Abstract

Ets-1 é uma transcrição fator que regula muitos genes envolvidos na progressão do cancro e na invasão tumoral. É um marcador de mau prognóstico para câncer de mama, pulmão, colo-rectal e carcinomas de ovário. Aqui, foram identificados poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-1), enquanto novo parceiro de interacção da ETS-1. Mostramos que Ets-1 activa, por interacção directa, a actividade catalítica de PARP-1 e é, em seguida, poli (ADP-ribosil) ado de uma forma independente do ADN. A inibição catalítica de PARP-1 reforçada Ets-1 atividade transcricional e causou a sua acumulação maciça nos núcleos celulares. Ets-1 foi correlacionada com a expressão de um aumento em danos no ADN quando PARP-1 foi inibida, o que leva à morte de células de cancro. Além disso, os inibidores de PARP-1 causou apenas Ets-1 expressando células para acumular danos no ADN. Estes resultados fornecem uma nova visão sobre Ets-1 regulamento em células cancerosas e sua ligação com proteínas de reparo do DNA. Além disso, os nossos resultados sugerem que os inibidores de PARP-1 seria útil numa nova estratégia terapêutica que se destina especificamente Ets-1 que expressam tumores

citação:. Legrand AJ, choul-Li S, C Spriet, Idziorek t, Vicogne D, Drobecq H, et al. (2013) o nível de Ets-1 proteína é regulada pela Poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-1) em células cancerosas para evitar danos DNA. PLoS ONE 8 (2): e55883. doi: 10.1371 /journal.pone.0055883

editor: Rajesh Mohanraj, Universidade dos Emirados Árabes Unidos, Emirados Árabes Unidos

Recebido: 25 Setembro, 2012; Aceito: 03 de janeiro de 2013; Publicação: 06 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Legrand et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) e por doações de la Ligue contre le Cancer, Comité du Pas-de-Calais. O Ministère de la Recherche et de l’Enseignement Supérieur ea Fondation pour la Recherche ARC sur le cancer forneceu uma bolsa de doutoramento para Arnaud J. Legrand. O CNRS eo Conseil Régional du Nord-Pas-de-Calais forneceu uma bolsa de doutoramento (BDI) para Souhaila choul-li. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Ets-1 é o membro fundador da família de fatores de transcrição chamados ETS. Esta família é caracterizado por um domínio bem conservado de ligação a DNA (DBD)

5 que reconhece elementos de ADN específicos, chamadas locais de ligação ao ETS (EBS), encontrados nos promotores de genes alvo. Ets-1 é expressa principalmente em tecidos embrionários. Ele está envolvido em processos fisiológicos, tais como a proliferação, diferenciação, migração, invasão e apoptose [1] – [6]. Ets-1 expressão é fortemente regulada em tecidos adultos e a sua sobre-expressão está frequentemente relacionada com doenças invasivas, tais como a artrite reumatóide, glomerulonefrite e muitos cancros [7] – [9]. A expressão patológica de Ets-1 é, em parte, responsáveis ​​pela proliferação e invasão habilidades de células tumorais. Isto é devido à capacidade de invasão genes que são controlados pela ETS-1 e que as proteases codificam, incluindo a matriz de metaloproteases a colagenase-1 e estromelisina-1, ou o activador do plasminogénio de tipo uroquinase (uPA). Portanto, a ETS-1 é actualmente considerado como um marcador de prognóstico desfavorável em vários cancros [10] – [13].

Além disso, apesar do facto de todos os membros da família partilham a mesma ETS DBD, Ets-1 possui suas próprias propriedades de ligação de ADN que são fortemente controladas para assegurar uma ação biológica específica. Ets-1 inibe a sua própria ligação de ADN devido à presença de dois domínios inibitórios que flanqueiam a sua DBD [14]. Ets-1 precisa interagir com parceiros para contrariar esta auto-inibição e se ligam aos promotores de seus genes-alvo [15]. Em alguns promotores, tais como aqueles encontrados no

MMP3

(estromelisina-1) e

TP53

genes, duas moléculas Ets-1 se ligam a dois EBS palindrómica separados por 4 pb [16] – [18]. Em todos os casos, as interacções proteína-proteína parecem ser a chave da ETS-1 regulação.

Além disso, a ETS-1 é também controlada por modificações pós-traducionais, incluindo a fosforilação, ubiquitinação SUMOilação e [7], [19]. No entanto, Ets-1 possui as mesmas vias de sinalização com muitos fatores de transcrição. Assim, o desafio é identificar as características específicas dos caminhos que controlam a atividade de Ets-1 para usá-los para direcionamento terapêutico.

Para identificar novos caminhos, que anteriormente purificados parceiros de interação de Ets-1 utilizando o estreptavidina suspenso ensaio. Com essa estratégia, temos demonstrado a interação funcional entre Ets-1 e o reparo do DNA complexo DNA-PK [20].

Aqui, nós identificamos poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-1) como novo parceiro de interacção de Ets-1. A PARP-1 é uma proteína nuclear abundante e ubíquo que catalisa poli (ADP-ribosil) ation (PARylation) utilizando NAD + como substrato para sintetizar poli ramificada (ADP-ribose) polímeros de proteínas alvo. A PARP-1 desempenha diversos papéis em diversos processos moleculares e celulares, incluindo a detecção de danos no DNA e reparação e modificação da cromatina [21]. Embora a PARP-1 foi originalmente caracterizada como uma proteína de reparação de ADN, muitos estudos recentes puseram em evidência o seu papel na regulação da transcrição. A PARP-1 está envolvida na regulação de factores de transcrição tais como NF-kB, AP-2, p53 e muitos outros [22] – [24]. Além disso, a PARP-1 de inibição tem emergido como uma nova estratégia terapêutica para o cancro [25]. Curiosamente, a PARP-1 de inibição parece ser eficaz em cancros que exibem proteínas ETS frequentemente sobre-expressa, incluindo do ovário, da próstata e da mama [25]. Estudos anteriores mostraram uma ligação funcional entre PARP-1 e membros da família ETS, como Ese-1, FLI1, Erg e Elk-1 [26] – [28]. Da mesma forma, a ETS-1 pode ser um regulador chave do

gene PARP1 através do controlo do seu promotor [29]. Muito recentemente, o interesse nesse vínculo funcional tem aumentado na medida em que ele é agora considerado como uma abordagem terapêutica totalmente nova em câncer. Relatórios recentes têm demonstrado que as proteínas de fusão ETS, que estão envolvidos em muitos cancros, de drogas são biomarcadores-sensibilidade de PARP-1 de inibição [26], [30], [31]. Alta expressão de TMPRSS2: ERG no câncer de próstata ou EWS-FLI1 em sarcoma de Ewing causa danos de DNA que são potenciados pela PARP-1 inibição e são seguidos por uma forte inibição da progressão do câncer. No entanto, tanto quanto sabemos, não houve relatos de quaisquer ligações funcionais entre os Ets-1 expressão e sua sensibilidade a inibidores de PARP-1.

Neste estudo, demonstramos que PARP-1 controla negativamente a nível de proteínas Ets-1 em células cancerosas através PARylation. Sob inibição PARylation, Ets-1 é aumentada a actividade de transcrição, que se correlaciona com o ETS-1 proteínas acumulação nos núcleos celulares e um aumento de danos de DNA que leva a morte de células de cancro. Portanto, nossos resultados sugerem que a inibição da PARylation poderia ser uma nova estratégia terapêutica para limitar a progressão do cancro em Ets-1-expressando tumores

Resultados

PARP-1: a novel Ets-1. parceiro de interacção em células cancerosas

Para encontrar novos parceiros Ets-1, realizou-se um

in vitro

estratégia de purificação de afinidade utilizando um ensaio de pull-down estreptavidina. Esta abordagem assegura a identificação de grande escala de parceiros usando ETS-1 recombinantes biotiniladas imobilizadas em contas de estreptavidina para reter as suas proteínas de ligação encontrados em extractos nucleares [20], [32]. Aqui, utilizou-se células MDA-MB-231, uma linha celular de cancro da mama invasivo, para a produção de extractos nucleares; estas células expressam endogenamente a oncoproteína Ets-1, oferecendo assim um contexto celular apropriada. Após a separação das proteínas ligadas por SDS-PAGE, observou-se uma banda de proteína altamente visível com um peso molecular de 113 kDa, após coloração coloidal (Fig. 1A, pista 3, indicado por um asterisco (*)), mas ausente em condições de controle (Fig. 1A, as pistas 1 e 2). Esta proteína foi identificado por espectrometria de massa como a enzima PARP-1 (Fig. 1B e S1) e a sua presença exclusiva de proteínas Ets-1-ligado foi confirmada por Western blot (Fig. 1C, pista 3). Devido à forte afinidade de PARP-1 por ADN cortado, extractos nucleares foram tratadas com DNase I antes da incubação para remover todos os traços de ácidos nucleicos. Este tratamento não perturbar a interacção entre Ets-1 e PARP-1 (Fig. 1D, pista 4). Isto foi confirmado por espectrometria de massa (dados não mostrados). Em seguida, realizaram experiências de co-imunoprecipitação utilizando um conjugado anticorpo-agarose anti-ETS-1 na MDA-MD-231 e as células em uma linha celular de osteossarcoma, MG63, que também expressa Ets-1. Após a separação por SDS-PAGE e immunoblotting com um anticorpo anti-PARP-1, PARP-1 co-precipitado com o ETS-1 a partir de ambos MDA-MB-231 e células MG63 (fig. 1E, pista 2). As experiências de controlo com IgG a partir de soro de coelho normal não conseguiu recrutar PARP-1 (Fig. 1E, pista 1). Recíprocos experiências de co-imunoprecipitação foram realizados utilizando um conjugado de anticorpo-agarose anti-PARP-1 em células MDA-MD-231 e células MG63. Ets-1 co-precipitado a partir de ambos MDA-MB-231 e células MG63 e estava ausente de experiências de controlo (Fig. 1F). Além disso, as experiências de imunofluorescência utilizando anticorpos anti-ETS-1 e anti-PARP-1 anticorpos mostrou que ambas as proteínas co-localizar em MDA-MB-231 células de núcleos (Fig. S2, pista 4).

(A) gel azul Colloidal-coradas para proteínas Ets-1-associados de MDA-MB-231 extractos nucleares. Biotinilado ETS-1 proteínas utilizadas para o ensaio suspenso foram carregados sozinho como controlo para identificar as proteínas biotiniladas (setas) e os seus produtos de degradação potenciais (pista 1). proteínas suspenso detectados a partir de extractos nucleares (NE) incubados com esferas carregadas foram consideradas como sendo produtos não específicos (pista 2). O específico de PARP-1-proteína puxado para baixo coradas de azul coloidal de Ets-1 biotinilado é indicado por um asterisco (pista 3). (B) Identificação de PARP-1 por espectrometria de massa MALDI-TOF. (C) Análise de Western blot que confirma a proteína Ets-1-associado como a PARP-1. Proteínas puxado para baixo a partir de células MDA-MB-231 foram analisados ​​extractos nucleares por Western blot com anticorpos de coelho dirigidos contra a PARP-1 (H-250). (D) coloidal gel azul-corada para proteínas Ets-1-associados de MDA-MB-231 extractos nucleares não tratadas (pistas 1 e 2) ou tratados com DNase I durante 40 minutos (pistas 3 e 4) e, em seguida, incubados com esferas de estreptavidina biotinilada carregados com proteínas Ets-1 (setas) (pistas 2 e 4) ou com grânulos não carregadas (pistas 1 e 3). Os asteriscos indicam a proteína PARP-1 detectada em (A). (E) e (F) Co-imunoprecipitação realizado utilizando um anticorpo de coelho anti-ETS-1 (C-20) ou um anti-PARP-1 (H-250) conjugado anticorpo-agarose coelho (pista 2) ou IgG normal de coelho como um controlo (pista 1) e os extractos nucleares a partir de células MDA-MB-231 ou células MG-63. Entrada (pista 3) contém 3% de extractos nucleares que foram submetidos a co-imunoprecipitação. PARP-1 e Ets-1 foram analisados ​​por Western blot usando anticorpos respectivamente H-250 e C-4.

Ets-1 interage diretamente com PARP-1 e é, em seguida, PARylated em um DNA-independente forma

Um estudo anterior demonstrou que o ETS DBD interage com PARP-1 [30]; no entanto, as interações com o Ets-1 DBD são limitados por Ets-1 auto-inibição. Portanto, para estudar a interação entre Ets-1 e PARP-1, utilizou-se duas isoformas biotinilados e inibiu-auto de Ets-1: a forma de longa-metragem, chamado simplesmente de Ets-1 e uma isoforma dominante negativo resultante de splicing alternativo , Ets-1 p27. Ets-1 p27 foi recentemente descoberto pelo nosso grupo e não tem o resíduo de treonina-38 (Thr38) bem como o pontiagudo (PNT) e domínios de transactivação (TAD) (fig. 2a), os quais são necessários para a transactivação de Ets genes-alvo -1. No entanto, a ETS-1 p27 ainda tem as mesmas propriedades de ligação ao ADN como Ets-1 [33]. Após incubação de biotinilados Ets-1 isoformas imobilizadas em esferas de estreptavidina com uma enzima recombinante de PARP-1, PARP-1 especificamente e directamente interagiu com o ETS-1 isoformas (Fig. 2B, pistas 2 e 3). Assim, o auto-inibição da ETS-1 não perturbar a interacção directa entre o DBD e PARP-1. Para investigar se Ets-1 é modificada após tradução por PARylation PARP-1-mediada, realizou-out um

in vitro

ensaio PARylation. Para catalisar PARylation, PARP-1 em geral requer a presença do DNA cortado, como mostrado em controlos com a adição de ADN de cadeia dupla sonicado (Fig. 2C as pistas 1 e 2). Uma vez activada, a PARP-1 catalisa a sua auto-PARylation, que podem ser visualizadas utilizando um anticorpo anti-PAR (Fig. 2C, coluna 2). Na presença de ETS-1, Auto-PARylation era mais forte e Ets-1 foi PARylated com um peso molecular de aproximadamente 51 kDa correspondente ao mono (ADP-ribosil) ção e PARylation com diferentes tamanhos de polímero (Fig. 2C, a pista 4, flecha Negra). Além disso, na ausência de ADN, não só foi PARP-1 ainda activado, mas Ets-1 era ainda mais fortemente PARylated (Fig. 2C, coluna 5, seta preta). Com a isoforma p27 Ets-1, os resultados mostraram que na presença de ADN cortados, Ets-1 p27 não foi PARylated (Fig. 2C, pista 7). No entanto, sem ADN, a ETS-1 p27 activa a PARP-1 e é, em seguida, PARylated, vistos como uma banda com um peso molecular de aproximadamente 27 kDa e com diferentes polímeros dimensionado em pesos moleculares entre 40 e 60 kDa (Fig. 2C, pista 8). Assim, a extremidade C-terminal da ETS-1 pode activar a auto-PARylation de PARP-1 de uma forma independente do ADN através da interacção proteína-proteína e directa ser PARylated em retorno. Para demonstrar PARylation em células de cancro humanas, foi gerada uma linha celular HeLa, obtido por infecção retroviral, que expressa estavelmente Ets-1 marcado com um péptido de ligação a estreptavidina (SBP). Depois da purificação da ETS-1 em esferas de estreptavidina, analisamos PARylation por Western blot utilizando um anticorpo anti-RAP. Os resultados mostraram que uma fracção da ETS-1 foi ligeiramente PARylated proteína em células (Fig. 2D, faixa 2). PARylation é uma modificação pós-translacional muito curta duração que é difícil visualizar em células, em particular devido à acção de poli (ADP-ribose) glico-hidrolase (PARG), que catalisa a degradação de polímeros PAR [21].

(a) representação esquemática do Ets-1 proteína de comprimento total e sua isoforma dominante negativo Ets-1 p27. Caixas correspondem a regiões traduzido e linhas pontilhadas para regiões não traduzidas. Treonina-38 (Thr38), domínio pontiagudo (PNT), o domínio de transactivação (TAD), o domínio inibidor (I), região traduzida correspondente ao exão VII e o domínio de ligação a DNA (DBD) são indicadas. (B) ensaio suspenso Estreptavidina com proteínas recombinantes Ets-1 e PARP-1. biotinilado proteínas Ets-1 (5 ug) ou ETS-1 P27 (2,5 ug) foram carregados em contas de estreptavidina e, em seguida, incubados com recombinante puro PARP-1 de proteína (1 mg) durante 1 hora (pistas 2 e 3). esferas de estreptavidina sozinho incubadas com a PARP-1 foram usados ​​como controlo (pista 1). A PARP-1 foi analisada por Western blot. (C) PARylation ensaio com o ETS-1 e Ets-1 p27. Ets-1 (1 ug) ou ets-1 p27 (500 ng) de proteínas foram incubadas com proteína recombinante de PARP-1 de proteína (500 ng) em tampão de reacção PARylation (ver Materiais e Métodos) na presença (pistas 4 e 7) ou na ausência (pistas 5 e 8) de DNA cortado por 20 min. Como um controlo, a ETS-1 isoformas foram incubadas só em tampão de reacção e cortado do ADN (pistas 3 e 6) e auto-activação da PARP-1 por si só foi verificada com ou sem ADN (controlo, as pistas 1 e 2) (D) PARylation de ETS-1 em células HeLa transf ectadas de forma estável, obtido por infecção retroviral. Ets-1 etiquetada com a ligação do péptido estreptavidina (SBP) foi purificado em esferas de stretavidin de extractos nucleares de células HeLa (pista 2). células HeLa que expressam estavelmente apenas o PAS foram utilizadas como controlo (pista 1). Em (C) e (D), o estado PARylation foi determinada utilizando um anticorpo anti-RAP.

PARP-1 modula a transcrição Ets-1-mediada da estromelisina-1 promotor

Para determinar se a interacção com a PARP-1 modula a actividade de transcrição de ETS-1, foram realizados ensaios de transactivação de luciferase. Para o fazer, foi utilizado o promotor da metaloproteinase de matriz estromelisina-1, que é um gene alvo Ets-1 bem estudado envolvido na migração de células do cancro e invasão [34]. Este promotor, activado por ligação cooperativa de dois Ets-1 moléculas através de um EBS palindrómica, foi fundido com o gene da luciferase (Fig. 3A). As células 3T3 de ratinho, quer com o tipo de PARP-1 selvagem (WT) ou knock-out (KO), foram utilizados para avaliar Ets-1 actividade transcripcional na ausência total da proteína PARP-1. Em células WT, o promotor de estromelisina-1 foi totalmente activado pela ETS-1 transfecção (fig. 3B, pista 3). Em contraste, a PARP-1 KO reduzida a capacidade de ETS-1 de transactivar o promotor (Fig. 3B, pista 4). experiências de salvamento efectuada utilizando um vector de expressão de PARP-1 humana permitido Ets-1 para recuperar parcialmente a sua actividade de transcrição (Fig. 3B, pista 5). Assim, é necessária para a plena transactivação do promotor de estromelisina-1 pela ETS-1 de PARP-1. Em seguida, examinaram as consequências de PARylation PARP-1 mediada em Ets-1 atividade transcricional. Para fazer isso, foram realizados os mesmos ensaios de transactivação com luciferase utilizando células 3T3 PJ-34, um inibidor catalítico de PARP-1. Surpreendentemente, a inibição PARylation, contrariamente a PARP-1 KO, aumentou-Ets uma actividade de transcrição no promotor da estromelisina-1, como mostrado nas células transfectadas WT (Fig. 3C, as pistas 3 e 4). Em células KO, PJ-34 não teve nenhum efeito e não conseguiu aumentar a transactivação do promotor (Fig. 3C, colunas 7 e 8). Portanto, os aumentos no ETS-1 atividade transcricional actuar através da inibição específica da PARP-1. Análise por Western blot revelou que a inibição da PARylation por PJ-34 causou um aumento no nível de Ets-1 de proteínas em células WT (Fig. 3C, as pistas 3 e 4). Para confirmar que a inibição PARylation também causa um aumento no ETS-1 actividade de transcrição em células de cancro humano, foram realizadas ensaios de transactivação da luciferase em células HeLa com doses crescentes de PJ-34. Os resultados mostraram que o aumento dependente da dose PJ-34 na transactivação do promotor de estromelisina-1 foi correlacionada com um aumento nos níveis de proteína Ets-1 (Fig. 3D, pistas 5-8). Este aumento nos níveis de proteína Ets-1 foi observada em células HeLa não só com PJ-34, mas também com dois outros inibidores de PARP-1 bem estudadas:. 5-AIQ e ABT-888 (veliparib) (Fig 3E, pistas 6- 8). Assim, este aumento é devido especificamente a PARP-1 de inibição. Estes resultados sugerem que os níveis de proteínas Ets-1 são regulados negativamente pela PARylation PARP-1-mediada.

(A) Representação esquemática do gene da luciferase sob o controlo do promotor de estromelisina-1 humana. Sites palindr�icas Ets vinculativos (EBS) são mostrados preso com duas moléculas Ets-1. (B) Efeito da PARP-1 knock out (KO) na atividade do promotor estromelisina-1 Ets-1-mediada. pGL3 construções repórter de luciferase (100 ng) foram transfectados em células 3T3 de ratinho do tipo selvagem (WT) (pistas 1 e 3) ou KO para o gene de PARP-1 (pistas 2, 4 e 5) a 50-80% de confluência, na ausência (pistas 1 e 2) ou na presença (pistas 3, 4 e 5) do vector Ets-1 expressão (25 ng) e nas experiências de resgate com PARP-1 vetor de expressão (100 ng; pista 5). (C) Efeito de PARP-1 inibição catalisador sobre a actividade do promotor Ets-1 mediada por estromelisina-1 na presença ou ausência de PARP-1. pGL3 construções repórter de luciferase (100 ng) foram transfectados em células 3T3 de ratinho WT (pistas 1 a 4) ou KO para o gene de PARP-1 (pista 5-8), a uma confluência de 50-80% na ausência (pistas 1, 2 , 5 e 6) ou na presença (pistas 3, 4, 7 e 8) de Ets-1 vetor de expressão (25 ng) e na ausência (pistas 1, 3, 5 e 7) ou na presença (pistas 2 , 4, 6 e 8) de PJ-34, um inibidor catalítico de PARP-1 (10 uM). (D) Efeito de PARP-1 inibição catalítica sobre Ets-1 mediada por actividade de promotor estromelisina-1 num modelo de células de cancro. pGL3 construções repórter de luciferase (100 ng) foram transfectados em células HeLa numa confluência 50-80% na ausência (pistas 1-4) ou na presença (pistas 5-8) de tipo Ets um vector de expressão (100 ng) e com doses crescentes de PJ-34 (0-20 mM; pistas 1-4 e 5-8). Em (B), (C) e (D), a actividade da luciferase, medida 48 h após a transfecção e 20 h após a incubação com PJ-34, é expressa como uma percentagem com a actividade induzida por Ets-1 num PARP-1 WT contexto indicado como 100%. Os resultados são a média de três experiências realizadas em triplicado. (E) Efeito de PARP-1 catalítica de inibição sobre o nível de ETS-1 de proteína. As células HeLa foram cultivadas em placas de 6 poços até 70% de confluência, transfectadas com pcDNA3 (1 ug; painel esquerdo) ou pcDNA3-ETS1 (1 ug; painel da direita) vectores para 24 h e tratou-se com PJ-34 (1 | iM) ( pistas 2 e 6), 5-Aiq (1 uM) (pistas 3 e 7) ou ABT-888 (1 | iM) (pistas 4 e 8) durante 20 h. Em todas as experiências, os lisados ​​de células (30 ^ g de proteínas total) foram analisadas por Western blot utilizando anticorpos diferentes (ver Materiais e Métodos).

A inibição da PARylation faz com que a acumulação de ETS-1 em células cancerosas

Para determinar a cinética de Ets-1 acumulação, realizamos experimentos com imagens de lapso de tempo. As células HeLa foram transitoriamente transfectadas por um vector que expressa uma proteína de fusão eGFP (reforçada proteína verde fluorescente) -ets-1. Sob condições de controle, eGFP-Ets-1 níveis de proteína foram estáveis ​​durante uma 12 horas de lapso de tempo (Fig. 4A, linha 1). Após a adição de PJ-34, observou-se um forte aumento no sinal de eGFP-ETS-1 correspondente aos núcleos de células HeLa (Fig. 4A, linha 2). No entanto, PJ-34 não teve efeito sobre eGFP sozinho (Fig. 4A, linha 4) e, mais interessante, não teve efeito sobre eGFP-ETS-1 p27 (Fig. 4A, linha 3). Dado que todo o comprimento Ets-1 é ubiquitinada e então degradado pelo proteassoma, enquanto Ets-1 p27 não possui locais de ubiquitinação [19], [33], que em seguida examinado se a cinética de Ets-1 acumulação possa ser comparado para as de inibição proteossoma. Usando MG-132, um inibidor de proteassoma bem conhecido, resultou em a mesma cinética de Ets-1 acumulação como os observados durante a inibição PARylation (Fig. 4A, linha 5). Em contraste, MG-132 não teve qualquer efeito nos níveis de proteína p27 Ets-1, reforçando desse modo a ligação entre PARylation e degradação de proteassoma de ETS-1 (Fig. 4A, linha 6). A análise estatística da variação na intensidade de fluorescência nestas experiências de lapso de tempo mostrou que a variação significativa no ETS-1 Os níveis de proteína (aumento de cerca de 50%) observada após a adição de PJ-34 ou MG-132 foi comparável (Fig. 4A, inferior painel, pistas 2 e 5). Para confirmar que a acumulação de ETS-1 mediada por PARP-1 inibição também pode ser observada em um contexto endógena, que trataram células MDA-MB-231 com PJ-34 e analisaram os níveis de proteínas Ets-1 por imunofluorescência. Ets-1 foi localizada principalmente no núcleo de células MDA-MB-231, mas a sua presença foi também observada no citoplasma perinuclear (Fig. 4B, pista 1, as setas brancas) [33]. Com um anticorpo anti-Ets-1, observou-se uma forte acumulação de endógena Ets-1 nos núcleos e citoplasma (Fig. 4B, pista 2) das células. Nós, então, examinou se este mecanismo era específico para Ets-1. Para fazer isso, testámos várias proteínas que se sabe estarem PARylated tais como p53, c-Jun, ERK-2 e PARP-1 [21], [23], [27], [35]. Os resultados mostraram que, excepto para ETS-1, nenhuma destas proteínas acumuladas nas células sob inibição PARylation por PJ-34 (Fig. 4C). Observou-se também que um tipo Ets eficaz acumulado em células MDA-MB-231 após tratamento com outros inibidores de PARP-1, 5-AIQ e ABT-888, ao passo que os níveis de proteína p53 permaneceram inalterados (Fig. S3). Assim, PARylation PARP-1 mediada está envolvido em um regulamento específico de Ets-1 níveis de proteína em células cancerosas e assumimos que este mecanismo está ligada à sua degradação proteossómica.

(A) Cinética de Ets-1 acumulação observada por imagens de lapso de tempo. As células HeLa foram cultivadas em placas de Mattek e foram transfectadas com pEGFP-C1-Ets-1 (500 ng; linhas 1, 2 e 5) ou pEGFP-C-1-Ets-1p27 (500 ng; linhas 3 e 6) ou vazio vetores pEGFP-C1 (500 ng; linha 4). 24 h após a transfecção, as células HeLa foram tratados com PJ-34 (10? M; linhas 2-4) ou MG-132 (5 um; linhas 5 e 6) e observados durante 12 h sob um microscópio de fluorescência a 20 × com uma ampliação foto tirada a cada hora. Painel inferior: A análise estatística da variação da intensidade de fluorescência. Condições 1 a 6 indicadas no eixo dos X são os mesmos que os descritos acima. A média de intensidades de fluorescência a partir de lapso de tempo da experiência imagens foram calculados utilizando o software ImageJ e a razão de variação foi estabelecida entre a t = 12 h e t = 0 imagens. Os resultados são a média de três experiências. (B) A visualização dos níveis Ets-1 de proteína em células MDA-MB-231 tratadas com PJ-34 por imunofluorescência. As células MDA-MB-231 foram tratadas com PJ-34 (10 uM) durante 20 h. Ets-1 é visualizado no vermelho (Alexa Fluor® 594). As células foram examinadas com um microscópio de fluorescência a 40 × ampliação. Barra de escala = 20 mm. As setas brancas indicam a localização citoplasmática da ETS-1 em células não tratadas (pista 1). Painel inferior: representações plotagem de superfície. parcelas de superfície foram obtidos através da análise de imunofluorescência imagens usando software ImageJ; o xey eixos indicam as posições de pixel e o eixo z, a intensidade de fluorescência. (C) Efeito de PARP-1 catalítica de inibição sobre o nível de proteínas PARylated. As células MDA-MB-231 foram tratadas com PJ-34 (10 uM) durante 20 h. Os lisados ​​celulares (30 ug de proteínas totais) foram analisadas por Western blot utilizando anticorpos diferentes (ver Materiais e Métodos) contra a PARP-1, p53, c-Jun e ERK-2, que são conhecidas por sofrerem PARylation.

Ets-1 expressão leva à morte da célula cancerosa sob PARylation inibição

para determinar as consequências de Ets-1 acumulação nas células cancerosas, examinamos se exógena Ets-1 expressão afeta a sobrevivência de células HeLa tratadas com PJ -34. As células HeLa foram transfectadas com um vector que expressa Ets-1 ou um vector vazio e, em seguida, incubadas durante 20 h com 34-PJ. experiências de imagiologia de lapso de tempo mostraram que PJ-34 não tem nenhum efeito drástico sobre a sobrevivência de células HeLa transfectadas com o vector vazio ( “mock”) como demonstrado pela ausência de morfologia necrótica e iodeto de propídio (PI) incorporação (Fig. 5A, painel esquerdo e 5B). No entanto, a ETS-1 expressão sensibilizados células cancerosas à toxicidade PJ-34 a um grande grau (Fig. 5A, painel da direita). experimentos com imagens de lapso de tempo e análise estatística mostrou que quase todos os Ets-1-expressando células HeLa PI incorporado e necrose foram submetidos (Fig. 5A, painel direito e 5B). Do mesmo modo, uma célula activado por fluorescência (FACS) demonstraram que Ets-1 expressando células HeLa foram mais propensos a necrose após tratamento PJ-34 (Fig. 5C, painel da direita). Como PJ-34 é conhecido por causar a paragem da mitose de forma independente de PARP-1-[36], também estas experiências realizadas com ABT-888 (Fig. S4). Os mesmos resultados foram obtidos, demonstrando que a necrose da ETS-1 que expressam as células HeLa opera através da inibição específica de PARP-1 (Fig. S4). Com as células MDA-MB-231, observou-se que 44% das células sofrem a necrose após tratamento PJ-34 (Fig. 5D e 5E). A análise FACS confirmou essa sensibilidade inferior a PJ-34 toxicidade (Fig. 5F). células de cancro da mama são mais resistentes a drogas anti-cancro, tal como a doxorrubicina ou paclitaxel, devido à expressão elevada de MDR1 e Ets-1 [37]. Portanto, testou-se PJ-34 podia ser utilizado em complemento de um tratamento com doxorrubicina. Estas experiências também permitiu-nos a investigar se [ou não] a acumulação Ets-1 mediada por PARP-1 inibição provoca um maior grau de resistência à doxorrubicina em células MDA-MB-231. Os resultados mostram que Ets-1 ainda acumulado sob inibição PARylation quando as células MDA-MB-231 foram tratadas com 500 nM de doxorubicina (Fig. S5A). No entanto, verificou-se que as células MDA-MB-231 foram mais propensos a necrose quando PJ-34 e doxorrubicina foram combinados do que quando as células foram tratadas com apenas um destes dois fármacos (Figs. S5b e S5C). Assim, embora os efeitos PJ-34 são moderados em células MDA-MB-231, inibidores de PARP-1 poderia ser eficientemente combinada com outros medicamentos anti-cancro para aumentar a eficácia do tratamento.

(A) experimentos com imagens de lapso de tempo de células HeLa tratadas com PJ-34. As células HeLa foram cultivadas em placas de Hi-Q4 até 70% de confluência e transf ectadas com pcDNA3 vazio (250 ug; painel esquerdo) ou pcDNA3-ETS1 (250 ug; painel da direita) vectores de 24 h antes de ser tratada com PJ-34 (5 ^ M) ou deixada sem tratamento. As células foram coradas com Hoechst 33242 (azul) e PI (vermelho) para a criação de imagens de células vivas e monitorados durante 20 horas. Barra de escala = 20 uM. (B) representação gráfica da proporção de células HeLa necróticas (%) em três pontos de tempo (ver Materiais e Métodos). (C) A citometria de fluxo de detecção de morte celular das células HeLa tratadas com PJ-34. As células HeLa foram cultivadas em placas de 6 poços até 70% de confluência e transf ectadas com pcDNA3 (1 ug; painel esquerdo) ou pcDNA3-ETS1 (1 ug; painel da direita) vectores para 24 h e não tratados (linhas a tracejado) para a esquerda ou tratadas com PJ -34 (linhas contínuas) para uma incubação adicional de 20 h. morte celular por necrose, em seguida, foi determinada por citometria de fluxo, após coloração com PI. Números sob a barra horizontal dar as percentagens de morte celular por necrose induzida por PJ-34 específica em cada condição. A citometria de fluxo perfis apresentados são representativos de três experiências em replicado. (D) experimentos com imagens Time-lapse de MDA-MB-231 células tratadas com PJ-34. As células MDA-MB-231 foram cultivadas em placas de Hi-Q4 até 80% de confluência e tratadas com PJ-34 (10 uM) ou deixada sem tratamento. As células foram coradas com Hoechst 33242 (azul) e PI (vermelho) para a criação de imagens de células vivas e monitorados durante 20 horas. Barra de escala = 20 uM. (E) representação gráfica da proporção de células MDA-MB-231 necróticas (%) em três pontos de tempo (ver Materiais e Métodos). F) A citometria de fluxo de detecção de morte celular de células MDA-MB-231 tratadas com PJ-34. As células MDA-MB-231 foram cultivadas em placas de 6 poços até 80% de confluência e deixado sem tratamento (linhas tracejadas) ou tratados com PJ-34 (linhas contínuas) para uma incubação de 20 h. morte celular por necrose, em seguida, foi determinada por citometria de fluxo, após coloração com PI. Números sob a barra horizontal representa as percentagens de morte celular por necrose induzida por PJ-34 específica em cada condição. Citometria de fluxo perfis mostrados são representativos de três experiências em replicado.

Acumulação de Ets-1 mediado pela inibição PARylation aumenta o dano de DNA

Em seguida, investigou a possibilidade de que a necrose celular mediada pela inibição de PARP-1 com concomitante Ets-1 acumulação era devido a um aumento em danos no ADN, como observado com as proteínas de fusão Ets no cancro da próstata e sarcoma de Ewing [26], [30]. Para isso, foram avaliados o nível de uma marca de histona de DNA quebras de cadeia dupla, H2AX fosforilada (γH2AX) focos. Barra de escala = 20 mm. ** P 0,01. ** P 0,01.