os ratinhos foram sacrificados, o sangue foi recolhido por via intra-cardíaca, o soro foi isolado após centrifugação à temperatura ambiente e os tumores foram criopreservadas.

Pacientes

soros foram coletadas de pacientes submetidos à colonoscopia para queixas digestivas ou para o rastreio. Seis pacientes tiveram colonoscopia normal e foram utilizados como controle, catorze pacientes tiveram pólipos adenomatosos e nove tiveram carcinoma; as médias das idades dessas três categorias de pacientes foi de 71 ± 4, 67 ± 3 e 71 ± 3 anos, respectivamente. O sangue foi recolhido em tubos de tipo neutro e após a centrifugação, o soro foi dividido em alíquotas e armazenado a -80 ° C.

2-Dimensional Analysis Electroforese e Serpa

Para a extracção de proteínas, ou normóxica células hipóxicas foram lavadas com solução salina de sódio a 20 mM de fosfato tamponada (PBS) e raspadas com rotulagem DIGE (DLA) de tampão de lise (ureia 7 M, 2 M tioureia, 4% CHAPS e Tris 30 mM, pH 8,5). O sobrenadante foi, em seguida, recuperada após centrifugação durante 10 minutos a 10000 rpm e 4 ° C e a concentração foi determinada pelo ensaio de proteína de Bradford.

Para as experiências de Serpa, 25 ug de extracto de proteína foi minimamente marcado com 200 pmol de corante de cianina Cy5 (Amersham GE Healthcare) durante 30 minutos no escuro em gelo, de acordo com o protocolo do fabricante. Rotulagem reacção foi parada por incubação da mistura com lisina 10 mM (Sigma Aldrich) durante 10 minutos. Não proteínas marcadas foram adicionadas para atingir um total de 250 ug de proteínas e diluiu-se num tampão de carga apropriada (4% 3 – [(3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulfonato (CHAPS), ureia 7 M, 2 M tioureia, Tris 30 mM, ditiotreitol 30 mM (DTT), 1% de tampão de IPG 3-11 [GE Healthcare]). As amostras foram carregadas em reidratadas primeira tira dimensão (Immobiline DryStrip, pH 3-11 NL, 18 cm, GE Healthcare). As amostras foram separadas em duas em gel bidimensional, utilizando focagem isoeléctrica na primeira dimensão (300 V durante 3 horas, passos de gradiente de 1000 V durante 8 horas, 8000 V durante 3 horas, e 8000 V durante 45 minutos a 20 ° C com um configurações atuais máximo de 50 mA por tira) e gel de SDS polyarcrylamide (10% de acrilamida) eletroforese (SDS-PAGE) na segunda dimensão. As proteínas foram finalmente transferidas para uma membrana de PVDF de baixa fluorescência. As membranas foram incubadas durante 2 h em 5% seco não gordo, leite contendo Tris tampão de solução salina com 1% de Tween (TTBS) tampão de bloqueio e, em seguida, expostos durante a noite à temperatura ambiente, quer a murganhos portadores de tumores de controlo ou de soro em 1% não- gordura seco TTBS contendo leite (diluição 1/100). Para cada experiência, um pool de soros recolhidos a partir de 6 ratinhos diferentes foi usado para assegurar a robustez do método de rastreio. A imunodetecção foi realizada usando anticorpos secundários IgG anti-ratinho conjugado com HRP e o reagente de ECL Plus (GE Healthcare). As membranas foram digitalizados, ao comprimento de onda de Cy5 em um Typhoon FLA9500 Imager (GE Healthcare) para a detecção de proteínas e ao comprimento de onda Cy2 para a detecção de anticorpos, explorando a produção de HRP-catalisada de um intermediário fluorescente que emite a 503 nm do substrato acridano contido no reagente ECL Plus. Para a validação de experiências Serpa, as membranas foram incubadas com o anticorpo comercial contra eEF2 (Abcam, Cambridge, UK) e anticorpos secundários conjugados com HRP (1/5000, Jackson Immunoresearch, Sufolk, UK).

Em Gel digestão enzimática e Espectrometria de Massa (MS) Identificação

Para a recuperação da amostra, as proteínas não marcados foram separados por eletroforese 2D. Os géis 2D foram coradas com fluorescência (coloração de proteína Krypton, Pierce, Thermo Scientific) Após fixação em 50% de água, 40% de etanol e uma solução de ácido acético a 10%, 1 h à temperatura ambiente. As proteínas de interesse foram automaticamente escolhidos entre os géis usando um Ettan ponto Picker (GE Healthcare). Após a lavagem, as manchas de gel 2D foram desidratados em acetonitrilo a 37 ° C. A digestão foi realizada durante a noite a 37 ° C com tripsina (12,5 ng /ml) em bicarbonato de amónio 100 mM. O passo de extracção foi realizada com ácido fórmico a 5% durante 15 min a 37 ° C. Os sobrenadantes foram então usados ​​para a identificação de espectrometria de massa de proteínas com um nano-LC-ESI-MS /MS maxis 4G UHR-TOF (Bruker). Proteínas de interesse foram identificadas graças ao software Mascot (Matrix Ciência, www.matrixscience.com). Em seguida, o banco de dados de proteínas não redundante NCBI foi pesquisada com mamíferos como taxonomia. Somente sucessos significativos, como definido pela análise Mascot probabilidade (p 0,001), foram aceites e pontuações Proteína 63 foram considerados estatisticamente significativos

Immunoblotting e imunohistoquímica

Imunoblotting e imunocoloração foram realizadas. com anticorpos contra eEF2 (1/1000, Abcam), ou fosfo-Thr56-eEF2 (1/1000, Abcam). carga de gel era normalizada com anticorpo actina (Sigma-Aldrich). A revelação foi realizada com um anticorpo anti-IgG de coelho acoplado a peroxidase de rábano (Jackson ImmunoResearch) e ECL Plus (GE). Para a imunoquímica, 5 uM secções de tumores HCT116 xenoenxertados congeladas foram montadas em lâminas para a imunocoloração. A proteína fosfatase (Proteína Fosfatase, lambda, Calbiochem) foi utilizada de acordo com o protocolo do fabricante para validar a especificidade da imunocoloração fosforilada. Depois do tratamento com fosfatase, secções de tumor foram sondadas com anti-eEF2 (1/50) ou anti-Thr56 fosforilada (1/50) anticorpos eEF2 e foram imunocoradas com anticorpo anti-coelho Alexa 488 (Invitrogen).

eEF2 imunoensaio

As quantidades de anticorpos dirigidos contra fosforilada Thr56 eEF2 circulando foram determinados em um imunoensaio dedicado. Placas de 96 poços (Reacti-Bind, Thermo Scientific) foram revestidas durante a noite à temperatura ambiente com 10 ug /ml de um péptido de 12 aminoácido fosforilado de eEF2. A sequência foi fosfopéptido RAGETRFTDTRK, correspondendo aos aminoácidos 50-61 da proteína eEF2, com uma fosforilação em Thr56 (Eurogentec). Revestimento e bloqueio passos foram realizados utilizando tampão de revestimento de ELISA e ELISA Ultrablock (ABD Serotec) de acordo com as instruções do fabricante. Os soros diluídos (1/100 para ratinhos e 1/200 para os seres humanos) foram incubadas durante a noite a 4 ° C. Após a lavagem, a hibridação específica foi medida com um anticorpo conjugado com peroxidase anti-IgG de ratinho (diluição 1/10 000, Jackson ImmunoResearch) e a adição de 3,3 ‘, 5,5’-tetrametilbenzidina (TMB, Calbiochem). As placas foram lidas a 450 nm num leitor de microplacas VictorX4.

Estatísticas

Os resultados são expressos em média ± S.E.M. Estudante de

t

de teste e ANOVA foram usados ​​quando apropriado. * P 0,05, ** P 0,01 ou P *** 0,001 foi considerado estatisticamente significativo nas diferentes experiências. Para dados clínicos, sub-populações de doentes foram detectados automaticamente executando os K-means clustering algoritmo [29]; comparações de pares entre os perfis distintos dentro de cada condição foram avaliadas de acordo com um t-teste, incluindo a correção Benjamini-Hochberg FDR para a multiplicidade do teste [30].

Resultados

SERPA Identificação eEF2 AAB em o soro dos ratos portadores de tumor

para simular o microambiente do tumor, as células HCT116 e HT29 colorrectal humano foram expostas a hipoxia (1% de o

2) durante 48 horas, de um intervalo de tempo necessário para a expressão do programa de gene indutível por hipoxia ao nível da proteína e para atingir um novo equilíbrio da taxa de proliferação de células tumorais. Células mantidas sob condições de normóxia (21% O

2) foram utilizados como controlos. Em seguida, aplicada a tecnologia SERPA para identificar antigénios específicos de tumores por hipoxia (Figura 1A). HCT116 e HT29 lisados ​​foram separadas primeiro em gel por electroforese em duas dimensões e transferidas para membranas. Os soros reunidos a partir de controlo ou de ratinhos portadores de tumores (6 soros por condição) foram então usados ​​para revelar pontos correspondentes às proteínas imunogénicas. análise diferencial foi realizada comparando-se diferentes condições: 4 lisados ​​a partir de células de normóxia e de hipóxia sondados com soros de controlo e ratos portadores de tumor (Figura 1B). Esta análise permitiu descarte dois tipos de pontos: (i) os que correspondem às proteínas reconhecidas por anticorpos a partir de soros de ratinho de controlo e (ii) os correspondentes à proteínas reconhecidas pelos anticorpos de ratinhos portadores de tumor, mas não para ser expressa em condições de hipoxia. pontos restantes de interesse foram excisadas, em seguida, a partir de geles preparativos, digerido por tripsina e analisado por MS (Figuras 2 e 3). Através da combinação de ambas as linhas HCT116 e células HT29, encontramos 17 proteínas com pontuações Mascot satisfatórias (p 0,001) que foram reconhecidos pelos anticorpos de ratinhos portadores de tumor, 4 de proteínas específicas de hipoxia e 13 correspondentes às proteínas expressas tanto sob hipóxica e condições de normóxia (ver painéis inferiores das Figuras 2 e 3). Para o resto deste estudo, decidimos focar o antígeno específico da hipóxia estritamente reativa com o soro de camundongos portadores de tumor e identificados por MS com o mais forte pontuação Mascot, ou seja, fator eEF2 ou alongamento eucariótica 2.

A. Fluxo de trabalho do processo de separação incluindo SERPA 2DE-gel de lisados ​​de células tumorais, quer normóxicas hipóxica ou, transferência de membrana, imunotransferência com o soro a partir de ambos os ratinhos portadores de tumor ou controlo, e detecção de pontos de interesse. B. padrões de imunotransferência típica resultantes da incubação de lisados ​​2D-resolvidos de células HCT116 expostas a normoxia ou hipóxia, com o soro de ratinho indicados. Nos painéis de fundo, as proteínas dos lisados ​​são rotulados com Cy corante (vermelho) e anticorpos fixos são detectados com um anticorpo secundário anti-ratinho (mancha verde); seta indica a presença de uma proteína detectada exclusivamente nos lisados ​​de células de tumor hipóxicas por anticorpos a partir do soro de ratinhos portadores de tumor.

a cartografia dos pontos de interesse resultantes da comparação descrito na Fig.1 e uma lista de proteínas identificadas (p 0,001) obtidos utilizando lisados ​​de células de câncer colorretal HCT116

a cartografia dos pontos de interesse que resultem da comparação descrito na Fig.1 e lista de proteínas identificadas (p 0,001) obtido usando lisados ​​de células de cancro colorrectal HT29.

primeiro, para validar a natureza da proteína eEF2 presente nos géis 2D, que a membrana sondada com um anticorpo anti-eEF2 disponíveis comercialmente e encontrado que o sinal combinado de imunotransferência da localização do local identificado por análise SERPA (Figura 4A). Além disso, esta experiência mostrou que a distribuição da proteína em diferentes pontos isoeléctricos (Figura 4A e 4B, painel de cima). No experimento SERPA No entanto, um local (o terceiro de acordo com o intervalo de valores de pI) era imunogénico (Figura 4B, painel do meio), o que sugere fortemente que a modificação pós-translacional podiam conferir a imunogenicidade.

. immunoblotting representante da lisados ​​2D separadas de células HCT116 hipóxicos com um anticorpo comercial contra eEF2. As proteínas dos lisados ​​são rotulados com Cy corante (vermelho) e anticorpo secundário é conjugado com peroxidase de rábano (manchas verdes). sinal positivo é obtido por vários pontos com o mesmo peso molecular mas que diferem pelo seu valor de pi. B. Comparação dos pontos eEF2 detectados com um anticorpo comercial contra eEF2 totais (em cima), o soro de ratinhos portadores de tumor (meio) e um anticorpo comercial contra fosfo-Thr56 eEF2 (parte inferior). Spot 4 (mancha mais à direita) corresponde à forma fosforilada da eEF2 enquanto os outros pontos correspondem a multi-fosforilados formas da proteína; ponto 3 (segunda posição da direita) corresponde à forma monofosforilado preferencial de eEF2 (em Thr56).

A fosforilação de Thr56 eEF2 após hipóxia em colorretais células cancerosas humanas

Uma vez que o fosforilação de eEF2 é conhecida para ocorrer em resposta a hipoxia (levando a eEF2 inactivação e a prisão de tradução da proteína), examinou-se o grau de eEF2 fosforilação em Thr56 descrito anteriormente como o primeiro e principal resíduo modificado por um grupo fosfato no interior da sequência eEF2 [31]. Re-sondagem da membrana 2D usado para SERPA confirmou que o local reconhecido pelo soro de ratinhos portadores de tumor também foi corado positivamente por um anticorpo comercial anti-fosfo-Thr56 eEF2 (Figura 4B, painel inferior). Nós também confirmada em experimentos convencionais transferência de Western que eEF2 fosforilação em Thr56 foi aumentada significativamente em células HCT116 de hipóxia (p 0,01) e que uma tendência semelhante foi observada em células HT29 (Figuras 5A e 5B). Além disso, a injecção de células HCT116 em ratinhos, levou ao desenvolvimento de um tumor com uma coloração robusta de fosfo-Thr56 eEF2 confirmando a ocorrência desta modificação pós-translacional

In vivo

(Figura 5C, painel superior). O tratamento de secções de tumor com lambda fosfatase revogada completamente a coloração obtida com um anticorpo comercial anti-fosfo-eEF2 (Figura 5C, painel inferior).

. Representante eEF2 e fosfo-Thr56 eEF2 immunoblotting de HCT116 e HT29 cultivadas durante 48 horas sob hipóxia (Hx) ou mantidos em normoxia (Nx). B. expressão normalizada de fosfo-Thr56 eEF2 em normóxica vs células HCT116 hipóxica e HT29; n = 3, ** p 0,01 C. representativas fosfo-Thr56 eEF2 imunocoloração de secções de tumores HCT116 na ausência (em cima) ou na presença (em baixo) de lambda fosfatase; observe o completo desaparecimento da forma fosforilada de eEF2 após tratamento com fosfatase.

Validação de Phospho-Thr56 eEF2 como um antigénio associado a tumores e da AAB correspondente como biomarcador da mouse Tumor Crescimento

para explorar ainda mais a imunogenicidade do fosfo-Thr56 eEF2, foi desenvolvido um ensaio para sondar a presença de AAB reactivo contra um fosfopéptido de 12 aminoácidos que flanqueiam Thr56, correspondendo aos aminoácidos 50-61 (Figuras 6A). Nós validada a linearidade do presente imunoensaio usando o mesmo anticorpo anti-fosfo-Thr56 eEF2 comercial, como descrito acima (Figura 6B). Num primeiro conjunto de experiências, utilizou-se um conjunto de seis soros de murganhos portadores de tumores grandes (isto é, 28 dias pós-implantação) e a um sinal de 10 vezes mais elevado do que quando se utiliza os soros de controlo (Figura 6C). Num segundo conjunto de experiências, foi realizado um estudo decurso de tempo para determinar as alterações no sinal de fosfo-Thr56 eEF2 de acordo com o desenvolvimento de tumores HCT116. Os soros foram recolhidos por punção retro-orbital em ratos no dia 0 e ao fim de 7, 14 e 21 dias a seguir à injecção de células tumorais HCT116; crescimento do tumor foi medida em paralelo com um paquímetro electrónico (Figura 6D). Como mostrado na Figura 6E, o sinal fosfo-Thr56 eEF2 já foi significativamente aumentada no dia 7 (p . 0,05

vs

dia 0), enquanto que, neste momento, o tumor não era ainda detectável (Fig. 6D) . Nos dias 14 e 21, o grau de sinal fosfo-Thr56 eEF2 ainda aumentada em paralelo com o crescimento de tumores HCT116 (Figuras 6D e 6E).

. sequências de aminoácidos humana e de ratinho de eEF2 na região de Thr56. Os 12 resíduos que corresponde ao péptido sintético (fosforilada em Thr56) utilizado no nosso ensaio imunológico são indicados (quadro vermelho); Observe a identidade perfeita entre o rato e sequências humanas. B. Detecção de comercial anti-fosfo-Thr56 eEF2-anticorpos utilizando o nosso imunoensaio; linhas tracejadas mostram a banda de confiança de 95% da regressão linear. C. Detecção de anticorpos anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB no soro de murganhos portadores de tumores de controlo ou HCT116 (n = 3). *** P 0,001. D. Tempo de curso do crescimento do tumor HCT 116, conforme determinado por medições de diâmetros de tumor (n = 7 por grupo). E. Detecção de anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB na hora indicada da progressão do tumor HCT116. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 (n = 6-7 por grupo). Note-se que no dia 7 pós-implantação, os tumores não são detectáveis ​​(ver painel D), mas um sinal positivo é detectada no imunoensaio. F. O gráfico representa a detecção de anticorpos anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB no soro de sujeitos de controlo (n = 6) e os pacientes com pólipos adenomatosos (n = 14) ou de carcinoma (n = 9). * P 0,05, ** P 0,01. De nota, K-means clustering identificou duas subpopulações de doentes (ver símbolos preto e vermelho) entre indivíduos com diagnóstico de pólipos adenomatosos (P 0,001) e de carcinoma (P 0,01); a mesma partição foi observada em 100 corridas independentes, variando a inicialização aleatória de K-means.

Anti-fosfo Thr56 eEF2 autoanticorpos Identifiy sub-populações de pacientes com adenoma Colon e Carcinoma

finalmente examinou o potencial da detecção de anticorpos anti-fosfo-eEF2 para discriminar indivíduos de controlo e pacientes com pólipos adenomatosos ou qualquer cacinoma colorrectal. Por causa da identidade de sequências entre o rato e humana em eEF2 os resíduos que flanqueiam Thr56 (ver Figura 6A), utilizou-se o mesmo imunoensaio para os doentes como o descrito acima para os ratinhos portadores de tumor. Descobrimos que pacientes com diagnóstico de pólipos adenomatosos e carcinoma mostrou um aumento no título de fosfo-Thr56 eEF2 AAB (P = 0,0015) quando comparado com os pacientes identificados como negativo seguintes colonoscopia (Figura 6F). Além disso, quando se utiliza os K-means algoritmo (29), duas sub-populações de pacientes pode ser identificada entre os pólipos adenomatosos (p 0,001) e os grupos de carcinoma (p 0,01). (Ver símbolos vermelhos na Figura 6F)

Discussão

os dois principais conclusões deste estudo são (i) que as contas de hipóxia para a modificação do immunoproteome como evidenciado pela detecção de AAB em circulação dirigida contra TAA indetectável em células de tumor cultivadas sob normóxica condições, e (ii) que a estimulação mediada por hipoxia de contas de fosforilação eEF2 para o desenvolvimento de uma resposta AAB cedo para o desenvolvimento do cancro colorectal.

AAB são hoje reconhecidos como potenciais biomarcadores de câncer e SERPA foi desenvolvido para detectá-los a partir de soro de espécimes através do blotting de lisados ​​de células de tumor 2DE-separados. A tecnologia Serpa, em contraste com SEREX e exibição de fagos, permite a detecção de proteínas que tenham sido submetidos a modificações pós-translacionais. No entanto, o proteoma em lisados ​​isoladas a partir de células de tumor em cultura numa incubadora convencional sob normoxia está longe de representar o proteoma de células tumorais no seu

In vivo

microambiente. Em particular, a hipóxia é uma característica de muitos cânceres resultantes do desequilíbrio entre O

2 consumo e O

2 disponibilidade em tumores pouco vascularizados. O impacto da hipóxia sobre o transcriptoma de células tumorais e proteoma é dupla: enquanto a maquinaria de tradução global está mais lento à energia livre, programas de genes específicos regulados por fatores-chave de transcrição, tais como a família HIF, são induzidos a permitir a adaptação das células tumorais [6] . É importante ressaltar que em cancros epiteliais, como o cancro colorectal, a hipóxia é também propôs a ocorrer no início durante a carcinogênese. As células mutantes são, na verdade inicialmente separados dos vasos sanguíneos subjacentes pela membrana basal ainda intacto: isso leva ao desenvolvimento de lesões pré-malignas em regiões avasculares e caminhando para o oposto, regiões menos constrangidos [11]

Em. o estudo atual, nós, portanto, utilizados dois filtros de análise para selecionar TAA potencial de validação. Primeiro, foram excluídos os pontos identificados nas membranas 2D após immunoblotting com soro coletadas de ratos controle. Em segundo lugar, não considerar para escolher as proteínas detectadas pelo soro de ratinhos portadores de tumor, mas apenas expressos em células tumorais de normóxia. Esta estratégia permitiu reduzir o número de resultados falso-positivos e favorecer a detecção de TAA específico encontrado em

in vivo

condições. Foram utilizadas duas linhas celulares de cancro colorrectal diferentes (-P53 de tipo selvagem HCT116 e HT29 p53 mutante) para aumentar ainda mais a diversidade do proteoma, e em particular da immunoproteome. Esta estratégia conduziu à identificação de um total de 17 TAA putativo, 13 expressaram tanto sob hipóxia e normóxia e 4 sendo expresso exclusivamente em condições de hipoxia (ver figuras 2 e 3). Entre estes últimos, nós nos concentramos na eucariótica fator de tradução de alongamento 2 (eEF2), um fator essencial para a tradução do mRNA do ribossoma. A hipoxia é conhecida por promover a inactivação eEF2 para bloquear a síntese de proteínas de alta processo consumidor de energia, a fim de poupar energia [9]. Inactivação de eEF2 resulta da sua fosforilação em Thr56 pelo eucariótica factor de alongamento 2 quinase (eEF2K) através de uma variedade de mecanismos envolvendo a mTOR, AMPK e PhD2 [32] – [34]. Nós realmente identificou esta forma fosforilada de eEF2 como a proteína imunogênica. Embora vários sítios de fosforilação são relatados para eEF2 como evidenciado pelos quatro pontos com pI distintas, detectada por um anticorpo total de eEF2, a localização do local positiva em Serpa apontou fosfo-Thr56 eEF2 como a entidade soros reagentes. A segunda posição da direita é de fato compatível com o sítio de fosforilação preferencial previamente relatado para ser Thr56 em um estudo cinético sobre a regulamentação da eEF2 [31]. Em seguida, confirmou utilizando um imunoensaio com um péptido modificado fosforilada no resíduo Thr56, que esta região foi responsável pela imunogenicidade de eEF2 como detectado no nosso estudo Serpa. Usando este ensaio, verificou-se que anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB eram detectáveis ​​no soro de rato antes de tumores poderia ser palpável. Além disso, verificou-se que estes AAB pode ser detectado em seres humanos com pólipos adenomatosos e câncer colorretal.