Abstract

Fundo

citotoxicidade Natural, mediada por células natural killer (NK) desempenha um papel importante na inibição e eliminação de células tumorais malignas. Para investigar o papel imunorregulatório das células NK e seu potencial como marcadores de diagnóstico, a atividade das células NK (NKA) foi analisada no cancro da próstata (PCA) pacientes com particular ênfase na distribuição subconjunto de células NK.

Métodos

Os dados prospectivos de padrões de distribuição subconjunto de células NKA e NK foram medidos de 51 pacientes inicialmente diagnosticados com CaP e 54 controles saudáveis. NKA foi representada por níveis de IFN-y após estimulação de sangue periférico com Promoca®. Para determinar a distribuição dos subconjuntos das células NK, as PBMC foram marcadas com anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromo. Então, CD16

+ CD56

dim e CD16

-CD56

células vivas seleccionadas na CD56

+ CD3

-. Células foram analisadas usando um fluxo citómetro

resultados de

NKA ea proporção de CD56

células vivas foram significativamente menores no grupo com CaP em relação aos controles (430,9 pg /ml vs. 975,2 pg /ml e 2,3% vs. 3,8%, respectivamente;

p 0,001

). Ambos tendem a diminuir gradualmente, de acordo com a progressão estágio do câncer (

p Compra de tendência =

0.001

). A CD56 significativamente maior

dim-to-CD56

índice de célula brilhante foi observado em pacientes PCA (41,8 vs. 30,3;

p 0,001

), juntamente com um aumento gradual de acordo com a progressão de estágio do câncer (

p Compra de tendência =

0.001

), o que implica uma redução significativa da CD56

células vivas em relação à alteração do CD56

células dim. A sensibilidade ea especificidade do NKA relacionada com detecção de CaP foram de 72% e 74%, respectivamente (melhor valor de corte de 530,9 pg /ml, AUC = 0,786).

Conclusões

Redução da CD56

células vivas podem preceder a disfunção das células NK, levando a citotoxicidade contra células prejudicada APC. Essas observações podem explicar um dos mecanismos por trás disfunção das células NK observada em CaP microambiente e dar suporte para o desenvolvimento de estratégias de imunoterapia do cancro futuros

Citation:. Koo KC, Shim DH, Yang CM, Lee SB, Kim SM , Shin TY, et al. (2013) Redução do CD16

-CD56

brilhante celular NK subconjunto Precede NK celular Disfunção no câncer de próstata. PLoS ONE 8 (11): e78049. doi: 10.1371 /journal.pone.0078049

editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de junho de 2013; Aceito: 08 de setembro de 2013; Publicação: 04 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Koo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação de Pesquisa Nacional da Coreia financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2012-0000807). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Um autor, SMK, é um funcionário da ATGen que ajudou com o processo experimental. No entanto, isso não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

natural killer (NK) têm um papel importante na inata e adaptativa as respostas imunes contra a transformação do tumor ou as células infectadas com agentes patogénicos [1]. células NK exercem citotoxicidade natural para eliminar as células malignas sem sensibilização prévia ou a classe I de MHC de restrição [1], [2]. Além disso, as células NK estimular a resposta imune adaptativa através da secreção de citoquinas pró-inflamatórias para neutralizar os mecanismos de escape promovidas pelas células tumorais [3]. Registaram-se progressos na compreensão da biologia das células NK; no entanto, mais esclarecimentos permanece sobre os efeitos anti-tumorais da atividade NK celular (NKA) e padrões de distribuição subconjunto em CaP. células

NK são definidos fenotipicamente pela sua expressão de CD56 e falta de expressão CD3 [4]. De acordo com densidades de membrana de CD56 e CD16, as células NK são classificados em CD16

+ CD56

dim e CD16

-CD56

subconjuntos brilhantes [5]. A maioria são CD56

células dim que, principalmente, exercer citotoxicidade potente [6]. Em contraste, CD56

células brilhantes mediar baixa citotoxicidade, mas adquirir uma maior actividade citolítica de CD56

células dim em cima de ativação devido à liberação de citocinas pró-inflamatórias, tais como IFN-γ [7]. O nível de IFN-γ, isto é, NKA, é geralmente associada com o prognóstico oncológico, o que implica o papel essencial da expressão diferencial subconjunto de células NK na regulação imunológica de células de tumor [8]. NKA mostrou servir um papel importante na vigilância e na eliminação de células de tumor [9]. Estudos têm mostrado que a baixa NKA conduz a níveis elevados de ocorrência de tumores e metástases, e que o seu grau correlaciona com a invasividade de malignidade [10]. Pelo contrário, alta NKA foi mostrado para correlacionar com uma incidência mais baixa de tumores, e sua infiltração em certos tumores, ou seja, o melanoma, cabeça e pescoço escamosas carcinomas de células, é um indicador de um resultado melhor oncológico [11], [12] .

Há evidências de que uma resposta imune prejudicada é um fator crucial na patogênese do câncer de próstata (PCA) [13], [14]. A disfunção de células NK tem sido implicada em CaP juntamente com uma variedade de tumores [15], [16]. Apesar de vários mecanismos propostos, incluindo número reduzido, citocinas imunossupressoras, e receptor desequilíbrio repertório, a fisiopatologia da disfunção das células NK em CaP não é totalmente compreendido [5]. Em relação ao papel de NKA na supressão de tumores, potenciando os mecanismos de células NK pode ser claramente um componente importante para a imunoterapia bem sucedida contra CaP. Antígeno prostático específico (PSA) é o marcador sorológico mais amplamente utilizado que revolucionou a detecção precoce e gestão de CaP. No entanto, a relativa falta de câncer especificidade e falta de um valor limite superior ou inferior são os principais inconvenientes.

Para resolver estas questões, NKA e as distribuições de CD56

dim e CD56

subconjuntos brilhantes foram analisados ​​entre pacientes e controles APC. Nossas descobertas indicam que immunoregulation no PCA é prejudicada devido a uma redução da NKA precedida de redistribuição de subpopulações de células NK. Além disso, a avaliação do desempenho de diagnóstico de NKA revelou que ele pode ser aplicado como um marcador de suporte, além de PSA.

Materiais e Métodos

1. Pacientes e controles

Esta análise transversal prospectivo envolveu 51 pacientes com diagnóstico recente de-biópsia comprovada CaP devido a uma elevação de PSA observado em exames de saúde de março a dezembro de 2012. Os 54 controles pareados por idade eram auto-Ofereceu indivíduos saudáveis, cuja próstata de volume, PSA e DRE estavam dentro dos limites aceitos normais. Nenhum dos pacientes havia recebido tratamento prévio para APC, eram conhecidos por terem imunológica ou outras condições malignas, e estavam todos livres de infecção ativa ou inflamação, avaliada pela contagem de glóbulos brancos 10.000 células /mL e proteína C-reativa 1,0 mg /L (Tabela 1). Todos os controles estavam isentos de condições inflamatórias, sem exposição prévia a agentes imunossupressores. aprovação independente foi obtido a partir de Comissão de Ética Yonsei University (4-2011-0660), com todas as amostras de sangue coletadas após a obtenção do consentimento informado antes da prostatectomia radical. Todos os participantes forneceram consentimento para participar do estudo atual escrito.

2. Células NK Atividade

A atividade citotóxica das células NK foi determinada utilizando o NK Vue-Kit® (ATGen, Sungnam, Coreia). foi recolhido sangue total usando BD Vacutainer® heparina

tubos N1. 1 ml de sangue total foi incubada durante 24 horas, a 37 ° C, sob 5% de CO

2 com a dose indicada de Promoca® e 1 ml de meio RPMI 1640. Os sobrenadantes isentos de células foram recolhidos, e os níveis de IFN-y foram determinados de acordo com os protocolos do fabricante.

3. Células NK subconjunto Distribuição

3.1. Preparação de PBMCs.

3 ml de sangue venoso heparinizado foi obtido e analisado dentro de 4 horas de recolha. CMSPs foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade, utilizando tubos de preparação de células CPT ® (BD Vacutainer®) a 1600 g durante 20 min a 20 ° C. As PBMCs foram recolhidas (1-2 × 10

6 células /ml) foram lavadas e ressuspensas em 5% de soro fetal de bovino (FBS) + soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).

3,2. coloração de anticorpos.

para a expressão de CD3, CD16, e CD56 sobre as células NK, as PBMC foram marcadas com Alexa-anti-CD3, PE-anti-CD16, e FITC-anti-CD56 anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromos (BD Biosciences). Após a coloração durante 30 minutos a 4 ° C, as células foram extensamente lavadas e fixadas em 1% de paraformaldeído-PBS até avaliação.

3,3. Citometria de fluxo.

Para determinar a percentagem total de células NK fechado na CD3

-CD56

+ população de células, pelo menos 10.000 células alvo foram adquiridas pela LSRII citometria de fluxo (BD Biosciences). A distribuição de CD16

+ CD56

células NK dim e CD16

-CD56

células NK brilhantes fechado do CD3

-CD56

+ população de células é apresentada como a percentagem do total células NK. Para cada amostra, os dados foram analisados ​​por FlowJo 8.1.1.1 (Árvore Star, Inc., Ashland, OR, EUA).

4. Fase de classificação cancro

CaP encenação foi determinada de acordo com o 7

th Comité Misto Americana do Câncer (AJCC) sistema TNM. distribuição de palco e características patológicas são apresentados na Tabela 2. Patologia foi confirmada por um único patologista.

5. Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste de Mann-Whitney ao comparar dados de dois grupos não pareados e testes de Kruskal-Wallis com correção de Bonferroni post-hoc quando se comparam mais de dois grupos. A precisão da NKA e CD56

dim-to-CD56

rácio brilhante na detecção de CaP foi determinada pelo funcionamento do receptor área sob a curva (AUC) características derivadas. análise de correlação foi utilizado para avaliar associações entre NKA, CD56

dim-to-CD56

relação brilhante, e as variáveis ​​clínico-patológicas. As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS (v.18.0).

Resultados

1. Dados Demográficos

Todos os pacientes e controles foram clinicamente e patologicamente investigado com relação aos fatores apresentados na Tabela 1. Os fatores que podem influenciar o próprio status imune que se manifesta há diferenças entre os grupos.

2. Frequência de células NK e Distribuição de CD56

dim e CD56

brilhantes subpopulações de células NK

Os dados de citometria de fluxo Representante mostra a distribuição da população de células NK total representou como CD3

-CD56

+ células (Fig. 1A) e dois subconjuntos principais, CD16

+ CD56

dim e CD16

-CD56

brilhante, expresso como uma percentagem do total de células NK (Fig. 1B). Total de frequências circulantes NK não foi diferente entre pacientes e controles, ou entre grupos de estágio de câncer (Fig 2A;. Tabela 2). No entanto, uma redução preferencial na frequência de CD56

células vivas foi observado em pacientes. Além disso, CD56

células brilhantes tendem a diminuir gradualmente de acordo com a progressão do cancro fase, isto é, extensão extracapsular, ou metástase LN órgão adjacentes (Fig 2B;. Tabela 2). A CD56 significativamente maior

dim-to-CD56

proporção de células NK brilhante foi observado em pacientes comparados aos controles, com tendência para aumentar de acordo com a progressão da fase (

p Compra de tendência =

0,001

) (Tabela 2).

(B) dados de citometria de fluxo representativos de duas principais subpopulações de células NK detectados no sangue periférico. À esquerda, caixa superior: CD16

+ CD56

dim subconjunto de células NK. Certo, caixa inferior:. CD16

-CD56

brilhante subconjunto de células NK

não se observaram diferenças significativas de população total NK entre pacientes e controles, e dentro de grupos de estágio. (B) Boxplot diagramas mostrando resultados de citometria de fluxo de distribuição de CD56

CD56

distribuição dos três grupos brilhantes dim e dentro de células NK totais entre controles e pacientes, agrupados de acordo com o estágio do câncer. * P 0,05, ** p 0,01 em relação aos controles

3.. Células NK Actividade

Os resultados obtidos são apresentados na Fig. 3 e Tabela 2. Conforme indicado, os pacientes apresentaram significativamente menor NKA. De acordo com a progressão fase, aqueles com estágios mais elevados mostraram uma maior redução da NKA (

p Compra de tendência

0.001

).

** p 0,01 em relação ao controles.

4. A análise por ROC Curves

curvas ROC e melhores valores de corte foram utilizados para calcular a sensibilidade e especificidade dos parâmetros relacionados à células NK (Tabela 3). A sensibilidade e especificidade da NKA no que diz respeito à detecção de CaP foram de 72% e 74%, respectivamente, enquanto que o CD56

dim-to-CD56

índice de célula brilhante mostrou uma sensibilidade de 66% e uma especificidade de 71% ( A Fig. 4A). Em análises posteriores, a sensibilidade e especificidade da NKA foram determinados de acordo com dois valores de PSA agrupados como 4 a 10 ng /ml, que é a zona cinzenta de diagnóstico, e níveis superiores a 10 ng /ml. Num conjunto especificidade de 74%, NKA para os valores de PSA dentro da zona cinzenta mostrou uma sensibilidade mais elevada (73% vs 70%) e a AUC (0,82 ± 0,06 vs 0,76 ± 0,07) em relação ao PSA valores superiores a 10 ng /mL (Fig. 4B).

(AUC = Área Sob a Curva). curvas (B) ROC comparando as performances de medição da actividade de células NK de acordo com o PSA como agrupadas; 4 a 10 ng /ml e superiores a 10 ng /ml. (AUC = Área Sob a Curva).

5. NK atividade celular e CD56

dim-to-CD56

Rácio celular brilhante Segundo as Variáveis ​​clínicopatológicos

NKA apresentou correlações negativas com PSA, o estágio do câncer, eo CD56

dim-a-CD56

rácio brilhante. Por outro lado, CD56

índice de célula de dim-de-CD56 brilhante mostraram correlações positivas com PSA e estágio do câncer (Tabela 4). NKA e CD56

dim-to-CD56

rácio brilhante foi comparada entre controles e pacientes agrupados de acordo com as variáveis ​​clínico-patológicas (Tabela 5). Embora CD56

dim-to-CD56

rácio brilhante falhou para discriminar pacientes com Gleason pontuação 7 e aqueles sem extensão extracapsular de controles, todos os outros subgrupos foram distinguível de controles por NKA e CD56

dim-to -CD56

rácio brilhante. Análise entre os subgrupos de pacientes revelou significativamente maior CD56

dim-to-CD56

rácio brilhante em pacientes com patologicamente confirmada metástases LN (

p = 0,043

; dados não mostrados).

Discussão

o objetivo do presente estudo foi o de esclarecer o papel das células NK na resposta imune contra o CaP. Vários mecanismos de desenvolvimento e progressão CaP têm sido propostos, incluindo hormonal, alterações metabólicas, e a resposta imune [6], [17]. Existem provas acumuladas de que as populações de linfócitos diferentes são envolvidas na imunossupressão mediada por células que leva à ocorrência e progressão de CaP [13], [18], [19]. No entanto, existe pouca informação sobre o papel funcional das células NK na resposta imune a CaP. Para abordar esta questão, investigamos NKA como um marcador para níveis de IFN-γ e a distribuição de subpopulações de células NK em pacientes APC. Os resultados do nosso estudo indicam que prejudicada NKA é presumivelmente precedida por uma redução no CD56

células brilhantes, e que o nível de NKA poderia ser utilizada como um marcador de diagnóstico auxiliar para a PSA.

1. Redução preferencial de CD56

brilhantes células NK em pacientes CaP

As células NK são funcionalmente classificadas em CD56

dim e CD56

subconjuntos brilhantes. CD16

+ CD56

células dim são células efetoras com altas quantidades de grânulos citolíticos que expressam citotoxicidade potente contra células tumorais [4]. CD16

-CD56

células brilhantes libertar citocinas pró-inflamatórias, tais como IFN-γ que acciona os mecanismos inflamatórios que regulam a iniciação do tumor, immunoevasion, a sobrevivência, crescimento e [20], [21]. Descobertas recentes revelaram que CD56

células vivas constituem a maioria das células NK em tecidos linfóides e que eles não são apenas uma subpopulação menor entre as células NK, mas são precursores imaturos de CD56

dim células [22]. Este trabalho enfoca este subconjunto particular, sobre a sua importância na regulação da resposta mediada por células NK contra células tumorais

.

Investigação sobre padrões de distribuição de subpopulações de células NK revelou uma diminuição significativa de CD56

células vivas, sem alteração de CD56

células dim. Estudos anteriores sobre vários hospedeiros portadores de tumor têm relatado inter-relações ao invés distintas entre CD56

dim e CD56

subconjuntos brilhantes. Em contraste com os nossos resultados, uma redução CD56

células fracas sem alteração de CD56

células vivas foi observado no câncer gástrico e do esôfago [23]. Por outro lado, foi observada uma redução no CD56

células vivas em cancros da mama, cabeça e pescoço, e uma distribuição igual de CD56

células dim em APC; resultados que são consistentes com o presente estudo [7], [17].

2. Alteração de CD56

brilhantes células NK como um mecanismo de resposta a Tumor Microenvironment

O nosso estudo observou principalmente uma redução preferencial do CD56

células vivas, sem alteração do CD56

células dim. Embora a causa subjacente ainda não foi claramente definido, duas possíveis explicações pode ser levantada; processo de maturação e do processo de recrutamento.

Como mencionado, CD56

células brilhantes são aceitos como precursores de CD56

células dim, com cada subconjunto representando um estágio de maturação distinta [24]. Possivelmente, uma procura excessiva de células efetoras em resposta ao tumor pode ter provocado uma transição de CD56

células brilhantes imaturos em CD56

células dim. Uma explicação semelhante tem sido proposta para a redução de CD56

células vivas em pacientes com cancros da cabeça e pescoço [7]. No entanto, isso pressupõe um aumento concomitante de CD56

células fracas, o que não foi observado no presente estudo.

Uma explicação alternativa, sem demonstração é que CD56

células brilhantes periféricos podem ter sido recrutado para linfóide locais de tecido como linfonodos metastáticos para adquirir citotoxicidade. Esta ideia foi baseada em observações anteriores de que CD56

células brilhantes preferencialmente se acumulam na área das células T dos linfonodos até ser activada para produzir citocinas pró-inflamatórias [7], [22,22]. Além disso, a observação de que CD56

células vivas isoladas de linfonodos humanos tornam-se fortemente citotóxico após estimulação por IL-2 sugere que as células NK recrutados para LNs pode representar uma piscina imaturas de células efectoras [25]. A CD56 significativamente maior

dim-to-CD56

índice de célula brilhante em pacientes com patologicamente confirmada metástases LN foi observada em nosso estudo, o que implica que estas células circulantes podem ter sido recrutado para linfonodos patológicos ou secundários em resposta ao tumor. Isto é relevante porque linfonodos são geralmente os locais metastáticos primárias e CD56

células brilhantes são o subconjunto principal encontrado em linfonodos que combatem as células metastáticas [26]. Para confirmar este problema, seria interessante examinar se CD56

células vivas são acumulados em linfonodos metastáticos seguinte LN dissecção.

3. NK disfunção da célula como consequência da redução do CD56

Células NK brilhantes

NKA foi investigada para determinar a influência da redução do CD56

células brilhantes sobre a actividade citolítica contra células tumorais. Paralelamente a observações com CD56

células vivas, NKA foi observada a ser menor em pacientes APC, juntamente com uma tendência para diminuir gradualmente de acordo com a progressão de estágio do câncer. Estes achados são consistentes com relatórios anteriores que mostraram NKA é comprometida de um amplo espectro de tumores sólidos e hematológicos [8], [10], [27]. Vários mecanismos de NKA comprometida têm sido propostas, tal como a diminuição do número de células NK-se infiltram no tumor [23], aumento de receptores de superfície para os factores imunes supressoras [28], e a inactivação de células efectoras [10].

Correlações observada entre NKA e CD56

dim-to-CD56

índice de célula brilhante pode ser de relevância direta para sugerir um mecanismo adicional que fraca NKA é uma consequência da redução CD56

células vivas. CD56

células vivas são conhecidas por serem as principais fontes de IFN-γ [22], como observado em

in vitro

estudos onde CD56

células vivas foram mostrados a proliferar, preferencialmente, em co-cultura com imatura as células dendríticas e lipopolissacáridos de produzir IFN-γ [29]. Além disso, a estimulação de CD56

células brilhantes com células de carcinoma transduzidas resultou numa capacidade melhorada para a produção de IFN-γ e conferir alta citotoxicidade [6]. Além disso,

In vivo

estudos têm mostrado que tonsilares CD56

células vivas produzem IFN-γ antes da maturação em células efectoras [25]. Por outro lado, foi observada uma redução de CD56

células brilhantes para induzir a secreção diminuída de IFN-γ em pacientes com rinite alérgica [30]. Considerando estes resultados favoráveis ​​que a secreção de IFN-γ depende diretamente CD56

células vivas, sugerimos que a redução do CD56

células vivas é um mecanismo potencial envolvidos na baixa NKA, o que leva a citotoxicidade prejudicada contra células APC.

4. Células NK atividades, um marcador diagnóstico de suporte para PSA

curvas ROC revelou que NKA pode servir como um marcador de apoio para PSA no diagnóstico de CaP. Embora seja claro que a PSA fornece o maior valor de diagnóstico para a APC, uma limitação principal é a sua falta de especificidade-cancro que provoca riscos e custos desnecessários, especialmente na zona cinzenta de diagnóstico [31]. Embora desafios em curso se esforçam para desenvolver novos métodos de detecção de CaP, nenhum claramente superadas os benefícios contra inconvenientes [14]. Esta investigação levanta a possibilidade de que NKA pode ser utilizado em combinação com PSA para fornecer um valor de diagnóstico adicionais, especialmente para aqueles dentro da zona cinzenta de diagnóstico.

Este estudo foi baseado em controles versus pacientes diagnosticados com CaP devido à elevada PSA em um exame de saúde de rotina. Portanto, a ausência de pacientes APC com PSA normal ( 4 ng /ml) era a principal limitação deste estudo, o que dificultava uma comparação directa do rendimento diagnóstico entre PSA e NKA. Um estudo populacional prolongado é necessário para confirmar os nossos resultados preliminares e para avaliar custo-eficácia.

Conclusões

Este estudo observacional proporcionados novos achados que CD56

células brilhantes servem um papel importante na adaptação resposta contra células APC. Essa noção se presta mais apoio que os estudos longitudinais sobre vigilância imunológica das células NK claramente merece pesquisas adicionais para potencialmente levar a novas estratégias de imunoterapia para melhorar resultados oncológicos de CaP.