Abstract
Fundo
O vírus eritroblastose E26 transformar sequências (
ETS
) da família de fatores de transcrição consiste em um grupo altamente conservado de genes que desempenham papéis importantes no celular proliferação, diferenciação, migração e invasão. translocações cromossómicas fusão fatores ETS aos promotores de genes que respondem a androgénios foram encontradas em cancros da próstata, incluindo as formas clinicamente mais agressivos. ERG e ETV1 são as proteínas ETS mais comumente translocados. A sobre-expressão destas proteínas em células de cancro da próstata em resultado de um fenótipo mais invasiva. A inibição da actividade ETS por inibidores de moléculas pequenas podem proporcionar um novo método para o tratamento de cancro da próstata.
Métodos e Descobertas
Recentemente, demonstrou que a molécula pequena YK-4-279 inibe a actividade biológica de ETV1 em células de câncer de próstata de fusão-positivos que levam à diminuição da motilidade e invasão
in-vitro
. Aqui, apresentamos dados de um
vivo em
modelo de xenoenxerto mouse. ratinhos SCID-bege foram implantados subcutaneamente com tumores PC-3M-luc-C6 fusão-negativo fusão-positiva LNCaP-Luc-M6 e. Os animais foram tratados com YK-4-279, e foram avaliados os seus efeitos sobre o crescimento do tumor primário e de metástases do pulmão. YK-4-279 tratamento resultou na diminuição do crescimento do tumor primário apenas em LNCaP-Luc-M6 coorte. Quando os tumores primários foram cultivadas até tamanhos comparáveis, YK-4-279 metástase tumoral inibido para os pulmões. Expressão de genes alvo ETV1 MMP7, FKBP10 e GLYATL2 foram reduzidos em YK-4-279 animais tratados. ETS fusão-negativo xenoenxertos PC-3M-luc-C6 foram insensível ao composto. Além disso, YK-4-279 é uma molécula quiral que existe na forma de uma mistura racémica dos enantiómeros R e S. Nós estabelecemos que (S) -YK-4-279 é o enantiómero activo em células de câncer de próstata.
Conclusão
Nossos resultados demonstram que YK-4-279 é um potente inibidor de ETV1 e inibe tanto o crescimento do tumor primário e de metástases de fusão xenoenxertos de cancro da próstata positivo. Portanto, YK-4-279 ou compostos semelhantes pode ser avaliada como um potencial instrumento terapêutico para o tratamento de cancro da próstata humana em diferentes fases
citação:. Rahim S, T Minas, Hong SH, S Justvig, H Çelik , Kont YS, et ai. (2014) uma pequena molécula inibidor da ETV1, YK-4-279, impede o crescimento do cancro da próstata e Metástase em um xenoenxerto Modelo Mouse. PLoS ONE 9 (12): e114260. doi: 10.1371 /journal.pone.0114260
editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América
Recebido: 21 de maio de 2014; Aceito: 05 de novembro de 2014; Publicação: 05 de dezembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Rahim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Estas experiências foram apoiados principalmente por uma concessão do Departamento de Programa de Pesquisa de Defesa Congressionally Directed Médica (PC111510, PI: Aykut uren, http: //cdmrp.army.mil/). Os experimentos farmacocinéticos foram apoiadas pela Analytical Farmacologia Núcleo do Centro de Câncer Sidney Kimmel Comprehensive na Universidade Johns Hopkins (NIH subvenções P30 CA006973 e UL1 RR025005, eo Shared Instrumento Grant (1S10RR026824-01), https://grants.nih.gov/subvenções /oer.htm). experimentos Biacore foram feitas no Resource Genómica e Epigenomics compartilhada, que é apoiado por CA051008-16 CCSG Grant P30 (Lou Weiner, PI), https://cancercenters.cancer.gov/grants_funding/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e os autores deste manuscrito ter a seguinte competindo interesses: USPTO concedidos para YK-4-279 para a Universidade de Georgetown, inventores incluir. Y.K., M. B., J.T. e A.U. Um contrato de licença foi executado entre a Universidade de Georgetown e Tokalas Inc para essas patentes, em que J.T. é uma parte do titular fundador. Georgetown University apresentou pedidos de patentes sobre a YK-4279, bem como compostos relacionados e derivados de tais moléculas. Abaixo está um resumo dos pedidos de patentes emitidas e pendentes relativos a esses compostos. I. “Segmentação de EWS-FLI como terapêutica anti-tumoral” (GU Referência # 2006-041) 1. Aplicação US Provisória (60 /877.856) apresentou 29 de Dezembro de 2006. 2. PCT /US07 /089,118 arquivado 28 de dezembro de 2007 . 3. aplicação US provisória (61 /177.932) apresentou 13 de maio de 2009. 4. US Non-provisória 12 /494,191 arquivado 29 de junho de 2009 ((CIP) reivindicando a prioridade tanto para o PCT e dos Estados Unidos pedidos provisórios; entrada de fase nacional do PCT); emitido como a Patente dos EUA 8.232.310. 5. US Non-provisória 12 /720,616 arquivado 09 de março de 2010 (CONT). 6. Europa 07.872.364,0 arquivado 28 de dezembro de 2007 (entrada de fase nacional do PCT). 7. Canadá 2.711.003 arquivada 28 de dezembro de 2007 (entrada de fase nacional do PCT). 8. Austrália 2007341977 arquivado 28 de dezembro de 2007 (entrada de fase nacional do PCT). 9. Provisório dos Estados Unidos 61 /405,170 arquivado 20 de outubro de 2010 (contém dados adicionais). 10. Europa 13.186.704,6 divisional da Europa 07.872.364,0 prioridade a 28 de dezembro de 2007. II. “Métodos e composições para o tratamento Ewings Sarcoma família de Tumores” (GU Referência # 2012-019) 1. Patente Provisória US Aplicação 61 /623,349 arquivado 12 de abril de 2012. 2. Patente do Tratado de Cooperação PCT /US2013 /036.234 depositada em abril 11, 2013. III. “Métodos e composições para tratar o cancro” (GU Referência # 2014-012) 1. Patente Provisória US Aplicação 61 /895.308 depositado em 24 de outubro de 2013. Todos os dados do manuscrito estão disponíveis gratuitamente. Os autores reconhecem e siga todas as PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento. Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
cromossômica rearranjo é um mecanismo comum oncogênese condução em sarcomas e malignidades hematológicas [1]. Recentemente, fusões envolvendo as sequências E26 transformadoras vírus eritroblastose (
ETS
) da família de fatores de transcrição foram descobertos em tumores de câncer de próstata [2]. O
ETS
família de factores de transcrição é um grupo altamente conservadas de genes que consistem de 27 membros, muitos dos quais têm sido mostrados para desempenhar papéis importantes na iniciação da doença, a progressão, diferenciação, migração, angiogénese e invasão [3] , [4]. ETS proteínas partilham uma homologia significativa com o outro e contêm um C-terminal de
ETS
domínio que está envolvido na ligação de ADN e um domínio N-terminal PNT envolvidos em interacções de proteína [5]. rearranjos cromossômicos envolvendo fatores ETS em células de câncer de próstata colocá-los sob regulação direta dos promotores de genes que respondem a androgénios, ativando assim a sua expressão em resposta a andrógenos. Ao contrário dos produtos de proteína de translocações cromossômicas em leucemias e sarcomas, rearranjos do gene no câncer de próstata não criar proteínas de fusão quiméricas. Em vez disso, a maioria das translocações cromossómicas e rearranjos de genes envolvendo ETS fatores no resultado câncer de próstata em expressão de um comprimento total ou quase proteínas da família ETS completos.
As translocações envolvendo ERG e ETV1 constituem a maioria dos rearranjos ETS encontrados no cancro da próstata . Considerando ERG é predominantemente fundida com promotor TMPRSS2, ETV1 pode ser rearranjada com a região 5 ‘de vários genes, tais como TMPRSS2, SLC45A3 e HNRPA2B1 [2], [6].
ETV1
translocação resulta na expressão de completo ou ETV1 truncada N-terminal [7]. A sobre-expressão de ETV1 em benignos epiteliais prostáticas-linhas celulares resulta na indução de um subconjunto de genes envolvidos na migração e invasão [6]. ETV1 também aumenta a expressão de genes alvo AR, bem como genes envolvidos na biossíntese de esteróides e metabolismo. A cooperação com outros eventos oncogênicos, como perda de PTEN, predispõe as células da próstata ETV1 expressar a evoluir para um fenótipo de doença mais agressiva [8], [9]. Estudos em modelos murinos sugerem que a expressão ETV1 é uma causa subjacente da iniciação do cancro da próstata. ratinhos transgénicos ETV1 desenvolver a neoplasia intraepitelial prostática. Além disso, a combinação de expressão ETV1 com lesões genómicas pré-existentes, tais como a perda de PTEN, resultam no desenvolvimento de adenocarcinoma invasivo [10], [11].
recentemente relatado que YK-4-279, um inibidor de EWS-FLI1 oncoproteína em Ewings sarcoma, também inibe a atividade de ERG e ETV1 em células de câncer de próstata
in-vitro
, resultando em fenótipos reduzidas migratórias e invasivos [12], [13]. Com base em nossa prévia
in-vitro
investigações, foi testada a capacidade anti-metastático de YK-4-279 em um rato modelo de xenotransplante. Os animais tratados com YK-4-279 tinha reduzido o crescimento de tumores e metástase do tumor a partir de locais primários para os pulmões reduzida. Nós também demonstram que os efeitos da YK-4-279 sobre ETV1 e linhas celulares de cancro da próstata são enantioespec�ica e enantiómero (S) -YK-4-279 é o componente activo confirmando resultados semelhantes em outros modelos de tumores [14].
resultados e Discussão
YK-4-279 é uma pequena molécula antagonista de ETV1
inicialmente focada em avaliar os efeitos de YK-4-279 em metástase de tumor
em -vivo
, desde a nossa
in-vitro
experimentos com linhagens de células de câncer de próstata sugeriu que inibe principalmente motilidade e invasão [13]. Para testar a eficácia de YK-4-279
in-vivo
, utilizamos um modelo de rato de xenotransplante [15], [16]. linhas de LNCaP-Luc-M6 e de células de cancro de próstata PC-3M-luc-C6 são geradas por transfecção estável de células LNCaP parentais e células PC-3 com um vector expressando o gene da luciferase. As células são injectadas subcutaneamente abaixo do flanco dorsal, em 8-10 semanas /ratos masculinos velhos bege SCID. Metástase pulmonar pode ser observada a partir de 6-7 semanas após a implantação do tumor nestes animais [15], [16].
anteriormente demonstrado que a inibição da actividade biológica ETV1 em células LNCaP resulta em diminuição da migração e invasão sem afectar o crescimento em cultura [13]. As linhas celulares utilizadas no estudo foram adquiridos comercialmente de uma fonte diferente do que o nosso trabalho anterior e sofreu pressão seletiva para obter clones de luciferase expressando estáveis. Nós primeira validado o efeito de YK-4-279 sobre essas células antes de prosseguir para
in-vivo
modelos. células LNCaP contêm uma translocação genética onde todo o locus ETV1 é inserido no último intrão da região MIPOL1 específico da próstata no cromossoma 14. Verificou-se a presença de translocação ETV1 em células LNCaP-Luc-M6 por PCR de ADN genómico utilizando iniciadores que flanqueiam o local de recombinação (Fig. 1a). ETV1 rearranjo era exclusivo de células LNCaP-M6-Luc e não está presente nas células PC-3M-luc-C6. Assim, a linha de células PC-3M-luc-C6 foi escolhido como um controlo negativo para os nossos estudos.
a) O ADN genómico a partir de células da próstata foi analisado para o estado ETS rearranjo através da realização de PCR utilizando iniciadores específicos de rearranjo. células-M6 LNCaP-luc abrigava ETV1 rearranjo enquanto que as células PC-3M-luc-C6 foram fusion-negativo. b) as células LNCaP-Luc-M6 foram tratados com níveis gene alvo YK-4-279 durante 48 horas e ETV1 1 uM foram avaliados por PCR em tempo real quantitativa. YK-4-279 tratamento resultou na diminuição da expressão do gene de MMP7, MMP13, GLYATL2 e FKBP10, sem redução significativa nos níveis de ETV1. *; p 0,01, n.s .; não-significativo, o teste t de Student não pareado. c) LNCaP-Luc-M6 e PC-3M-luc-C6 foram pré-tratadas com 1 uM YK-4-279 durante 48 horas. Um ensaio de quimiotaxia com base impedância eléctrica foi utilizado para monitorizar a migração celular na presença de YK-4-279 no sentido da câmara inferior com 10% de gradiente de FBS. YK-4-279 inibiu a migração de LNCaP-Luc-M6, mas não as células PC-3M-luc-C6. *; p 0,005, N.S .; não-significativo, o teste t de Student não pareado. d) motilidades de células no final do período de 24 horas foram calculados com base em seus valores de índice de célula relativas. *; p 0,01, n.s .; não-significativo, o teste t de Student não pareado.
Nós tratada células LNCaP-luc-M6 com uma dose sub letal (1 M) de YK-4-279 por 48 horas e expressão avaliada de endógeno genes-alvo ETV1 por PCR em tempo real quantitativa. Estamos focados em alvos conhecidos ETV1 que estão implicados na patogênese da próstata [17] – [19]. A exposição de células de LNCaP-Luc-M6 a 1 uM YK-4-279 resultou em níveis significativamente reduzidos de mARN de vários genes alvo ETV1, incluindo MMP7, MMP13, FKBP10 e GLYATL2, sem afectar a expressão de ETV1 (Fig. 1b).
em seguida, foi realizado um ensaio de quimiotaxia baseados em impedância eléctrica para determinar os efeitos de YK-4-279 sobre a motilidade das células LNCaP-Luc-M6 e PC-3M-luc-C6. Esta técnica envolve a utilização de uma configuração de Boyden Secção semelhante com sensores microelectrónicos integrados sob uma membrana microporosa de polietileno tereftalato (PET). Os sensores de impedância eléctrica gravar como células migram da câmara superior, através da membrana, e para dentro da câmara inferior, em resposta a um quimioatractor. Esta técnica permite a monitorização em tempo real da migração celular como aumentos na impedância eléctrica correlacionam com o aumento do número de células que migraram para a câmara inferior. YK-4-279 tratamento de células LNCaP-Luc-M6 resultou numa diminuição significativa na migração das células, enquanto que nenhum efeito foi observado sobre a motilidade da linha celular de controlo negativo, o PC-3M-luc-C6 (Fig. 1c e 1d). Estes resultados confirmam que as células LNCaP-luc-M6 e PC-3M-luc-C6 disponíveis comercialmente tinha os mesmos fenótipos e YK-4-279 perfis de resposta como LNCaP e células PC-3 que usamos em nossos estudos anteriores.
YK-4-279 inibe o crescimento do tumor
In-vivo
YK-4-279 experiências de tratamento foram feitas em dois formatos diferentes: 1) experimentos tratamento precoce, onde YK-4 -279 administração foi iniciada no dia após o implante de xenotransplante. 2) experimentos tratamento tardio, onde a administração YK-4-279 iniciados somente depois que o tumor xenoenxerto primário atingiu a um tamanho palpável (aproximadamente 200 mm
3). Estas duas abordagens nos permitiu avaliar os efeitos da YK-4-279 no tumor-se tomar, crescimento e metástase pulmonar tanto antes da formação de tumores bem estabelecidos, bem como após a formação do tumor palpável.
Nós estabelecemos próstata xenoenxertos por injecção subcutânea de células LNCaP-Luc-M6 ou PC-3M-luc-C6 no flanco dorsal de ratinhos bege SCID /. No estudo de tratamento precoce, foi iniciado o uso de drogas intraperitoneal com 75 mg /kg YK-4-279 ou veículo de controle do dia após a injecção de células tumorais. Os animais foram tratados 3 vezes por semana e os volumes dos tumores medido semanalmente. O estudo foi terminado ao fim de 14 semanas para o grupo de LNCaP-Luc-M6 e 6 semanas para o grupo PC-3M-luc-C6, devido à taxa de crescimento relativamente mais rápido de células PC-3M-luc-C6. Enquanto que apenas 4 dos 13 ratinhos que foram injectados por via subcutânea com células LNCaP-Luc-M6 e tratados com YK-4-279 desenvolveram tumores, em contraste, 9 dos 13 animais do grupo de controlo de veículo desenvolveram tumores. Sem essa diferença estava presente na coorte de PC-3M-luc-C6 fusão-negativa (Fig. 2). Em animais que desenvolveram tumores, houve uma redução significativa no tamanho do tumor em YK-4-279 grupo tratado em comparação com controlo de DMSO. A redução no tamanho do tumor só estava presente no grupo-M6 LNCaP-Luc e não observados com xenoenxertos PC-3M-luc-C6 (Fig. 3a). Nosso antes
in-vitro
investigações revelaram que a inibição ETV1 por YK-4-279 leva a uma redução da motilidade e invasão sem afetar o crescimento e sobrevivência celular. Por isso, não esperávamos ver uma diferença na captação de tumor ou a taxa de crescimento do tumor primário nestes animais. O experimento tratamento precoce foi concebido para medir a metástase do pulmão, e todos os animais foram sacrificados no ponto final pré-determinada (6 semanas para PC-3M-luc-C6 e 14 semanas de LNCaP-Luc-M6) para colher tecidos para análise posterior.
xenoenxertos de próstata foram estabelecidos por injecção subcutânea de células abaixo do flanco dorsal de ratos machos com 8-10 semanas de idade SCID /beige. Os animais foram tratados com o peso de 75 mg /kg de corpo YK-4-279 três vezes por semana, começando no dia após as injecções de xenoenxerto. animais-M6 LNCaP-luc tratados com o composto apresentado uma diminuição na formação do tumor (4/13) comparado com o controlo de veículo (9/13). animais PC-3M-luc-C6 não apresentam diferença significativa na formação de tumores entre o composto tratado (12/13) e de controle do veículo (13/13) animais. *; p 0,05, n.s .; não-significativo, o teste t de Student não pareado.
a) SCID camundongos /bege foram injectados por via subcutânea com células LNCaP-luc-M6 ou PC-3M-luc-C6 abaixo do flanco dorsal. No grupo de estudo tratamento precoce, os animais foram injectados com 75 mg /kg YK-4-279 a partir do dia após a injecção de xenoenxerto. b) Um outro conjunto de animais começaram a receber tratamento YK-4-279 uma vez que os tumores eram palpáveis (aproximadamente 200 mm
3). Estes animais foram divididos em 2 grupos separados: um grupo foi tratado três vezes por semana com 75 mg /kg YK-4-279 (tratamento tardio estudo de dose baixa). c) Um outro grupo foi tratado 5 vezes por semana com 150 mg /kg de composto (tratamento tardio estudo de dose alta). Os volumes dos tumores foram medidos semanalmente. YK-4-279 reduziu o crescimento do tumor em animais-M6 LNCaP-Luc, mas não em animais de PC-3M-luc-C6. *; p 0,01, **; p 0,001, ***; p 0,0001, N.S .; não-significativa.
Os estudos de tratamento final começou com a implantação de xenotransplante e perto acompanhamento. Quando os animais apresentaram um tumor palpável (aproximadamente 200 mm
3), foram randomizados para grupos YK-4-279 e do veículo de controlo (DMSO). O ponto final para o estudo tratamento tardio foi selecionado como o tamanho do tumor primário atingindo 2 cm
3 em todos os grupos, de modo que a carga metastática entre os grupos puderam ser avaliados com o tamanho do tumor primário igual em todos os grupos. Além disso, o estudo tratamento tardio foi repetido duas vezes com dois YK 4-279-diferentes doses; 75 mg /kg três vezes por semana e 150 mg /kg YK-4-279 cinco vezes por semana YK-4-279.
de crescimento de tumor primário foi significativamente reduzida no estudo de tratamento final, bem como (Fig. 3b ). Esta diferença foi reforçada quando a dose da droga e frequência foram aumentados (Fig. 3c). No grupo de dose elevada, no entanto, os animais começaram a mostrar sinais de hiperventilação e letargia, levando a uma redução da dose de 150 mg /kg administrada 4 dias por semana após semana 4 e 3 dias por semana após semana 8. O tratamento medicamentoso não afetou o crescimento taxa de xenoenxertos PC-3M-luc-C6 fusão-negativas em qualquer das doses.
Um grupo de amostras de tumor primário também foram avaliados para parâmetros histopatológicos (Fig. S1). As áreas de necrose de tumor foram identificados em H E lâminas coradas. Quantidade de proliferação de células foi determinado por imuno-histoquímica de Ki67 e a quantidade de apoptose foi determinada por coloração TÚNEL. tumores LNCaP, em geral, mostrou um aumento da necrose em resposta ao tratamento YK-4-279 no grupo de dose elevada (150 mg /kg). Da mesma forma observou-se uma redução da coloração de Ki67 em tumores LNCaP no grupo de tratamento. No entanto, essas diferenças de tumores LNCaP não foram estatisticamente significativas (Fig S2). Não houve diferença significativa em tumores PC3 para qualquer ensaio.
YK-4-279 inibe a metástase pulmonar em M6 LNCaP-luc animais de xenotransplante
Foi desenvolvido um ensaio total de base de células-lisado que aproveitou-se da expressão da proteína luciferase de quantificar com precisão a metástase de células cancerosas da próstata para os pulmões. O ensaio envolve a extracção da proteína a partir de lisados de pulmões, seguido por meio de medições de luciferase. Metástase de LNCaP-Luc-M6 e PC-3M-luc-C6 células para os pulmões resultados pode ser demonstrado em H secções de pulmão coradas E quando eles são suficientemente grande (Fig. 4A). No entanto, esta abordagem não é quantitativa e pode perder micro metástases especialmente em porções unsectioned do órgão deixada no bloco de parafina. É importante ter um ensaio suficientemente sensível para detectar a presença mesmo de o pequeno número de células de tumor da próstata nos pulmões. Foi construída uma curva padrão através da combinação em série de diluições de luciferase expressando células de cancro da próstata cultivadas em cultura com os tecidos pulmonares de ratinhos saudáveis (Fig. 4b). Utilizando este ensaio, fomos capazes de detectar tão pouco quanto 1 célula por miligrama de tecido de pulmão. Considerando-se uma massa média de 140 mg do pulmão, este ensaio tem um limite inferior de detecção de 140 de células de cancro da próstata por pulmonar [20]. Desde expressão de luciferase é o principal método utilizado para quantificar a metástase do tumor, foi realizada uma
in-vitro
ensaio de luciferase, utilizando doses de YK-4-279 que suprimem invasão, para demonstrar que o tratamento composto dose não afeta a expressão de luciferase em células LNCaP-Luc-C6 ou PC-3M-luc-C6. Nós também medido de expressão de luciferase em tumores primários extraídos a partir de animais tratados com a dose mais elevada de YK-4-279 ou veículo de controlo. tratamento com o composto não afetou a expressão de luciferase seja
in-vitro
ou
in-vivo
(Fig S3.)
a) H . secções de pulmão coradas E mostrando um micro -metastatic lesão em animais tratados com DMSO LNCaP-Luc-M6. b) Uma curva padrão foi construída para medir o limite de detecção do ensaio de luciferase. O ensaio é extremamente sensíveis, permitindo a detecção de uma única célula de cancro da próstata por miligrama de tecido de pulmão. c) Os pulmões foram colhidas a partir de animais de xenoenxerto de 15 minutos após o último composto ou do tratamento com veículo. Os lisados de proteína foram obtidas a partir dos tecidos e utilizadas para realizar um ensaio de luciferase. Os resultados foram normalizados para o peso do tecido. Compostos tratados animais de xenotransplante LNCaP-luc-M6 exibido significativamente reduzido metástase pulmonar em comparação com controlos de veículo. PC-3M-luc-C6 metástases do pulmão não foi afectada pelo tratamento com o composto. *; p 0,05, **; p 0,005, ***; p 0,0001, N.S .; não-significativo, o teste t de Student não pareado.
Em seguida, realizaram o mesmo ensaio de luciferase nos pulmões de animais de xenotransplante transportando tratados com YK-4-279 ou veículo de controlo. Em todas as experiências 3 (estudo tratamento precoce, tratamento tardio estudo de dose baixa, a dose de estudo de tratamento final elevada), o tratamento com o composto resultou numa redução significativa nas metástases de pulmão em LNCaP-Luc-M6 animais de xenotransplante, mas não no PC-3M-luc- animais C6 (Fig. 4c). Nós também utilizado um ensaio baseado em PCR para quantificar a metástase pulmonar na dose elevada coorte do estudo tratamento tardio, utilizando iniciadores específicos humanos para a ribonuclease P ARN componente H1 (RPPH1) e iniciadores de rato específicos que detectam o gene do receptor de transferrina (TFRC). Este ensaio confirmou as nossas observações anteriores revelando metástase pulmonar significativamente reduzida no grupo tratado com LNCaP-Luc-M6 YK-4-279 (Fig. S4) e validado que a medição da luciferase em tecido de pulmão era um método fiável. Em duas experiências (estudo de tratamento inicial e de dose estudo tratamento tardio alta), os pulmões foram colhidas a partir de animais de xenoenxertos de LNCaP-Luc-M6 que exibiam reduzidas tamanhos dos tumores primários no grupo de tratamento no momento da aquisição de tecidos (Fig. 3a e Fig. 3c ). Por isso, é possível que as diferenças de metástases pulmonares pode ser um resultado directo de menores volumes dos tumores nos grupos de tratamento. No entanto, o grupo de dose baixa estudo tratamento tardio tinham volumes tumorais semelhantes primário (2 cm
3) quando os tecidos foram recolhidos a partir dos animais (Fig. 3b). YK-4-279 reduzida metástase pulmonar nestes animais, bem como, sugerindo que o tratamento com droga afecta a metástase de tumores por inibição da actividade de ETV1, independente do tamanho do tumor primário.
Também foi avaliada a expressão do gene alvo ETV1 em tumores primários mediante tratamento YK-4-279. inibição ETV1 por YK-4-279 resultou em reduzida de MMP-7, expressão FKBP10 e GLYATL2, sem afectar os níveis de expressão ETV1 (Fig. 5a e Fig. 5b). Para determinar se as diferenças na resposta entre os animais de drogas PC-3M-luc-C6 LNCaP-Luc-M6 e é um factor de penetração do tumor diferencial do composto entre os dois grupos, foi medida a concentração de YK-4-279 no plasma e tumores de animais após a última dose de YK-4-279. ratinhos-M6 LNCaP-luc apresentado uma concentração média de 106,9 ± 64,1 ug /ml YK-4-279 no plasma e de 27,8 ± 14,5 ng /g no tumor de um tumor: razão de plasma de 0,30 ± 0,20. animais de PC-3M-luc-C6 demonstrado 174,8 ± 53,5 ug /ml YK-4-279 no plasma e de 23,3 ± 12,3 ng /g no tumor de um tumor: razão de plasma de 0,15 ± 0,10. Não houve diferença estatisticamente significativa na penetração de YK-4-279 entre os dois grupos quando comparados por um teste qui-quadrado.
a) RNA foi extraído de tumores do composto e veículo tratados LNCaP-luc- animais M6 (estudo de tratamento final de baixa dose) 15 minutos após a última injecção. Os níveis de expressão de genes foram determinadas por quantitativa PCR em tempo real. Os resultados foram normalizados para a expressão de rRNA 18S. As experiências foram realizadas em triplicado com 5 ratinhos por grupo analisados. YK-4-279 tratamento resultou na diminuição da expressão do gene de MMP7, GLYATL2 e FKBP10, sem redução significativa nos níveis de ETV1. *; p 0,05, n.s .; não-significativo, o teste t de Student não pareado. b) os níveis de expressão do gene alvo ETV1 em grupo de dose elevada estudo tratamento tardio. *; p 0,05, n.s .; não-significativo, o teste t de Student não pareado.
enantioespec�ica efeitos da YK-4-279
YK-4-279 tem um centro quiral e o composto racémico pode ser separado em seus enantiómeros S por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e R constituinte, cada enantiómero ou podem ser sintetizados individualmente. Em modelos de sarcoma de Ewings, o S-enantiómero tem sido estabelecido como o componente activo que inibe a EWS-FLI1, ao passo que o enantiómero R tem virtualmente nenhuma actividade específica [14], [21]. Testamos se o mesmo fenómeno é verdadeiro para a inibição da ETV1 em células de câncer de próstata. ressonância de plasma de superfície (SPR) experiências foram realizadas para determinar a ligação de YK-4-279 racémica e cada enantiómero individual para ETV1. Os compostos foram injectados ao longo de um superfície de um chip de Biacore contendo ETV1 recombinante. Racémica YK-4-279 e o S-enantiómero ligado a ETV1 enquanto que o enantiómero R apresentaram uma mais fraca ligação ao ETV1 (Fig. 6a). Em seguida, avaliou-YK 4-279 para o seu efeito sobre a actividade de transcrição ETV1 utilizando uma construção repórter de luciferase transientemente transfectadas, que contém uma região promotora mínima Id2 com dois sítios de ligação para ETV1. A co-transfecção de ETV1 e Id2 repórter em células COS-7 resultou num aumento da actividade da luciferase. A actividade do promotor foi reduzido por tratamento das células com YK-4-279 racémica e (S) -YK-4-279. No entanto, o (R) -YK-4-279 não inibem a actividade de transcrição ETV1 (Fig. 6b).
a) racémico YK-4-279, (R) -YK-4-279 e (S ) -YK-4-279 foram injetados sobre uma superfície de chip de Biacore contendo ETV1 recombinante. Racémica YK-4-279 e o S-enantiómero ligado a ETV1 enquanto que o enantiómero R tinha uma menor afinidade de ligação para ETV1. b) Um ensaio de luciferase foi realizada em células COS-7 co-transfectadas com ETV1 e uma construção repórter de luciferase Id-2. a actividade do promotor Id-2 foi reduzida após tratamento com YK-4-279 racémica e (S) -YK-4-279. *; p 0,0005, N.S .; não-significativo, o teste t de Student não pareado.
discriminação quiral entre enantiômeros é uma característica importante de muitas drogas como moléculas, como enantiómeros activos individuais podem proporcionar uma maior selectividade para os seus alvos biológicos, melhorar o índice terapêutico, e exibir melhor farmacocinética do que a mistura racémica [22]. Pode também reduzir a dose total do fármaco e diminuir as interacções droga e os efeitos colaterais tóxicos. Ao submeter uma nova droga para aprovação, os EUA Food and Drug Administration (FDA) exige que os desenvolvedores para justificar a escolha de usar uma mistura racémica sobre as formulações enantiómero único.
No nosso
in vivo
experiências, LNCaP-Luc-M6 inibição do crescimento tumoral foi maior a 150 mg /kg YK-4-279 em comparação com 75 mg /kg. No entanto, os animais que receberam uma dose mais elevada da droga não pode ser tratada por mais de 10-12 semanas devido à manifestação de tumores necróticos, que são exigidos os animais a serem sacrificados. Assim, em adição à inibição de metástases, YK-4-279 pode ter um efeito directo sobre a proliferação de células cancerosas da próstata ETS-positiva. A única desvantagem do tratamento de animais com doses mais elevadas de YK-4-279 foi o aparecimento de sintomas de toxicidade da droga, que começou em 4 semanas. Neste estudo, conseguimos os sintomas, diminuindo a frequência de tratamento da toxicodependência, dando assim os animais mais tempo de recuperação entre as injeções. No entanto, a fim de mover este composto para a clínica, mais estudos são necessários para melhorar a
in-vivo
eficácia e tratar os sintomas que surgem em doses mais elevadas. Estamos actualmente a analisar diversas regimes de dosagem e formulações para encontrar o cenário ideal de tratamento que maximiza os efeitos sobre-alvo, minimizando fora do alvo toxicidades de drogas. Devido à sua estrutura hidrofóbica, a biodisponibilidade de YK-4-279 é de apenas 2% -15%, quando é administrada a ratinhos por gavagem oral [14]. Além disso, recentes experimentos farmacocinéticos em nosso laboratório demonstraram que as administrações intra-peritoneal de 75 mg /kg YK-4-279 inicialmente leva a um aumento acentuado nas concentrações plasmáticas, mas é substancialmente apuradas levando a ~ 1? M níveis por 2 horas [ ,,,0],14]. As propriedades farmacocinéticas da YK-4-279, juntamente com a impossibilidade de fornecer uma dose alta sustentável ao longo do tempo através de injecções de bolus sugere a necessidade de desenvolver um modelo de infusão contínua para assegurar a entrega da droga adequada. Nós testamos este paradigma no modelo de xenoenxerto de sarcoma de Ewing uma em ratos nus. Estes animais recebem infusão da droga contínua através de um cateter venoso central e mostrar melhor resposta ao YK-4-279 tratamento do que injeções intra-peritoneal ou intra-venosa diárias [21]. Além disso, combinando medições farmacocinéticas,
in-vivo
modelagem e estudos laboratoriais nos permitirá criar uma formulação entrega da droga ideal que é adequado para o uso clínico. Além disso, a validação bem sucedida de (S) -YK-4-279 como o componente ativo da YK-4-279 pode permitir dose de tratamento reduziu drasticamente
in-vivo.
Um crescente corpo de evidências sugere que as fusões ETS funcionar concomitantemente com outras alterações genômicas na iniciação e manutenção de doenças malignas da próstata. a sobre-expressão específico da próstata andrógeno-indutível da ETV1 em ratinhos transgénicos induz a neoplasia intra-epitelial prostática (PIN), mas não conduz à formação de carcinoma. Cruzando estes ratinhos transgénicos em um PTEN
+/- fundo ou PI3K específico da próstata /Akt constitutivamente ativo induz carcinoma invasivo no prazo de 6 meses, sugerindo que translocações ETS cooperar com outras lesões genéticas para induzir o câncer de próstata em humanos [10 ], [11]. Descobertas recentes identificaram também poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), uma das principais proteínas de reparação do ADN, para interagir com os factores ETS de uma forma independente do ADN [23]. PARP1 é mostrado ser importante para a função da proteína ETS, e a inibição de tumorigénese PARP1 prejudica mediada ETS e a invasão de células. Os inibidores de PARP e da via PI3K /Akt como olaparibe, rucaparib, perifosina, e miltefosina está em estado avançado de ensaio clínico [24] – [26]. Uma vantagem clínica importante destes resultados é o potencial de combinar YK-4-279 com outras drogas para conseguir uma resposta mais robusta e sinérgica, abrindo um amplo espectro de novas estratégias para atingir fatores ETS.
Os fatores de transcrição têm