Abstract

O câncer de ovário é a principal causa de morte entre os cânceres ginecológicos e é a quinta maior causa de todas as mortes relacionadas ao câncer entre as mulheres. O desenvolvimento de novos alvos moleculares é, portanto, importante para muitos pacientes. Recentemente, o factor de transcrição relacionados com SOX2-SRY tem sido amplamente relatado estar envolvido em várias doenças patofisiológicos, incluindo a manutenção de características de células-tronco e a carcinogénese. Até agora, tem sido demonstrado SOX2 principalmente para promover o desenvolvimento do cancro, embora as suas funções de inibição no cancro também têm sido relatados. No entanto, o papel de SOX2 em cancro do ovário é em grande parte desconhecida. No presente estudo, detectamos a expressão de SOX2 em 64 de carcinoma do ovário (SOC) tecidos serosa humanos e emparelhado correspondente espécimes metastáticos utilizando imuno-histoquímica. Os resultados mostraram que a expressão de SOX2 em tumores primários é muito menor do que nas correspondentes lesões metastáticas. Descobrimos ainda que a sobre-expressão SOX2 promove a proliferação, migração e invasão, enquanto inibe a adesão de células habilidades SOC. Finalmente, verificou-se que tem como alvo SOX2 Src quinase, uma tirosina-quinase não receptora que regula a migração celular, invasão e adesão em células COS. Juntos, estes resultados sugerem que a Src quinase é uma molécula-chave na migração mediada por SOX2 e invasão de células SOC

citação:. Wang X, X Ji, Chen J, D Yan, Zhang Z, Q Wang, et ai. (2014) SOX2 Melhora de Migração e invasão das células do cancro do ovário através de Src quinase. PLoS ONE 9 (6): e99594. doi: 10.1371 /journal.pone.0099594

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de fevereiro de 2014; Aceito: 15 de maio de 2014; Publicação: 17 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (NSFC No. 81.272.883, No. 81020108027 e No. 81.172.478). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer epitelial de ovário para 80-90% de todos os cancros do ovário e é a principal causa de morte entre todas as malignidades ginecológicas [1]. Devido à falta de sintomas precoces, carcinoma de ovário é geralmente diagnosticada em um estágio metastático avançado. metástases difundidas são as principais causas para o mau prognóstico dos pacientes com câncer de ovário. Embora a sobrevida aumentou ligeiramente ao longo dos últimos 25 anos, as taxas de sobrevivência de cinco anos permanecer abaixo de 50% [1]. Portanto, estudar os mecanismos metastáticos de câncer de ovário tem sido um foco em todo o mundo.

SOX2, um membro da alta mobilidade caixa de grupo familiar relacionado com o SRY, foi encontrado inicialmente para manter a pluripotência das células-tronco embrionárias [2] . Mais recentemente, foi demonstrado que SOX2 estar envolvido numa série de doenças malignas. Numerosos estudos têm mostrado que SOX2 promove a proliferação celular, migração, invasão e metástase tumoral em vários tipos de tumores, tais como glioblastomas [3], o cancro colo-rectal [4], o cancro da próstata [5], o cancro da mama [6], [7] e osteossarcomas [8]. Além disso, os níveis de expressão elevados de SOX2 correlacionada com a progressão do tumor ou mau prognóstico de vários cancros. Em contraste, o papel do tumor-supressor da SOX2 também foi relatada em câncer gástrico [9], e cancro do pulmão de células escamosas [10].

Recentemente, vários estudos descobriram que a expressão SOX2 é significativamente aumentada no cancro do ovário tecidos em comparação com tecidos de ovário normais utilizando imuno-histoquímica [11], [12]. A análise multivariada a demonstrar que a superexpressão SOX2 é um fator de mau prognóstico no câncer de ovário [13], [14]. Estas descobertas sugerem que SOX2 pode actuar como um gene promotor de tumor no cancro do ovário. No entanto, os papéis funcionais e mecanismos precisos ainda são tímidas no câncer de ovário. Para clarificar o papel e mecanismos subjacentes de SOX2 em cancro epitelial do ovário, examinámos a expressão de SOX2 em carcinoma seroso do ovário (COS) e tecidos metastáticos correspondentes, bem como em linhas de células COS. Além disso, analisamos o efeito do gene SOX2 sobre as habilidades proliferação, migração e adesão de células SOC.

Materiais e Métodos

amostras SOC Humanos e informações clínicas

SOC primária e tecidos metastáticos pareados (omento) foram obtidos do Departamento de Patologia do Hospital das primeiras pessoas de Xangai. Use dos espécimes foi aprovado pelo Comitê de Ética de Investigação Humana do Hospital das primeiras pessoas da Affiliated Shanghai Jiao Tong University. Todas estas amostras foram obtidas com consentimento informado por escrito. As amostras específicas utilizadas neste estudo foram descritas em publicação anterior [15]. No total, 64 cystadenocarcinoma serosa com omento metástase (fase III) foram estudados. A idade dos pacientes com câncer de ovário variou de 34 a 81 anos (mediana de 61,2). Há 55 casos com a menopausa. Os fixada em formol e embebidos em parafina amostras de tecido de 64 casos de SOC foram coletados entre janeiro de 2003 e dezembro de 2010. Os pacientes com radiação ou quimioterapia prévia foram excluídos. diagnósticos patológicos das lesões acima ovarianos foram feitas por dois patologistas ginecológicos usando a classificação da Organização Mundial de Saúde.

imuno-histoquímica (IHC) coloração e avaliação

análise IHC para a expressão da proteína SOX2 foi realizada tal como anteriormente descrito. Resumidamente, SOX2 expressão foi detectada utilizando um SOX2 anti-humano monoclonal de coelho (Cell Signal Technology, Danvers, MA, EUA). As secções foram incubadas com anti-SOX2 (1:100 diluição) numa câmara de humidade durante 2 h seguido por um 60-minutos de incubação com um anticorpo biotinilado secundário. A percentagem de células coradas positivamente e a intensidade da coloração em que estas lâminas foram avaliadas de forma cega. As células positivas foram indicadas pela presença de coloração castanha, tanto no núcleo e no citoplasma. IHC resultados foram avaliadas sob um microscópio de luz e teve como se segue: 0 5% de células positivas; Janeiro 05-25% de células positivas; 2 26-75% de células positivas; e 3 76% de células positivas. intensidade da coloração foi classificada como: 0, sem coloração; 1, fraco-amarelo; 2, marrom-amarelo; e 3, castanho-escuro. O nível de expressão (além das duas notas) foi classificada como: – (0), + (1-2), ++ (3-4), e +++ (5-6). Pontuações ≥3 foram definidos como expressão de alto nível e pontuações 3 foram definidos como expressão de baixo nível. pontuação IHC individuais para cada caso foram utilizados para análise estatística. Todas as lâminas de IHC foram revisados ​​independentemente por dois investigadores.

linhas de células e cultura de células

linhas de células de cancro do ovário Hey, HO8910 e HO8910-pm foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e cultivadas com base nas diretrizes do repositório. As células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) /F12 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). As linhas celulares MCV152 e Moody foram gentilmente cedidas pelo Dr. Wenxin Zheng (Universidade do Arizona, Tucson, AZ, EUA). células SKOV3 foram adquiridos a partir da Beijing Union Medical College (Pequim, China). As três linhas de células SOC e HEK-293T foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, piruvato de sódio e L-glutamina a 37 ° C com 5% de CO2.

extracção de ARN e quantitativa PCR em tempo real

O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad. CA, EUA). ADN cortesia (ADNc) foi sintetizada com o kit de reagentes Prime-Script RT (Takara, Japão). Fold induções foram calculados utilizando a fórmula 2- (DDCT) utilizando GAPDH como um gene de controlo interno. PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara, Japão). Os pares de iniciadores específicos para o gene foram como se segue: SOX2 (F) 5′-CGG CCA CAA GAA AAA CAG C-3 ‘, SOX2 (R) 5′-TCT TCT CCG CCG AAA ACA GT-3′; GAPDH (F) 5’-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA AC-3 ‘, GAPDH (R) 5′-GTT GCT GTA CCG AAA GTT TTC GT-3’.

transfecção transiente de SOX2 de pequena interferência de ARN (ARNip) e Src siARN

Ho8910-pm e SKOV3 células foram plaqueadas em placas de seis poços a uma densidade de 4 x 10

5 células /poço. Após 24 h de cultura, o meio foi substituído por Opti-MEM (Invitrogen), na ausência de antibióticos e cultivadas. siRNA correspondente ao gene foi desenhado e sintetizado por Genepharma (Xangai, China). No total, 100 pmol de ARNip foi transfectado utilizando 5 uL de lipofectamina reagente RNAiMax (Invitrogen). Após incubação durante mais 48 h, as células tratadas foram utilizados para investigar o efeito da depleção do gene usando a análise de transferência de Western ou ensaios de adesão e Transwell. As sequências de ARNsi contra SOX2 incluídos: (1) 5′-CUGCAGUACAACUCCAUGATT-3 ‘; (2) 5’-GGACAUGAUCAGCAUGUAUTT-3 ‘; (3) 5’-CCA UGG GUU CGG UGG UCAA TT-3 ‘. As sequências de siRNA contra Src incluem: (1) 5’-CAG GCU GAG GAG UGG UAU UTT-3 ‘; (2) 5’-GCC UCA ACG UGA AGC ACU ATT-3 ‘; (3) 5’-UCA CUC GCG UUG AAG ACA ATT-3 ‘

O plasmídeo construção

A sequência de ORF SOX2 foi amplificado a partir do vector SOX2, que foi produzido por Shanghai R . S biotecnologia Co. Ltd (Xangai, China). A integridade do cDNA foi confirmada por sequenciação. A sequência de ORF SOX2 foi inserido no local EcoRI-BamHI do plasmídeo pWPXL e ligado no vector de (uma oferta do Dr. Trono Didier). A sequência de iniciador de SOX2 incluídos: SOX2 (F) 5′-CGC GGA TCC ATG TAC AAC ATG ATG GAG ACG GAG C-3 ‘; SOX2 (R) 5’-CCG GAA TTC GAT TTA TCG CGT CGA CTC ACA TG-3 ‘.

produção Lentivírus e transdução de células

A embalagem plasmídeo psPAX2 e o plasmídeo envelope pMD2.G foram presentes de Dr. T. Didier Trono. vetor pWPXL-SOX2 foi co-transfectado com psPAX2 e pMD2.G em células HEK293T utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen). Os vírus foram colhidos 48 h após transfecção e os títulos virais foram determinados. Ho8910 células foram infectadas com 1 × 10

6 unidades de transdução de lentivírus recombinante na presença de 6 ug /mL de polibreno (Sigma, MO. EUA).

Cell- matriz extracelular (ECM) ensaio de adesão

a capacidade das células de carcinoma do ovário para aderir aos componentes da MEC foi quantificada tal como descrito anteriormente [16]. placas de 96 poços foram revestidos com 1 mg /mL de matrigel (BD, EUA), fibronectina de 10 ug /ml de plasma (Millipore, Billerica, MA, EUA), 10 ug /Tipo ml Eu colagénio (Millipore, Billerica, MA, EUA) , 10 ug /ml de laminina (Millipore, Billerica, MA, EUA), ou com 100 ug /ml de albumina de soro bovino (BSA; Sigma, EUA), e incubadas durante a noite a 4 ° C. Subsequentemente, os locais de ligação não específicos foram bloqueados com BSA a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 4 h a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C, em seguida, as placas foram lavadas duas vezes por PBS. As células (4,0 x 10

4cells /100 uL), diluída com DMEM foram adicionados às placas de 96 poços revestidas e incubou-se a 37 ° C durante 30~60 minitus numa incubadora de CO2. As células não aderentes foram removidas por lavagem com PBS. células ligadas foram analisadas usando uma célula de contagem Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japão) de acordo com as instruções do fabricante, e a densidade óptica foi medida a 450 nm. Estas experiências foram realizadas em triplicado e repetidas duas vezes.

ensaios de proliferação celular

As células foram semeadas a uma densidade de 2000 células por poço em placas de 96 poços e incubadas. Uma alíquota de 10 ul de CCK-8 foi adicionado aos poços e incubou-se durante 2 h. A absorvância foi medida a 450 nm para calcular o número de células viáveis ​​em cada poço. Cada medição foi realizada em triplicado e as experiências foram repetidas duas vezes.

Para os ensaios de formação de colónias, as células foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 200 células por poço e cultivou-se a 37 ° C durante duas semanas. No final da incubação, as células foram fixadas com metanol 100% e coradas com 0,1% (w /v) de Violeta de Cristal. megascopic colónias de células foram contadas usando o programa Image-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA). Cada medida foi realizada em triplicado e os experimentos foram todos realizados pelo menos três vezes

ensaios

migração e invasão

ensaio de migração celular:. 4 × 10

4 células foram suspensas em 200 ul meio DMEM e semearam-se para dentro da câmara superior de cada inserto isento de soro. Em seguida, 500 ul de DMEM contendo 10% de FBS foi adicionado a uma placa de 24 poços. Após incubação a 37 ° C (Ho8910: 12-14 h; Ho8910-pm: 12-14 h; SKOV3: 12-14 h), as células que migraram foram fixas e coradas durante 30 min numa solução de violeta cristal 0,1% em PBS

ensaio de invasão celular:. câmaras foram uniformemente cobertos com 60 mL de Matrigel diluída com DMEM para uma determinada percentagem e incubou-se a 37 ° C durante 2-4 h. Então, 4 × 10

4 células foram suspensas em 200 ul de DMEM e semeadas em câmaras superiores, e 500 mL de DMEM contendo FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior. Após incubação a 37 ° C (Ho8910:24-26 h; Ho8910-pm: 24-26 h; SKOV3 24-26 h)., As células foram fixadas e coradas

análise de Western blot

As células tratadas foram lisadas com ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,5% de ácido desoxicólico, de sódio, 0,1% de SDS). Os lisados ​​celulares foram separados por 7,5-12,5% de SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, EUA), e bloqueadas com PBS contendo Tween-20 e 5% de leite desnatado durante 1 h. As proteínas de interesse foram incubadas com anticorpos primários correspondentes durante a noite a 4 ° C. Eles foram então lavadas três vezes com tampão de lavagem (0,1% Tween-20 em solução salina tamponada com Tris) e incubadas com o anticorpo secundário adequado, à temperatura ambiente durante 1 h. O complexo anticorpo foi detectado utilizando quimioluminescência reforçada Kit (Pierce, Rockford, EUA 1 L.). A sequência primária de anticorpos SOX2, FAK, fosfo-FAK (Y397), Src, fosfo-Src (Y416), p130cas, fosfo-p130cas, ERK1 /2, fosfo-ERK1 /2, MMP2 e MMP9, foram adquiridos a partir de células Signal Technology (Danvers, MA, EUA).

Análise estatística

Todos os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média. As análises estatísticas foram realizadas com o teste exato de Fisher na Tabela 1. Para análise de sobrevivência, as curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram construídas e diferenças entre eles foram testados pelo teste de log-rank. Caso contrário, as diferenças entre os grupos foram analisadas utilizando o teste t de Student (bicaudal).

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

expressão de SOX2 em tumores primários e correspondentes lesões metastáticas em SOC

ovário. amostras de tecido de cancro a partir de 64 doentes foram utilizados neste estudo, e a expressão de SOX2 foi analisada nestes tecidos usando imuno coloração (IHC). Como mostrado na Tabela 1, 21 de 64 (32,8%) de tecidos de lesões primárias tinham níveis de expressão relativamente baixos de proteína SOX2, ao passo que 15 dos 64 (23,4%) dos tecidos metastáticos apresentou baixa expressão de proteína SOX2. Contudo, 43 dos 64 (67,2%) de tecidos de lesões primárias tinham níveis de expressão relativamente elevados de proteína SOX2, ao passo que 49 de 64 (76,6%) de tecidos metastáticos mostrou elevados níveis de expressão de proteína SOX2. Notavelmente, os níveis de expressão foram maiores SOX2 em lesões metastáticas do que aqueles nos seus tecidos tumorais primários emparelhados (Figura 1A e Figura 1B).

(A), (B) representam dois exemplos de 64 casos. Entre A, no canto superior esquerdo representa um tecido canceroso primário; o inferior esquerdo representa as metástases correspondentes (omento). Certo, ampliação de tecidos no quadro preto. O Arragement de B é semelhante a A. (C), (D) de Kaplan-Meier análise mostra as curvas de sobrevida sujeito com um nível de expressão elevado SOX2 têm maior risco de morte. tecidos de cancro do ovário com expressão SOX2 (score≥3) foram classificados como de alto nível SOX2. Entre C, os pacientes com alto nível SOX2 (n = 43) apresentaram sobrevida significativamente pior do que aqueles com SOX2 baixo nível (n = 21) em tecido primário SOC (

p

= 0,0358, teste de log-rank). Entre D, os pacientes com alto nível SOX2 (n = 49) apresentaram sobrevida significativamente pior do que aqueles com SOX2 baixo nível (n = 15) no tecido metastático SOC (

p

= 0,0029, teste log-rank).

As correlações entre a expressão SOX2 e fatores patológicos clínicos em SOC humano foram investigados. Curiosamente, descobrimos que a expressão SOX2 foi significativamente associada com o grau histológico. Especificamente, a expressão SOX2 foi relativamente elevada em tumores menos diferenciadas (Tabela 1). A coloração positiva de SOX2 aumentada gradualmente a partir de G2 para o grau G3, indicando que a proteína SOX2 foi aumentada durante o desenvolvimento de SOC. Caso contrário, não houve associação significativa entre a expressão SOX2 e os níveis de CA125 idade ou soro.

A associação de expressão SOX2 com OS (sobrevida global) durações e taxas em diferentes meses foi estudada. Pacientes com expressão SOX2 de alto nível tiveram durações OS mais curtos do que aqueles com expressão SOX2 de baixo nível no tecido tumoral primário e tecido metastático, respectivamente (Figura 1C e 1D). Juntos, estes resultados sugerem que a expressão de SOX2 pode prever mau prognóstico no carcinoma do ovário humano.

SOX2 aumenta os potenciais metastáticos e migratórias e diminui a capacidade de adesão de células SOC

Para escolher linhas celulares adequadas para estudar a função biológica de SOX2, analisou-se primeiro os níveis de proteína do SOX2 em seis linhas celulares de tumor ovariano. Nós descobrimos que os níveis de proteína de SOX2 foram muito variada em diferentes linhas celulares de cancro do ovário. Como mostrado na Figura 2A e Figura 2B, a expressão de SOX2 foi relativamente aumentada em SKOV3 e altamente metastático linha celular Ho8910-pm em comparação com a sua linha de células de cancro do ovário pai Ho8910. A expressão de SOX2 foi relativamente baixa na cystadenoma seroso do ovário benignos eternizada linha de células MCV152 ea linha de ovário humano imortal células epiteliais Moody.

análise de RT-PCR semi-quantitativa de SOX2 em seis linhas celulares de tumores ovarianos. (B) análise por Western blot da expressão da proteína SOX2 em linhas celulares correspondentes. GAPDH foi utilizada para normalização. (C) análise semi-quantitativa por RT-PCR e análise de Western blot de SOX2 em Ho8910-SOX2, Ho8910-pm-siSOX2, células SKOV3-siSOX2. GAPDH foi utilizada para normalização.

Para investigar ainda mais a função de SOX2 em células COS, o gene SOX2 foi sobre-expresso pela infecção por lentivírus, em Ho8910, que foi confirmada por PCR em tempo real e Western blot (Figura 2C). Subsequentemente, foi determinado o efeito da sobreexpressão SOX2 sobre a proliferação das células SOC. Os resultados mostraram que a sobreexpressão do gene SOX2 poderia promover a proliferação de células SOC (Figura 3A e Figura 3B). Além disso, examinou-se o efeito da sobreexpressão SOX2 nas capacidades migratórias, invasivos e adesivas das células COS utilizando ensaios Transwell e ensaios de adesão célula-ECM. Os resultados mostraram que a sobre-expressão da proteína SOX2 pode promover significativamente a migração e a invasão de células COS (Figura 4A), ao diminuir a adesão das células COS para Matrigel, f ibronectina, colagénio do tipo I e laminina (Figura 5A).

transfecção estável do plasmídeo SOX2 promoverem a proliferação celular e formação de clones (A) Os ensaios de CCK8 em HO8910. Os ensaios (B) formação de clones em HO8910. transfecção transiente de SOX2 siARN inibir a proliferação celular e ensaios de formação de clones CCK8 (C) em HO8910-pm. ensaios (D) Clone de formação em HO8910-pm. (E) em ensaios de CCK8 SKOV3. ensaios (F) formação Clone em SKOV3.

(A) transfecção estável do plasmídeo SOX2 em HO8910. Top, transpo� ensaios de migração; Bottom, Transwell ensaios de invasão. (B) a transfecção transiente de siRNA SOX2 em HO8910-pm. Top, transpo� ensaios de migração; Bottom, Transwell ensaios de invasão. (C) transiente transfecção de siRNA SOX2 em SKOV3. Top, transpo� ensaios de migração; Bottom, transpo� ensaios de invasão.

(A) Redução de adesão após a transfecção estável de plasmídeo SOX2 em HO8910. (B) aumentar a aderência após a transfecção transiente de siRNA SOX2 em HO8910-pm. (C) aumentar a aderência após transfecção transitória de SOX2 siRNA em SKOV3.

Em seguida, derrubou a expressão do gene SOX2 usando transfecção transitória de siRNAs em duas linhas de células com relativamente alta expressão de SOX2, Ho8910 -pm e SKOV3. A eficiência interferência foi confirmada por PCR em tempo real e transferência de Western (Figura 2C). Subsequentemente, o efeito do knockdown de SOX2 sobre a proliferação destas células foi determinada utilizando ensaios de CCK-8 e ensaios de formação de clones. Os resultados mostraram que a perturbação da proteína SOX2 diminuição da proliferação destas células COS (Figura 3C-3F). Além disso, verificou-se que knockdown da expressão da proteína SOX2 inibiu as capacidades migratórias e invasivos de células COS por Transwell ensaios (Figura 4B e figura 4C), ao promover a adesão celular a Matrigel, f ibronectina, colagénio do tipo I e laminina (Figura 5B e Figura 5C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o gene SOX2 pode ter um papel importante na proliferação de células, migração, adesão e invasão de células COS.

A sobre-expressão de SOX2 leva a um aumento da fosforilação de várias proteínas pró-matastatic

Nós exploramos os mecanismos moleculares subjacentes a migração celular mediada por SOX2 e metástase do tumor. Verificou-se que a sobre-expressão estável de SOX2 resultou no aumento da fosforilação de FAK e Src e as suas moléculas de jusante (P130-CAS) em células Ho8910 (Figura 6). Além disso, knockdown alvo do gene SOX2 levou a uma fosforilação reduzida destas proteínas em células SKOV3 (Figura 6) Ho8910-pm e.

(A) Esquerda, expressão de proteínas análise por Western blot após a transfecção estável de plasmídeo SOX2 em ho8910. Médio, expressão de proteínas western blot após transfecção transitória de SOX2 siRNA em HO8910-pm. Direita, Western blot expressão de proteínas de análise após a transfecção transiente de siRNA SOX2 em SKOV3. (B) O Arragement de B é semelhante a A.

knockdown de Src promove a adesão de células e reduz a migração celular e invasão

Os resultados anteriores sugerem que a activação da cinase Src pode ser responsável pela fosforilação da tirosina de P130-cas em células COS. Para determinar se a atividade de Src quinase é necessário para a fosforilação induzida por SOX2 de P130-cas, que derrubou o gene Src por siRNA em células Ho8910-SOX2 Ho8910-vetor e. A eficiência interferência foi confirmada por Western blotting (Figura 7B). Descobrimos que knockdown da expressão de proteínas Src inibiu as habilidades migratórias e invasivos de células Ho8910-SOX2 em ensaios transpo� (Figura 7A), enquanto promove a adesão celular a matrigel, fibronectina, colágeno tipo I, mas não laminina (Figura 7C). Além disso, verificou-se que a fosforilação de P130-cas pode ser atenuado na célula Ho8910-SOX2 por knockdown do gene Src (Figura 7B). Em conjunto, estes resultados indicaram que a actividade de Src-quinase é essencial para a adesão mediada por SOX2 e migração de células COS.

Ensaios

(A) migração e invasão Transwell. (B) ensaio de adesão de Western blot de proteínas de análise de expressão (C).

Discussão

SOX2 é um regulador chave para a manutenção da pluripotência e auto-renovação das células-tronco embrionárias e contribui para a reprogramação de células somáticas diferenciadas volta a um estado de células-tronco pluripotentes. Mais recentemente, SOX2 expressão aumentada foi detectada em vários tumores malignos, sugerindo que SOX2 também regula a tumorigénese [3] – [10]. Numerosos estudos têm mostrado que a expressão elevada de SOX2 está correlacionada com linfático e invasão vascular, diferenciação pobre, e diminuição da sobrevivência livre de doença [3] – [8]

Embora a associação da expressão de SOX2 com o pobre clínica. resultado de cancro do ovário tem sido relatada [11], [12], os papéis e mecanismos funcionais neste tumor foram menos conduzidas previamente, especialmente na metástase tumoral e adesão. Em nosso estudo, SOX2 superexpressão promoveu a proliferação celular ea formação de clone. No entanto, o resultado não é totalmente consistente com relatórios anteriores [13], [14]. Isto pode ser devido a diferentes linhas de células de cancro do ovário utilizados. Recentemente, foi relatado que os objectivos SOX2 fibronectina para promover a migração celular e invasão do cancro do ovário em [14]. No presente estudo, verificou-se que a quinase Src pode estar associado com alterações induzidas por SOX2 em cancro do ovário. O aumento da invasão pode estar relacionada com o aumento da fosforilação de várias proteínas pró-metastáticos induzidas por sobre-expressão SOX2.

Src-quinase é uma tirosina-quinase não receptora e é conhecida por desempenhar papéis essenciais em várias vias de sinalização de proliferação, migração , a aderência, e na angiogénese durante o desenvolvimento e progressão do tumor [17], [18]. Src cinase é sobre-expressa ou activada em diversos tumores sólidos, incluindo cancro da mama [19], o cancro da próstata [20], o cancro do cólon [21], o cancro gástrico [22] e cancro pancreático [23]. Além disso, tem sido mostrado que a Src foi associada com a expressão SOX2 e auto-renovação das células estaminais lado-população semelhante no cancro do pulmão de células não pequenas [24]. Embora a metástase é um processo multifatorial, invasão é um elo crítico para células tumorais de metástase. No presente estudo, verificou-se que a superexpressão estável de SOX2 resultou em, obviamente, aumentou a fosforilação de Src e aumento da capacidade de invasão, enquanto knockdown do gene SOX2 levou para o nível de fosforilação reduzido de Src e capacidade de invasão no SOC. Posteriormente, a capacidade invasão foi também diminuiu após o knockdown de SOX2 ou Src.

p130cas pode ser fosforilada por Src ou FAK cinases da família. Ele atua como uma molécula de andaimes para regular complexos de proteínas que controlam a migração e adesão celular, apoptose, ciclo celular, função diferenciação celular e até mesmo progenitor [25], [26], [27]. No presente estudo, também descobriram que o nível de fosforilação de p130cas foi regulada por Src-quinase em linhas SOC.

O controlo de adesão célula-matriz também desempenha um papel importante no controlo da migração de células de cancro durante a metástase [28]. Na fase inicial de metástase de tumor, reduzida capacidade de adesão de células cancerosas irá causar o derramamento de células de cancro e invasão de outros sítios. No nosso estudo, a redução da aderência pode ser também devido ao aumento da expressão das metaloproteinases da matriz (MMP2 e MMP9), seguido de sobre-expressão de SOX2. Fak promoveu a formação do complexo de sinalização Src-p130cas-Crk-Dock180, que conduz à elevação selectiva de Ras GTPase e JNK, e resultou num aumento da expressão de MMP2 e MMP9 [29]. Descobrimos que knockdown da expressão do gene de Src podem reduzir a expressão de MMP2 e de MMP9. MMP2 e MMP9 são as metaloproteinases que degradam a importantes ECM e reduzem a capacidade de adesão celular. Outra causa da redução da aderência pode ser devido ao aumento do nível de fosforilação de Src e Erk. Um estudo demonstrou que a sobre-expressão de Src pode inibir a nível da subunidade de integrina a expressão da proteína por Erk em células tumorais do cólon [30]. Assim, deduzimos que a sobre-expressão de Src pode alterar a expressão ou a função do sub-unidade de integrina nas células de cancro do ovário. Isto também explica por que uma expressão elevada de FN induzida pela sobre-expressão SOX2 em cancro do ovário [14], não conduziu a Aderização [31], mas uma aderência inferior no nosso estudo. Em nosso estudo SOX2 modulada SOC adesão ao matrigel, fibronectina, colágeno tipo I, não incluindo laminina. mecanismos específicos precisam ser mais bem estudadas.

No presente estudo, verificou-se que um dos mecanismos pelos quais SOX2 promovidas migração celular SOC e metástase do tumor é através da fosforilação e ativação de p130cas e alta expressão de MMP2 e MMP9 . Tem sido bem documentado que as cinases da família Src quinases são os principais que promovem a fosforilação da tirosina de p130cas e aumentam a expressão de MMP2 e MMP9 [26], [32], [33]. Em conjunto, verificou-se que a fosforilação induzida por activação SOX2 e é parcialmente dependente da activação de Src quinase.

Em conclusão, os nossos resultados sugerem que a SOX2 desempenha um papel crucial na migração celular SOC e metástases de tumores, e o src quinase cascata de sinalização pode ser um componente-chave da rede de sinalização SOX2 pró-metastático em células SOC.

Reconhecimentos

Estamos muito gratos ao Professor Didier Trono (Escola Politécnica Federal de Lausanne, 1015 Lausanne, Suíça) para fornecer os plasmídeos pWPXL, psPAX2 e pMD2.G. Agradecemos também Doctor Deshui Jia (Shanghai Cancer Institute, Xangai, China) por sua grande ajuda na edição de idioma.