Abstract

proteínas do esperma (SP17) é um alvo atraente para o cancro do ovário (OC) vacinas devido à sua sobre-expressão no ensino primário, bem como em lesões metastáticas, em todas as fases da doença. Nossos estudos sugerem que uma vacina baseada em SP17 pode induzir uma defesa duradoura contra o desenvolvimento OC em ratinhos C57BL /6 com células de ID8, seguintes tratamentos profiláticos e terapêuticos. Esta é a primeira vez que um homólogo de rato de um antigénio de cancro do testículo (SP17) foi mostrado para ser expressa num modelo de ratinho OC, e que a vacinação contra esse antigénio controlada significativamente o crescimento do tumor. Nosso estudo mostra que a vacina SP17 CpG-adjuvado supera a questão da tolerância imunológica, a principal barreira para o desenvolvimento da imunoterapia eficaz para OC. Além disso, este estudo proporciona uma melhor compreensão da biologia OC, mostrando que a activação de células Th-17 e contemporânea imunossupressora T-reg células inibição é necessário para a eficácia da vacina. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que as vacinas profiláticas e terapêuticas pode induzir a protecção de longa duração contra o crescimento OC e tumor de atraso, o que sugere que esta estratégia pode proporcionar tratamentos adicionais de OC humana e a prevenção do aparecimento da doença em mulheres com uma história familiar de OC.

Citation: Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, canhão M, et al. (2010) Cancer Testículo Antigen vacinação confere Proteção a longo prazo em um modelo murino de cancro do ovário. PLoS ONE 5 (5): e10471. doi: 10.1371 /journal.pone.0010471

editor: Sudhansu Kumar Dey, Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de fevereiro de 2010; Aceite: 12 de abril de 2010; Publicado em: 12 de maio de 2010

Direitos de autor: © 2010 Chiriva-Internati et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado pelo Billy e ruby ​​Poder Endowment for Cancer Research e Laura W. Bush, Instituto para a Saúde e Centro de Saúde da Mulher da Mulher e Género-Based Medicine. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário (OC) é o sexto tipo de câncer mais comum e a sétima principal causa de morte por câncer em mulheres [1], [2]. Entre OC, 90% dos casos são representados por cancros de ovário (EOC), provenientes do epitélio de revestimento, a superfície do ovário ou a partir de cistos de inclusão [3], [4]. A letalidade de OC decorre da incapacidade de detectar a doença numa etapa precoce confinado ao órgão e da falta de terapias eficazes para doenças [4] em estágio avançado. O diagnóstico tardio ea alta taxa de resistência à quimioterapia limitar as opções de tratamento disponíveis. pacientes de OC com uma história familiar de conta OC para 10% de todos os casos [5]. opções clínicos para estes pacientes estão a intervenção cirúrgica que leva à infertilidade, ou quimioprevenção com contraceptivos orais, muitas vezes associados com efeitos secundários graves [6], [7]. estratégias de imunoterapia incluindo vacinas contra o câncer são considerados menos tóxicos e mais específicos do que os tratamentos atuais [8], e, portanto, têm o potencial de fornecer benefícios para os pacientes de OC com doença evidente e para pacientes de OC de alto risco. Devido à sua especificidade de acção, potente e efeitos duradouros e aplicabilidade a praticamente qualquer tipo de tumor, as vacinas anti-câncer estão dirigindo o interesse dos oncologistas clínicos. Um passo importante no desenvolvimento de vacinas base de cancro é a implementação de estratégias de vacinação que permitam a indução consistente de respostas imunitárias contra antigénios tumorais. A este respeito, a escolha de antigénios adequados, com base tanto a frequência e a especificidade da sua expressão em tecidos de cancro, é de primordial importância. antígenos câncer /testículo (CTA) [9], [10], [11], [12], que incluem o antígeno SP17 [9], [13], [14], [15], [16], estão emergindo como candidatos promissores para alvos de imunoterapia específica. CTA representam uma sub-classe de antigénios associados a tumores (TAA) que são antigénios próprios não-mutadas expressas ou sobre-expresso em tumores, e reconhecido por células T CD8 [12], [14], [17], [18], [19], [20]. A proteína imunogénica SP17 foi extensivamente caracterizada [10], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. SP17 humano é altamente conservada, que tem 70% de homologia com coelho e do rato, e 97% de homologia com babuíno [25]. SP17 tem um peso molecular de 17,4 KDa, é codificada por um gene localizado no cromossoma 11, e é expresso de forma aberrante em cancros de origem histológica não relacionada [25], incluindo o mieloma múltiplo (MM) e OC [21], [22]. específica-SP17 CTL, geradas a partir de dadores normais, MM e pacientes OC, têm sido mostrados para matar linhas celulares tumorais HLA compatível e células tumorais frescas apresentando epitopos SP17 ligados a HLA de classe I moléculas de [13], [14], [21] . Estas observações suportam estudos recentes que sugerem que SP17 pode ser um antigénio adequado para imunoterapia em OC [13], [25]. As proteínas recombinantes são vulgarmente utilizados no desenvolvimento de vacinas antivirais, atraentes e pode constituir vacinas antitumorais candidato [11], [26], [27], [28], [29]. As células apresentadoras de antigénios profissionais (APCs) detectar agentes patogénicos através de uma variedade de receptores tais como os receptores de tipo Toll (TLR), que reconhecem padrões moleculares associados a agentes patogénicos, incluindo oligodesoxinucleótidos CpG (CpG ODN) nas sequências que flanqueiam definidos [27], [ ,,,0],29], [30], [31]. motivos CpG, que são frequentemente expressos no genoma bacteriano mas genomicamente suprimida em vertebrados, são considerados estranhos pelo sistema imunológico e, como resultado, estimular os mecanismos de defesa do hospedeiro [11], [27], [29], [32], [33], [34]. CpG-ODN apresentam um grande potencial no tratamento terapêutico do cancro devido à sua capacidade para activar a imunidade inata e adaptativa [15], [26], [27], [28]. O CpG-TLR9 ligação induz a secreção de citocinas Th1, incluindo IFN-γ e TNFa, e a produção de IgG2a específica do antigénio pelas células B [11], [12], [32], [33], [34]. Neste estudo, avaliamos a resposta imune profilática e terapêutica provocada pela vacinação repetida com proteína recombinante SP17 administrado com CpG. Utilizou-se a linha de células de murino OC ID8, derivado de um espontânea

In vitro

transformação maligna de células epiteliais da superfície do ovário C57BL /6 de ratinho para induzir o crescimento do tumor em ratos [34]. Nossos resultados mostram pela primeira vez que priming com proteína SP17 e CpG é uma estratégia eficaz para induzir a terapia OC durável.

Resultados Caracterização do SP17 e expressão de MHC-I em células ID8

mRNA SP17 (Figura 1A) e proteína SP17 (Figura 1B) foram detectados na linha celular ID8. A caracterização adicional por imunocitoquímica (ICC) e imunofluorescência (IF) revelou a coloração citoplasmática e da superfície destas células (Figura 1C). O Cytospin de células permeabilizadas ID8 (P) apresenta uma coloração citoplasmática positiva para SP17, o qual foi confirmado por IF. Além disso, os não permeabilizadas (NP), as células também mostram clara expressão através IF (Figura 1c, quadrantes inferiores) embora menos por ICC (Figura 1c, quadrantes superiores). Nós ainda analisada a expressão de superfície SP17 através da análise de citometria de fluxo, que mostrou alta freqüência de SP17 células positivas (Figura 1D). Da mesma forma, a análise de citometria de fluxo revelou que 60% de células coradas ID8 positiva para MHC-I, em condições de cultura basal, enquanto que a adição de 100 UI /mL de IFN-γ durante 72 horas resultou em 98% de células positivas de MHC-I.

SP17 ARNm nas células tumorais de murino e ID8 no testículo de rato (controlo positivo). Os níveis de mRNA foram analisados ​​por RT-PCR para a expressão de SP17. Um gene de manutenção celular, B-actina, foi incluído como um controlo. Um controlo só por PCR (sem passo de RT) não conseguiu gerar um produto, indicando que não houve contaminação de ADN nas amostras. Para além da RT-PCR (ver Figura 1A), transferência de Western foi executada e a figura 1b mostra a expressão de SP17 ao nível da proteína. A linha celular de ID8 foi ainda caracterizado por possuir imunocitoquímica (ICC) e imunofluorescência (IF). Esta figura mostra um Cytospin de células permeabilizadas ID8 (P) e uma coloração positiva para a SP17 ao nível citoplasma. Além disso, SP17 foi confirmada por IF no citoplasma. Além disso, na figura 1c, as células não permeabilizadas (NP) mostram expressão clara via IF e menos pelo ICC. Painel d mostra caracterização ID8 para a expressão de superfície de SP17 e MHC-I; ISOT. ctrl, o anticorpo controlo isotópico; percentual indicam células positivas-coloração. MHC-I expressão foi avaliada com ou sem estimulação IFN-g.

In vivo

crescimento de células ID8 após a injeção intraperitoneal

Quatro doses diferentes de células ID8 (10

5, 5 × 10

5, 10

6 e 2 × 10

6) foram injectados em quatro grupos de ratinhos (cinco por grupo) para determinar a dose óptima para a indução de tumores /formação de ascite. Cada conjunto de inoculações experimentais com diferentes doses de células ID8 foi realizada, pelo menos, três vezes. Os animais de cada grupo foram sacrificados titulação de tumor em diferentes pontos no tempo, em que um exame post mortem foi conduzida em animais inteiros e órgãos dissecados (não mostrado). crescimento do tumor óptimo (com base no tempo e dimensão) foi observada com uma das 4 condições (2 × 10

6) ID8 células testadas. A Figura 2a mostra que uma injecção i.p. injecção de 10

5 células ID8 gerado um crescimento de tumor depois de 120 dias, enquanto que 5 × 10

5 células ID8 gerada uma massa tumoral /ascite em 90 dias (Figura 2b). Uma dose de 106 células mostraram um crescimento da massa tumoral significativa /ascite por cerca de 60 dias (Figura 2c) e quando 2 × 106 células ID8 foram injectados, os óptimos massa tumoral /ascite foi alcançada em 40 a 45 dias (Figura 2D), e a maioria das mortes ocorreu entre 50-65 dias, devido tanto à massa tumoral ou sacrifício para evitar o desconforto excessivo para os ratos. A Figura 3A representa um ratinho injectado com a dose óptima (2 × 10

6) de células ID8 para gerar uma massa de tumor /ascite (44 mm de largura) em menos de 45 dias, e um ratinho de controlo (20 mm de largura) que não foi injectado com as células ID8. A Figura 3b mostra a geração de ascites a partir de uma injecção ip de 2 × 10

6 células ID8 em menos de 40 dias, e também mostra uma vista detalhada da cavidade peritoneal de um rato após a aspiração de 22 ml de ascite, revelando vários metastático nós e massas tumorais. Além disso, a Figura 3 confirma que as células do peritoneu de ratinhos injectados com células ID8 expressar SP17 por imuno-histoquimica (IHC), enquanto que as células de um ratinho sem a injecção do tumor foram negativos para SP17 (figuras 3e, F e G). Estes resultados mostram que SP17 é expressa na linha celular ID8,

in vivo

. Para confirmar a massa tumoral /ascite originado a partir das células ID8, espécimes de peritoneal, tumor de massa /nodos, pulmão, fígado, ascites, o baço e os ovários foram investigada por RT-PCR. Os resultados são apresentados na Figura 3D, (imagem representativa de 5 murganhos por experiência, repetida em triplicado) para ID8 ratinhos injectados (Figura 3D-1) e ratinhos de controlo (Figura 3D-2). Além disso, um ensaio de localização baseados em fluorescência foi realizada para detectar células ID8 GFP positivas

in vivo

, e confirmou a localização peritoneal de ID8 células (figura 3h).

Mostra a formação progressiva de ascites /tumores quando o IP injectados com células ID8. ID8 injectados ratinhos são apresentados como M1-M5. Os ratinhos de controlo foram injectados apenas com PBS. 1a mostra camundongos injetados com 10

5 células ID8. Os tumores não chegaram a um tamanho significativo até depois de 150 dias. 2b mostra a formação progressiva da ascite /tumores quando i.p. injectado com 5 × 10

células 5 ID8. Os tumores não chegaram a um tamanho significativo até depois de 120 dias. 2c mostra a formação progressiva da ascite /tumores quando i.p. injetados com 10

6 células ID8. Os tumores atingiram um tamanho significativo em 90-120 dias. 2d mostra a formação progressiva da ascite /tumores quando i.p. injectado com 2 × 10

células 6 ID8. Os tumores atingiram um tamanho significativo em 35-60 dias (p 0,0001); um aumento visível dos ratos foi observado em 30 dias.

A mostra no lado esquerdo de um rato de controlo (largura de rato 20 mm) não injectados com células ID8 e no lado direito um rato injectado com 2 × 106 células ID8 após 40 dias (largura de rato 44 mm). Estes ratinhos representam experiências com resultados semelhantes. b mostra a cavidade peritoneal cheio de ascite induzidas a partir de uma injecção ip de 2 × 106 ID8 em 40 dias (à esquerda) e uma visão aberta da cavidade com vários nós metastáticos e massas tumorais (centro e direita, depois de aspiração 22 mL de ascite) . c mostra uma peritônio negativo para SP17 de um rato controle não injectados com células ID8. F mostra uma expressão positiva de SP17 no peritoneu de um ratinho injectado com 2 × 106 células ID8 após 40 dias. Testículo é o controlo positivo para SP17 por ICH (g). A Figura d indica PCR para ADN SP17 (e o controlo B-actina): um painel de tecido derivado de (1) os órgãos de um 2 × 106 ID8 injectado rato foi positivo para SP17 e um painel de tecidos derivadas de órgãos de um rato saudável revelou nenhuma expressão de SP17. Os controlos positivos (ID8 e testículo) para SP17 também são mostrados. Painel h mostra in vivo de fluorescência imagens de um controle (esquerda) e ID8-injetada (direita) do mouse para a localização das células ID8 GFP positivas.

esquemas de imunização e de medição do crescimento do tumor

Os camundongos foram vacinados com formulações diferentes: SP17 única; única CpG; e SP17 + CpG, co-administrado. Um total de 22 ratinhos foram imunizados com cada formulação de vacina. Os ratinhos foram imunizados intramuscularmente (i.m) com 50 ug de proteína SP17 e 20 ug de CpG em diferentes pontos de tempo como descrito acima. Avaliação do crescimento e /ou de ascites de tumor foi monitorizado de três em três semanas utilizando calibres de engenheiro. Sobrevivência foi seguido até os tumores atingiram um volume superior a 1000 milímetros

3, de acordo com as nossas Diretrizes Comitê Animal Care Institucional e utilização.

Avaliação das taxas de sobrevivência após vacinação contra SP17 /CPG profiláticas e terapêuticas

as células de tumor foram injectados 30 dias após a 3

rd vacinação do regime profilático, ou 21 dias antes da primeira vacinação terapêutica. Todos SP17 + CpG ratinhos vacinados (100%) estavam livres de tumor de 91 dias após a injecção do tumor com células ID8 (2 × 10

6), enquanto que nenhum dos animais não vacinados (ID8 apenas) estavam vivos. Figura 4a mostra as taxas de sobrevivência de ratos que receberam vacinas profiláticas: 12,5% do SP17 + CpG vacinados ratinhos desenvolveram pequenas massas tumorais e ascite após 91 dias e morreu 180 dias após a tumores de carga pesada. Além disso, 8% dos ratinhos vacinados desenvolveram tumores e ascite, e morreram depois de 200 dias. No entanto, os tumores foram significativamente menores do que os tumores do ovário de ratinhos de controlo que foram vacinados com apenas PBS. A sobrevida global de SP17 + CpG camundongos vacinados foi de 79% para mais de 300 dias. Análise realizada por um teste de log-rank (Mantel-Cox) mostrou que as curvas de sobrevivência global foram estatisticamente significativas (p 0,0001) para o grupo vacinado com SP17 + CpG em comparação com as outras titulações de vacina. Figura 4b mostra as taxas de sobrevivência de ratos que receberam vacinas terapêuticas. Menos de 11% dos SP17 + CpG vacinados ratinhos desenvolveram pequenas massas tumorais e ascite após 150 dias e morreu depois de 210 dias de tumores de carga pesada. Além disso, menos de 10% dos ratinhos vacinados desenvolveram tumores e ascite, e morreram depois de 280 dias. A sobrevida global de SP17 + CpG camundongos vacinados foi de 80% para mais de 300 dias. A análise foi realizada por um de Log-Rank (Mantel-Cox) de teste e mostraram que as curvas de sobrevivência global foram estatisticamente significativas (p 0,0001) para o grupo vacinado com SP17 + CpG em comparação com as outras titulações de vacina. Finalmente, os grupos de controlo vacinados com SP17 sozinho e sozinho CpG mostrou alguma ou nenhuma proteção, que não foi estatisticamente significativa (figura 4a e 4b).

A sobrevida global dos ratos dos quatro profilaxia (a) ou terapêutico (b ), grupos detalhados no texto (tumor livre, SP17 + CpG vacinados, não vacinado, SP17 ou CpG vacinados). ratinhos portadores de tumor foram i.p. injectados com 10

6 células ID8 para ambos os regimes profiláticos e terapêuticos. As células de tumor foram injectados 30 dias após a 3

rd vacinação do regime profilático, ou 21 dias antes da primeira vacinação terapêutica. No grupo de terapêutica, a diferença média em peso entre os animais desafiados com tumor e livres de tumor foi de 10 gramas no início do regime de vacinação. Eixo horizontal indica o tempo, expresso em dias a partir do início do tratamento. Log-rank teste indicou diferença estatisticamente significativa entre vacinados e SP17 + CpG vacinados contra grupo não vacinado ou CpG tratado (p 0,0001). Para ambos os regimes

respostas de anticorpos Medição da SP17 específicas-e expressão de citocinas por ensaio ELISA

Análise da resposta específica do anticorpo SP17 gerada em ratinhos vacinados é mostrado na Figura 5. o ensaio ELISA representativa foi realizada para analisar a resposta imune a partir de 3 formulações de vacinas diferentes: SP17 + CpG; única CpG; e só SP17. vacinações consecutivas aumentou as respostas de anticorpos anti-SP17 específicos em comparação com a primeira vacinação. Na figura 5b, que mostrou uma grande quantidade de anticorpos anti-SP17 específicos de ambas as formulações em SP17 3

rd vacinação. Nós exploramos o calendário de vacinação repetida porque, num cenário clínico, os pacientes que estão em remissão são muitas vezes continuou a ser vacinadas de modo que não há nenhuma recorrência do tumor. No entanto, houve uma ligeira diminuição da quantidade de resposta imune em comparação com o 3

rd vacinação análises em todas as três formulações no 9

th vacinação (Figura 5C), mas os níveis de anti-SP17 IgG em SP17 + CpG vacinados grupo foram ainda significativamente maior em comparação com as outras formulações de vacinas (P 0,001). No grupo do regime terapêutico, SP17 + CpG ratinhos vacinados mostraram uma significativamente maior (p 0,01) A produção de IgG anti-SP17 após 270 dias, em comparação com os ratos tratados com as outras formulações (Figura 5D). Na figura 6 mostrou que a expressão de citoquinas em dias 270 (na 9

th vacinação), tanto profiláctica (6a) e terapêutica (6b) regimes. O soro foi recolhido e analisado por ELISA ensaio (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF) a partir de ratinhos vacinados com SP17 + CpG e comparado com o soro de camundongos vacinados com SP17 sozinho, CpG isolado ou PBS sozinho. Curiosamente, o IFN-γ do SP17 + CpG ratinhos vacinados foi aumentada por quase duas dobras em comparação com os animais vacinados SP17 ou em torno de três dobras de CpG em comparação com os animais vacinados (Figura 6a e b). Nos ratinhos vacinados profilaticamente, o TNF-α de formulação SP17 + CpG foi aumentada mais do que três dobras, como comparado com o CpG ratinhos vacinados e apenas duas dobras em comparação com ratinhos vacinados com SP17 (figura 6a). incrementos de GM-CSF foram três dobras mais elevada do que nos ratinhos vacinados CpG e menos de duas dobras superior contra SP17 ratinhos vacinados (Figura 6A). Nos animais vacinados terapeuticamente, TNF-alfa a partir de formulação SP17 + CpG foi aumentada duas dobras comparado com o CpG e com formulações SP17 sozinho (figura 6b). GM-CSF apresentada duas vezes e mais do que um incremento vezes em comparação com CpG e SP17 formulações sozinho, respectivamente (Figura 6B). No que respeita às outras citoquinas, não houve expressão significativa de IL-2, IL-4, IL-5 ou IL-10 (Figura 6a e b).

O soro de murganhos submetidos a diferentes tratamentos foi recolhido e analisado por ELISA para os níveis circulantes de anticorpos IgG anti-SP17. O eixo X mostra diluições em série de soro. A, B e C os resultados obtidos mostram nos esquemas de vacinação profiláctica, enquanto d mostra a resposta dos ratos a partir do regime terapêutico. No dia 7 (a) a resposta imunitária foi baixa para SP17. No dia 97 (b), a resposta imunitária foi maior do que no dia 7. No dia 270 (c), a resposta para SP17 foi pouco menos do que no dia 97.

No dia 300, o soro foi recolhido e analisado por ELISA para a medição dos níveis de citoquina indicada em ratinhos profilacticamente (a) ou terapeuticamente (b) vacinados. Para ambos os regimes, IFN-gama, TNF-alfa e GM-CSF estatisticamente incrementos significativos foram detectados apenas em SP17 + CpG vacinados ratinhos comparada com controles (PBS). Não foram encontradas diferenças significativas para a IL-2, IL-4, IL-5 ou IL-10 níveis.

Avaliação de CTL antitumorais respostas

Na figura 7a, o ELISPOT IFN -γ ensaio foi realizado no dia 270 (9

th vacinação) usando células de baço de ratinhos imunizados profilacticamente SP17 + CpG. A estratégia de vacinas utilizadas neste modelo animal é de modo a reflectir os ensaios clínicos humanos actuais. Estes resultados sugerem que a frequência de SP17-CTL específica aumentou no grupo óptima (SP17 + CpG ratinhos vacinados) e mostrou 220 ± 30 manchas positivas nas células do baço em comparação com o SP17 vacinados (184 ± 18) e versus os ratinhos de CpG-vacinados que foram tão baixos como 9 ± 2. Na figura 7b, o ensaio de TNF-α ELISPOT foi realizado no dia 270 (9

th vacinação profilática de programação) usando células de baço de SP17 + CpG ratinhos imunizados (que era a melhor formulação para uma resposta imunitária forte). Estes resultados sugerem que a frequência de SP17-CTL específica aumentou no grupo óptima (SP17 + CpG ratinhos vacinados), mostrando 240 ± 35 pontos positivos nas células do baço em relação a SP17 única vacinados (200 ± 31) e contra o CpG ratinhos vacinados que foram tão baixos como 12 ± 2. Analogamente, no esquema de vacinação terapêutica, a frequência de SP17-CTL específica aumentou no grupo SP17 + CpG com 259 ± 20 IFN-γ e 159 manchas positivas ± 30 TNF-a, em comparação com 100 ± 20 IFN-γ e 70 ± 10 manchas positivas de TNF-a em SP17 e CpG apenas as formulações, respectivamente (Figura 6C e D). Estes resultados em geral sugerem uma reação imunológica elevada e específica induzida pela SP17 quando é co-administrado com CpG, independentemente do calendário de vacinação adotado para o ensaio de citotoxicidade por

medição de 51Cr-release, esplenócitos foram recolhidos no momento do 1

st, 3

rd e 9

th vacinação de ratos vacinados SP17, CpG vacinados ratos, e SP17 + CpG vacinados ratinhos. O ensaio de CTL mostraram respostas de CTL mais fortes em SP17 + CpG ratinhos vacinados em comparação com os ratinhos imunizados com SP17 ou CpG única, tanto em profilático (Figura 8) e terapêutica (figura 9) os regimes. Porque em condições normais de cultura ID8

in vitro

, há uma baixa expressão de células MHC Classe I moléculas ID8 foram tratados

in vitro

com IFN-y (100 UI /mL durante 72 horas) para induzir níveis mais elevados de expressão, como descrito anteriormente (Figura 1D, painel inferior). ID8 células activadas com IFN-γ foram usadas como alvos melhores para o ensaio de citotoxicidade.

No dia 270 (9

th vacina) esplenócitos a partir de diferentes formulações de ratinhos vacinados e controlos foram recolhidos e analisados ​​por ELISPOT ensaio. a, b) a frequência de células positivas IFN-gama e TNF-alfa em vacinas profiláticas; c, d) a frequência de células positivas para IFN-gama e TNF-alfa em vacinas terapêuticas. Estes resultados são apresentados como células formadoras de manchas por 10

6 esplenócitos. Ponto números representam a média de dez ratinhos em cada grupo vacinado; bares, SE.

Os esplenócitos a partir dos três diferentes formulações de ratos e controles profilaticamente vacinados foram coletadas e analisadas por

ensaio 51Chromium-lançamento nos dias 7 (primeira vacina), 97 (terceira vacina) e 270 (nona vacina), utilizando como células efectoras os esplenócitos e ID8 como células alvo. Estes resultados foram obtidos a partir de três experiências independentes. eixo X indicam efetoras: rácios-alvo

Os esplenócitos a partir dos três diferentes formulações de ratos e controles terapeuticamente vacinados foram coletadas e analisadas por

ensaio 51Chromium-release.. Estes resultados mostram três experiências independentes após a terceira vacina (dia 97) e nono vacina (dia 270), utilizando como células efectoras os esplenócitos e ID8 como células alvo. eixo X indicam efetoras:. rácios-alvo

Avaliação de Th-17 e T-reg frequência de células

A Figura 10 mostra a frequência de Th-17 ou T-reg células em SP17 + CpG vacinados ou controlar esplenócitos ratos, coletadas em diferentes pontos de tempo (sem tumor: dia 0; ID8 apenas: dia 45; profilático e terapêutico dia 270).

Os esplenócitos de ratos que receberam as vacinas ou controles profilácticos ou terapêuticos (ratinhos sem tumor ou ratos portadores de tumores sem vacinação) foram coletadas em diferentes pontos de tempo (sem tumor: dia 0; ID8 apenas: dia 45; vacinas profiláticas e terapêuticas: dia 270) analisados ​​por citometria de fluxo para a medição de um ) Th-17 da população (CD4 /IL-17 dupla b) frequência população T-reg (CD4 /Foxp3-double positivo) positivo) ou.

vacinações Ambos profiláticas e terapêuticas provocou um aumento significativo em Th-17 e uma diminuição da frequência média de células T-reg (3-e 1,5-pregas respectivamente, Fig. 10), em comparação com animais não vacinados desafiados com tumor (teste t não emparelhado de p 0,001, para vacinados contra ratinhos não tratados de controlo) . vacinas terapêuticas e profiláticas consistem na SP17 ou CpG sozinho também induziu um aumento nas freqüências de Th17; No entanto, tal efeito não foi significativo (teste t não emparelhado p 0,05, para SP17- ou CpG- única vacinados contra ratinhos não tratados de controlo). SP17 ou CpG administrados isoladamente reduzida freqüências populacionais T-reg em maior medida quando comparada com formulações SP17 + CpG combinados em ambos os regimes terapêuticos e profiláticos; essa redução foi significativa quando comparada com tumor desafiou ratos não vacinados (teste t não pareado p 0,01), mas não quando comparado com as vacinações SP17 + CpG (teste t não pareado p 0,05).

Discussão

a letalidade de carcinoma do ovário resulta principalmente da incapacidade dos médicos para detectar a doença na fase-confinado ao órgão precoce e geralmente assintomática, combinada com a falta de terapias eficazes para a doença em fase avançada [14], [33], [35], [36]. O diagnóstico tardio ea alta taxa de quimio-resistência deste tipo de câncer comprova a necessidade de novos alvos terapêuticos e uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na disseminação da OC.

No presente estudo, avaliamos a eficácia da proteína recombinante SP17 mais CpG em configurações profiláticos e terapêuticos no modelo murino ID8. SP17 tem sido mostrado para ser fortemente expressa no citoplasma e na membrana de superfície de células ID8 (por ICC, IF e citometria de fluxo). Fomos capazes de acompanhar o crescimento do tumor usando SP17 como um biomarcador (figuras 1 e 3). Este modelo murino gera ascite como mostrado nas figuras 3a e 3b, e por isso parece reflectir a patologia da forma mais agressiva e frequente de doença do ovário humano em fases III e IV. A geração de nódulos tumorais e fusão do peritoneu também se assemelhar ao processo humano (ver Figura 3B), bem como a localização peritoneal típico evidenciado

In vivo

por imagem de fluorescência (figura 3h). A utilização deste modelo animal tem sido relatada em diferentes estudos relacionados com o direccionamento de tumor e factor de crescimento vascular [23], [37], mas esta é a primeira vez que um homólogo de rato de um antigénio de tumor humano associado, SP17, foi mostrado para ser expressa num modelo de ratinho OC.

um dos principais critérios para decidir qual o candidato a auto-antigénio alvo para as estratégias de prevenção ou terapêuticos é a criação de uma resposta imunitária de uma forma segura, e a evidência sugere que aqui SP17 pode ser esse candidato. Foi anteriormente mostrado que células T SP17-específica adoptivamente transferidos têm actividade anti-tumor [13], [14], [21], [22], mas a vacinação terapêutica ou profiláctica SP17-alvo não foi testado num modelo de tumor. Estes resultados indicam claramente que a co-administração de SP17 + CpG i.m. injectadas a cada 30 dias para um total de dez vacinação evitou a formação de tumores até 300 dias, com uma taxa de sobrevivência de 77% para o grupo de tratamento profilático e 80% para o grupo de vacinação terapêutica. Notavelmente, os efeitos da vacinação nos regimes profiláticos e terapêuticos foram semelhantes. Ambos os regimes induziram uma imunidade forte que impediu o crescimento do tumor em ratinhos desafiados com tumor. Os ratos que em última análise, sucumbiram à doença mostraram atraso no desenvolvimento do crescimento do tumor comparada com os ratinhos não vacinados. Nossa hipótese é que o nosso esquema terapêutico será eficiente na rejeição de forma diferente encenado OC, já que nossas vacinas terapêuticas não começou até os tumores ID8 mostrou um crescimento significativo, com características normalmente observada em fase OC III-IV humana, incluindo o câncer se espalhou para além da pélvis, para o revestimento do abdómen ou para os nódulos linfáticos (www.ovariancancer.org) [38]. -Tumor injectada, os animais não vacinados apresentado disseminação do tumor para o peritoneu, gânglios linfáticos, pulmões, fígado e baço. Com efeito, a diferença média em peso entre os grupos desafiados com tumor e livres de tumor foi de 10 gramas, o que corresponde a cerca de 50% dos valores médios de peso do animal antes de injecções de tumor (20 gramas).

A activação de uma resposta imunitária forte contra SP17 foi demonstrada por ensaios de ELISA e ELISPOT, mostrando um aumento em anticorpos anti-SP17 em soro de ratos, a expressão de citocinas Th1-associados e as respostas citotóxicas específicas de tumor. É digno de nota que nenhuma reactividade serológica significativa para SP17 foi detectável antes da vacinação, indicando a capacidade da vacina para as células B virgens específicos primos. Comparando os resultados do SP-17 títulos de anticorpos específicos obtidos com diferentes formulações de vacinas terapêuticas, encontramos apenas um pequeno, mas evidente aumento da produção de anticorpos anti-SP17 em + SP17 animais vacinados CpG em comparação com os outros grupos, especialmente após a 9

th vacinação. Portanto, não podemos julgar se a rejeição tumoral após vacinações CpG + SP17 pode ser atribuída a resposta humoral. Dado que as diferenças em títulos de anticorpo entre os grupos são pequenos, podemos concluir que o tumor respostas imunes celulares específicas de antigénio que detectados mais provavelmente dar uma contribuição maior para a rejeição do tumor em animais de CpG + SP17-vacinados, apenas. Curiosamente, a co-administração de SP17 + CpG era melhor do que SP17 sozinho ou CpG isolado como um adjuvante. Tem sido bem documentado que i.m. injeções de proteínas geralmente não induzir respostas imunes significativas a menos que eles são misturados com adjuvantes [30], [32], [39]. visualização efectiva adjuvantes, pelo menos, 2 mecanismos de acção: um efeito de depósito que leva a uma exposição prolongada ao antigénio no hospedeiro, e uma capacidade de desencadear o sistema imunitário inato através da activação de células dendríticas (DC) através dos receptores de tipo Toll (TLR) [35 ]. Após a apresentação de antigénio adequada, DC activadas desempenham um papel fundamental na indução de respostas de células T [29], [34], [40], [41], [42].