Abstract
O câncer colorretal é a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo ocidental.
In vitro
e
In vivo
experimentos mostraram que ômega-3 ácidos graxos poliinsaturados (n-3 PUFAs) pode atenuar a proliferação de células cancerosas, incluindo câncer de cólon, e aumentar a eficácia de vários fármacos anti-cancerígenos. No entanto, estes estudos abordam os efeitos de n-3 PUFAs na maior parte das células tumorais e não sobre as células de cancro do cólon indiferenciado tronco-like (CSLCs) que são responsáveis pela formação de tumores e de manutenção. CSLCs também têm sido associadas com a aquisição de resistência a quimioterapia e a reincidência do tumor. CSLCs do cólon têm sido immunophenotyped utilizando vários anticorpos contra marcadores celulares, incluindo CD133, CD44, EpCAM, e de ALDH. Anti-CD133 foi usado para isolar uma população de células cancerígenas do cólon que retém propriedades haste células (CSLCs) a partir de ambas as linhas de células estabelecidas e de culturas de células primárias. Nós demonstramos que o PUFA n-3, ácido eicosapentaenóico (EPA), foi incorporado em activamente os lípidos de membrana de células COLO 320 DM. 25 uM EPA reduziu o número de células da população total de células cancerosas, mas não dos CSLCs CD133 (+). Além disso, observou-se que EPA induzida down-regulação da expressão de CD133 e up-regulação dos marcadores de diferenciação do epitélio do cólon, Cytokeratin 20 (CK20) e mucina 2 (MUC2). Finalmente, foi demonstrado que o EPA aumenta a sensibilidade de células COLO 320 (DM população total) para ambas as quimioterapias padrão de cuidados (5-fluorouracil e oxaliplatina), ao passo que a EPA aumentou a sensibilidade do CSLCs CD133 (+) para apenas 5- fluorouracil
Citation:. de Carlo F, Witte TR, Hardman WE, Claudio PP (2013) Omega-3 ácido eicosapentaenóico Diminui CD133 cancro do cólon Stem-Like celular marcador Expressão Enquanto aumentando a sensibilidade à quimioterapia. PLoS ONE 8 (7): e69760. doi: 10.1371 /journal.pone.0069760
editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |
Recebido: 14 de fevereiro de 2013; Aceito: 12 de junho de 2013; Publicação: 16 de julho de 2013
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Financiamento:. Os autores agradecem a Universidade de Bioquímica e Microbiologia Marshall Serviços de cirurgia por seu apoio. Os presentes estudos foram apoiados por uma bolsa da Fundação Bean, e em parte pelo NIH bolsas CA131395, CA140024, e WV-INBRE 5P20RR016477 (para PPC) e em parte pelo NIH conceder R01CA114018 e concessão DOD W81XWH-10-1-0697 ( para WEH). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Câncer ou o National Institute of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal é a terceira principal causa de morte por câncer no mundo ocidental ea cada ano é responsável por meio milhão de mortes em todo o mundo [1], [2]. Apesar de ter recebido a ressecção cirúrgica e quimioterapia, quase 50% dos pacientes desenvolvem resistência, reincidência do tumor, ou doenças metastáticas [2], [3]. Descobertas recentes têm mostrado que isto pode ser devido, pelo menos em parte, à existência de câncer de células estaminais-like [4], o que reforça a necessidade de terapias melhoradas que pode orientá-las.
Um crescente corpo de evidência corrobora a ideia de que o câncer humano pode ser considerada uma doença de células-tronco. O modelo de cancro de células estaminais propõe que apenas uma fracção das células dentro de um tumor do cancro possuem potencial de iniciar e que estas células estaminais cancerosas-like (CSLCs) são capazes de iniciar e sustentar o crescimento do tumor [5], [6]. [4] Ricci-Vitiani e O’Brian [7] foram os primeiros a fornecer a prova independente da existência de CSLCs cólon. Eles isolada uma população CD133 (+) de células dentro do tumor que foi capaz de crescer como indiferenciadas colo-esferas num meio isento de soro, o que poderia ser diferenciada na população de células tumorais heterogéneas. Eles demonstraram que apenas a subpopulação CD133 (+) foi tumorigénico em um ensaio de xenoenxerto em série em ratinhos NOD /SCID imunodeficientes. Recentemente, tem sido demonstrado que a CD133 podem também ser utilizados para identificar CSLCs em linhas celulares estabelecidas. CD133 (+) células isoladas de linhas celulares de cancro foram encontrados para ser mais tumorigénico do que o CD133 (-) fracção celular tanto
in vitro
e
in vivo
[8]. Além disso, as células (CD133 +), cultivadas em esferas, manter a expressão deste marcador no mesmo esfera cultura a longo prazo [9]. Dados recentes de estudos clínicos mostraram que a expressão CD133 foi negativamente correlacionada com o prognóstico do paciente no câncer de cólon avançado [10], [11].
Estudos epidemiológicos têm mostrado um aumento da incidência de câncer de cólon em populações que consomem uma dieta ocidental, rica em carne vermelha, gordura animal e pobre em grãos. Esta incidência é reduzida em indivíduos que consomem maiores quantidades de frutas, legumes, fibras, e, mais importante, n-3 ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) de origem marinha [12], [13]. O pai n-3 PUFA ácido α-linolénico (ALA) é encontrado em óleo vegetal, enquanto que os seus metabolitos de ácido eicosapentaenóico (EPA) e ácido decosahexaenoic (DHA) são obtidos predominantemente a partir de peixe gordo de água fria. Muitos dados foram publicados sobre a capacidade de n-3 PUFAs para diminuir a proliferação, a exercer um efeito pró-apoptótica e de inibir a angiogênese em vários
in vitro
modelos de cancro do cólon [14] – [17] . PUFAs ómega-3 também tem sido demonstrado que o aumento da sensibilidade à quimioterapia de diversas culturas celulares de cancro derivadas de humanos
In vitro
tais como cancros da mama [18], cérebro e pulmão [19], linfocítica [20], e do cólon [15]. De um modo semelhante, o n-3 PUFAs sensibilizados
In vivo
modelos de cancro da mama [21], do sarcoma [22], leucemia e [23] para a terapia anticancerígenos. No entanto, todos estes estudos foram avaliados os efeitos de tratamentos de PUFAs na massa de células tumorais, e não nas CSLCs.
A actividade antitumoral de n-3 PUFAs tem sido associada não apenas aos seus efeitos sobre a proliferação e apoptose mas também na diferenciação de células em diferentes modelos. A ligação entre o PUFAs ómega-3 e promoção da diferenciação celular já foi descrito em células normais e malignas [24] – [28]. PUFAs ómega-3 têm sido mostrados para diferenciar as células progenitoras mielóides da medula óssea de ratos sem alteração do número de glóbulos brancos em circulação [24]. De um modo semelhante, demonstrou-se que os tratamentos de longo prazo de EPA e DHA, o que não altera a morfologia ou o número médio de células na secção cripta de mucosa do cólon normal em ratos, não reduziu a proliferação celular, aumentar a diferenciação e a apoptose [29].
Além disso, o tratamento de células de cancro da mama humano com PUFAs n-3 resultou na inibição do crescimento, que foi proporcional à diferenciação da glândula mamaria [27], e um efeito pró-diferenciação também foi observada em DHA células de melanoma humano tratados
in vitro
[26].
o objetivo do nosso estudo foi investigar se
in vitro
concentrações de EPA iguais aos níveis plasmáticos realizáveis na corpo humano após a suplementação da dieta com 2,4 g n-3 /dia [30], foram capazes de afetar o estado de diferenciação e quimio-sensibilidade da população total de células cancerígenas do cólon e, especificamente, dos CLSCs CD133 (+).
Materiais e Métodos
cultura celular
a linha de colorectal humana de células de adenocarcinoma COLO 320 DM (CCL-220, C de Duke) foi obtido a partir do tipo de coleção América cultura (Rockville, MA). Colo320DM células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10%, 2 mM de L-glutamina, penicilina 100 U /ml e estreptomicina 100 ug /ml (Hyclone, Sul Logan, UT). As células foram sub-cultivadas a uma densidade de 1 x 10
5 /ml duas vezes por semana, numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO
2.
produtos químicos e drogas
ácido eicosapentaenóico, EPA (ácido graxo Omega-3 polinsaturados, 20:05) foi comprado de Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI) e ácido esteárico (SA, ácidos graxos saturados, 18:0) da Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). 100 soluções de mM de EPA e SA em etanol absoluto foram feitas e diluído para a concentração final com meio de cultura.
A oxaliplatina e 5-fluorouracil foram comprados por Alexis Biochemicals (Farmingdale, Nova Iorque). 12,6 mM de soluções de reserva de oxaliplatina e 384,3 mM de 5-fluorouracilo em DMSO foram feitos e diluída até à concentração final com meio de cultura.
As células de controlo foram tratados com a mesma quantidade de veículo, etanol ou DMSO (CTRL VH). As concentrações finais de veículo nunca excedeu 0,1% v /v.
Cromatografia Gasosa
COLO 320 DM foram plaqueadas em 100 mm placas de petri (1 × 10
6 células) e tratou-se depois de 4 horas com controle de veículo ou de uma gama de concentrações de EPA e SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM). As composições de ácidos gordos de COLO 320 DM foram avaliadas usando cromatografia em fase gasosa. CTRL VH e as células tratadas foram colhidas após 96 horas, lavados em PBS1X para remover lípidos de superfície, em seguida, homogeneizadas em água destilada com 0,1% de BHT (3,5-di
terc-butil-4-hidroxi-tolueno ) em metanol para evitar a oxidação dos ácidos gordos. Os lípidos foram extraídos com clorofórmio /metanol, e, em seguida, transmethylated. lípidos metilados foram separados e identificados utilizando cromatografia em fase gasosa, como publicado anteriormente [31]. foram utilizados padrões de ésteres metílicos de ácidos gordos (Nu-Chek-Prep, Elysian, MN) para a identificação de pico.
Os ésteres metílicos dos ácidos gordos individuais de EPA, DPA (ácido decosapentaenoic), DHA e, SA foram relatados como a percentagem da soma dos ácidos gordos metilados no total (área sob a curva).
ensaio da actividade metabólica (MTT), tempo de percurso
COLO 320 células de MS foram plaqueadas em placas de 96 poços (3.000 células /poço). Após 4 horas, as células foram tratadas com uma gama de concentrações de EPA e o SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) ou controlo de veículo (CTRL VH) para 0-4 dias. As células foram então analisadas diariamente por actividade metabólica por ensaio MTT. Resumidamente, 10 uL de 5 mg /ml de MTT (brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazólio) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas durante 2 horas numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO
2. Após este tempo media foi removido, o sal de formazano formado foi solubilizada com DMSO e a absorvância foi lida a 570 nm com um leitor de micro-placa.
A contagem de células e de células activadas por fluorescência (FACS)
COLO 320 DM foram plaqueadas numa placa de 24 poços (2,5 x 10
4 /poço) e tratou-se depois de 4 horas, com uma gama de concentrações de EPA ou SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) durante 96 horas. As células viáveis foram contadas utilizando um método de exclusão de azul de tripano. Subsequentemente, as células foram suspensas em tampão FACS frio (PBS1X, 2 mM de EDTA, 0,1% de BSA) e as alíquotas das células, 2 × 10
5 células /50 ul, foram marcadas com a concentração apropriada de anticorpo monoclonal contra o CD133 /2 ( 293C3), phycoerytrin conjugado (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha). Um anticorpo de isotipo foi utilizado como um anticorpo de controlo para a normalização do fundo. A análise foi realizada com um Accuri-C6 Citómetro de fluxo (BD Accuri Citómetros, Ann Arbor, MI). Após a percentagem de positividade para CD133 foi determinada, o número de CD133 (+) e CD133 (-). Foi calculado células negativas dentro da população total
PCR em tempo real
COLO 320 DM eram plaqueadas em placas de 100 mm de petri (1 × 10
6 células) e tratados com veículo, EPA ou SA (25 uM). As células foram colhidas após 48 e 96 horas e o ARN total foi extraído das amostras usando Trizol de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). O RNA foi solubilizado em ddH2O e concentração de ácido nucleico foi medido através de um Nano gota 2,000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ARN (1 ug) foi submetido a inverter-polimerase de reacção em cadeia utilizando um Kit de Alta Capacidade de transcrição de cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA) e PCR em tempo real foi realizado com RT2 SYBR Green ROX qPCR mistura /mestre utilizando um ABI PRISM 7000 Sistema de Detecção de Sequência (Applied Biosystems, Foster City, CA). Alterações relativas na expressão de genes foram calculadas usando o método 2-ΔΔCt, descrito por Livak e Schmittgen [32]. β-actina foi usado como gene housekeeping
β
actina-F
:. GGT TCC GCT GCC CTG AGG;
β
actina-R
: GTC CAC GTC ACA CTT CAT G.
pares específicos de iniciadores foram utilizados para amplificar genes de interesse:
CD133-F
: TTG GCT CAG ACT GGT AAA TCC C;
CD133-R
: ATA GGA AGG ACT CGT TGC TGG T;
CK20-F
: ACC TCC CAG GCC TTG AGA T;
CK20-R
: TGG CTA ACT GGC TGC TGT AA;
MUC2-F
: GGG ACT GTG AGT GCT TCT GC;
MUC2-R
: AGT GGA TGC CGT TGA TGG T.
Western Blot
COLO 320 DM foram semeadas em 100 mm placas de petri (1 × 10
6 células) e tratados com veículo, EPA ou SA (25 uM), durante 48 e 96 horas. As proteínas totais foram extraídos a partir de células após lise em tampão de amostra de frio (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris /HCl, pH 8, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,1 mM, 1% de Triton X-100). dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida de electroforese em gel (SDS-PAGE) foi realizada de acordo com o método de Laemmli [33]. Quantidades iguais de proteínas totais de cada amostra foram sujeitos a electroforese em seguida, transferido para membranas de nitrocelulose de 0,45 UM. Após bloqueio em 5%, isento de gordura do leite em TBS-T, as membranas foram incubadas com os seguintes anticorpos: anti-CD133 /1 (AC133 Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha), anti-citoqueratina 20 (EPR1622Y Abcam, Cambridge, MA ). Anti-p actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi utilizado como controlo de carga. Após a incubação com os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano, os imunocomplexos foram visualizados por quimioluminescência melhorada sistema de detecção (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). As imagens foram adquiridas utilizando o sistema de imagem /FX Luminary (Fotodyne, Hartland, WI). Densitometria foi realizada com imagem j 1,45 software (Processamento de Imagem e Análise em Java) (imagej.nih.gov/ij/download/).
Dot Blotting
Dot blot foi realizada como descrito anteriormente [34]. Resumidamente, COLO 320 foram plaqueadas DM, tratados com veículo, EPA ou SA (25 uM), durante 48 e 96 horas e as proteínas foram extraídas tal como descrito na secção de análise Western blot. Quantidades iguais de proteínas totais de cada amostra foram manchados numa membrana de nitrocelulose de 0,45 UM. A ensaios de competição de péptidos foi realizada para verificar a especificidade do anticorpo Muc-2 (Pierce, ThermoScientifics, Waltham, MA). 300 ug de péptido feito à medida (CPDFDPPRQENETWW, péptido 2,0, Chantilly, VA) com uma sequência idêntica à utilizada para gerar o anticorpo Muc-2 foi incubado durante 2 horas à temperatura ambiente com 1 ug de anticorpo de MUC-2. Após bloqueio em 5% de leite livre de gordura em TBS-T, as membranas foram incubadas com anti-MUC-2 e anti-p actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como um controlo. Após a incubação com os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano, os imunocomplexos foram visualizados e visualizada como se descreveu na secção de análise Western blot.
Isolamento de cancro da população de células-tronco
CSCLs foram isolados usando um CD133 Microbead kit (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha). COLO população celular total de 320 DM foi marcada com um anticorpo monoclonal CD133 /2 (293C3) conjugado com micro-esferas e o CD133 (+) células magneticamente foram classificados. Uma alíquota de células eluídas a partir da coluna foi marcada com um anticorpo monoclonal contra o CD133 /1, phycoerytrin conjugado (AC133, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha) e uma análise de FACS foi realizada para avaliar a percentagem de pureza da CD133 (+) células.
Crescimento de inibição ensaio
COLO 320 células DM foram semeadas em placas de 96 poços (3.000 células /poço). Após 4 horas, as células foram tratadas durante 24 horas com uma gama de concentrações de oxaliplatina (0,005-0,1 mm) ou 5-fluorouracil (0,05-2 mM) para determinar a concentração que provoca 25% e 50% de inibição do crescimento. As células foram então analisadas quanto à sua atividade metabólica por um ensaio MTT.
Chemosensitivity ensaio
COLO 320 DM (3 × 10
3) células /poços, a população total ou CD133 (+) , foram plaqueadas em placas de 96 poços. Após 4 horas, meio completo suplementado com veículo, EPA ou SA foi adicionado para atingir uma concentração final de 25 uM FAs. Após 48 horas o meio foi substituído com meio fresco suplementado com uma gama de oxaliplatina (0,005-0,1 mM) ou 5-fluorouracilo (0,05-2 mM) concentração. Após 24 horas de tratamento de um ensaio de MTT foi realizado para definir a concentração de inibidor que conduzem a uma redução da viabilidade de 25% (IC25) e 50% (IC50).
A análise estatística
Todos experiências foram realizadas pelo menos três vezes e apresentados como médias ± DP. Todos os dados foram analisados utilizando software Prism © (Graphpad, Inc., La Jolla, CA). one-way análise de variância (ANOVA) com Tukey comparações múltiplas pós-teste foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças entre grupos experimentais:.
p
valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Resultados
ácido eicosapentaenóico é incorporada e metabolizada pelo COLO 320 células DM
Para avaliar a incorporação de ácidos graxos por COLO 320 células DM foi analisada a composição de ácidos graxos por cromatografia gasosa após o tratamento com EtOH (CTRL VH) ou com uma gama de concentrações (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) de PUFAs n-3, EPA, ou saturado FAs SA. Após 96 h as células foram colhidas e os lipidos totais foram extraídos. Primeiro detectamos que SA é 30 vezes mais representada na membrana celular veículo de controle lipídico total do que EPA, DPA e DHA. Foi observado (Figura 1A) uma dose aumento sensível significativa de EPA nas células tratadas com este ácido gordo. Além disso, a fracção correspondente ao DPA, que é um metabolito de EPA, também aumentaram após o tratamento EPA. Estes resultados mostraram que COLO 320 células DM incorporada e eficientemente metabolizado EPA. De um modo semelhante foi observado um aumento dependente da dose de teor de SA no total de lípidos de COLO 320 DM tratados com ácido esteárico (figura 1B).
Os lipídios totais foram extraídos a partir de células COLO 320 DM tratadas durante 96 horas com veículo de controlo (CTRL VH) ou uma gama de concentrações de (a) EPA ou (B) SA, (6.25-12.5-25 uM). A cromatografia gasosa foi realizada para estudar a incorporação de ácidos gordos e os seus metabólitos por COLO 320 células DM. Os resultados são apresentados como percentagem relativa em relação ao CTRL VH. Os resultados representam a média ± DP de pelo menos três experiências.
As barras pretas
: compostos utilizados para o tratamento detectado com GC;
barras cinza claro
: DPA (
docosapentaen�co Ácido
, C22: 5, n-3);
barras cinza escuro: DHA (ácido docosahexaenóico, C22: 6, n-3)
. (SA: C18 ácido esteárico: 0).
25 uM tratamento ácido eicosapentaenóico diminuiu o número de células de COLO 320 células DM sem afetar a população CSLCs
Diversas linhas de evidência mostraram a existência de uma pequena população de células-tronco cancerosas, como que pode iniciar e manter tumores. O uso de marcadores específicos, incluindo CD133 para CSLCs cólon, tem permitido aos pesquisadores rotular essas células e distinguir entre a população CSLCs e a maior parte do tumor [4], [7]. Ácidos gordos Omega 3, já foram relatados para reduzir a massa de células de tumor [14] -. [17], mas o efeito sobre CSLCs não foi determinada
Figura 2A e na Tabela 1 mostram que um curso de tempo de tratamento (0-96 horas) com 25 uM de EPA diminuiu significativamente o número de COLO 320 MS (população total) como medido pelo ensaio de MTT no que diz respeito ao controlo do veículo (p 0,01 a 72 horas; e p 0,001, 96 horas). Os tratamentos com 25 uM SA reduzidos a um menor grau, o número de células das células DM COLO 320 (Figura 2B e Tabela 1).
COLO 320 células DM foram tratados durante 0-96 horas, com controle do veículo (CTRL VH ) ou 6.25-12.5-25 uM de (A) e EPA (B) SA. MTT de EPA e SA células versus controle do veículo (CTRL VH) células tratadas tratada.
P
valores foram calculados com um teste ANOVA de sentido único com o pós-teste de comparação múltipla de Tukey sobre os vários tratamentos dentro de cada ponto de tempo. * P ≤ 0,05; ** P≤0.01; *** P≤0.001; n = 5. COLO 320 células DM também foram tratadas durante 96 horas com veículo de controlo (CTRL VH) ou uma gama de concentrações de ácidos gordos (6.25-12.5-25 UM), (C) e EPA (D) SA. As células viáveis foram contadas e marcadas com um anticorpo monoclonal anti-CD133 para determinar a percentagem de CD133 (+) células nos grupos tratados. Os resultados representam CD133 (+) e CD133 (-) do número de células ± desvio padrão de pelo menos três experiências.
p valores
foram calculados com o teste t de Student em amostras tratadas vs. CTRL VH (* p≤0,05).
A fim de definir quais população celular (a granel de tumor ou CSLC) foi afetada, primeiro tratado COLO 320 DM com uma gama de concentrações de EPA ou SA (6,25 uM, 12,5 uM, 25 uM) durante 96 horas. EPA afectados de modo diferente das duas sub-populações celulares (CD133 (+) e CD133 (-) células). Uma contagem de células com azul de tripano foi realizada depois que marcado alíquotas de células tratadas e não tratadas com um anticorpo monoclonal contra o CD133 /2 (epitopo glicosilada 2). A análise de separação de células activada por fluorescência foi realizada para determinar a percentagem de células positivas para CD133 e para calcular o número de CD133 (+) células na população total para cada amostra tratada. A Figura 2C mostra que os tratamentos com EPA diminuiu significativamente (P 0,05) o número de CD133 (-) células (massa de tumor), na concentração fisiológica de 25 uM. Curiosamente, o CD133 (+) CSLCs população era apenas um pouco afectado pela mesma concentração de EPA (25 uM) que provocou uma redução no número de células do CD133 (-) sub-população. O tratamento com SA, que é um ácido gordo saturado, não se alterou de forma significativa quer CD133 (+) ou CD133 (-) do número de células (Figura 2D). Em conclusão, mostrou que 25 uM EPA reduziu significativamente o número de COLO 320 DM em massa de células tumorais, mas que a SA não o fez.
ácido eicosapentaenóico induziu um aumento dos marcadores de diferenciação do epitélio do cólon, Cytokeratin 20 e mucina 2 , enquanto que a expressão de ARNm CSLCs decrescentes marcador, CD133
o filamento intermediário citoqueratina 20 é expressa em células epiteliais do tracto gastrointestinal. CK20 foi mostrado para ser regulados negativamente ou a sua expressão é completamente perdido em um número de amostras de pacientes colorectal câncer, quando comparado com a mucosa normal adjacente [35] – [37]. Da mesma forma, é menos MUC2 expressa em adenocarcinoma colorrectal, enquanto que a sua expressão é mantida no tecido normal adjacente ao tumor maligno [38] – [40]
CD133 foi reportado para marcar especificamente a pequena população de tumor indiferenciado de iniciação. células do cancro do cólon [4], [7] e para ser associado com mau prognóstico no câncer de cólon avançado [10], [11]. Para entender se EPA alterou a expressão do gene da CK20, MUC2 e CD133, nós tratados COLO 320 DM para 48 e 96 horas, com 25 uM EPA, SA, ou o controle do veículo. Observou-se que a EPA induzida por um aumento nos níveis de ARNm relativos de CK20, encontrada em ambos os enterócitos e células caliciformes (Figura 3a), e das células caliciformes marcador MUC2 (figura 3B), em comparação com as células tratados com veículo. Os efeitos observados foram estatisticamente significativos em ambos os 48 e 96 horas para CK20 e às 96 horas para MUC2. Observou-se também que a EPA induziu uma diminuição na expressão do marcador CD133 CSLCs às 48 e 96 horas (Figura 3C) (p 0,05 e 0,01). SA (figura 3A, 3B) diminuiu significativamente CK20 às 48 horas de tratamento, sem afectar a expressão MUC2. Observou-se também que o SA, por outro lado, o aumento da expressão de CD133 de ARN (Figura 3C), 96 horas após o tratamento. Estes dados sugerem que o ômega-3 tem um efeito pró-diferenciação de COLO 320 células DM.
COLO 320 células DM foram tratados com veículo de controlo (CTRL VH) e 25 uM de EPA ou SA para 48 e 96 horas . O ARN total foi extraído e em tempo real de RT-PCR foi realizada para estudar a mudança relativa na expressão de genes de marcadores específicos quando comparados com p-actina. A expressão dos marcadores de diferenciação (A) citoqueratina-20 (CK20), um enterócitos e células caliciformes marcador, cancro do cólon (B) A mucina-2 (MUC2) um marcador de células caliciformes, e (C) células estaminais-como o marcador CD133 eram estudada após tratamentos com veículo de controlo (CTRL VH), EPA ou SA. Os resultados representam a média ± DP de pelo menos três experiências.
p valores
foram calculados com o teste t de Student em amostras tratadas vs. CTRL VH (* P ≤ 0,05, ** p≤0.01).
25 uM de ácido eicosapentaenóico aumenta Cytokeratin 20 síntese de proteínas, enquanto diminui CD133 em células COLO320 DM
para determinar se a mudança na expressão de mRNA correlacionada com um efeito sobre a CK20, mucina 2, e síntese de proteína CD133, extraímos o conteúdo de proteína total de COLO 320 DM seguinte tratamento para 48 e 96 horas, com veículo, EPA e SA a 25 uM. Como previsto pela análise de PCR em tempo real, a proteína CD133 foi significativamente diminuída após 96 horas de tratamento EPA (Figura 4A e B). Observou-se que em 48 e 96 horas citoqueratina 20 níveis de proteína foram significativamente maiores nos 25 uM EPA células tratadas quando comparado com o controlo do veículo ou para o tratamento SA (Figura 4A e C), como demonstrado por análise de Western blot. Também foi observado que os níveis de proteína mucina 2 não mudou em 48 e 96 horas por análise dot blot em 25 uM EPA células tratadas quando comparado com o controle do veículo ou para o tratamento SA (Figura 4A e D). Para verificar a especificidade do MUC 2-anticorpo que foi utilizado para análise dot blot, foi realizado um ensaio de competição de péptidos e demonstraram que 300 vezes em excesso de péptido eficientemente competiu a ligação do anticorpo ao MUC-2 presente no lisado celular .
(a) lisado total foram obtidos a partir COLO 320 células DM tratados com veículo de controlo (CTRL VH), 25 uM EPA ou SA para 48 e 96 horas. Western blot foi realizada para estudar a expressão de citoqueratina-20 (CK20) e CD133 após o tratamento com os ácidos gordos. Dot blot foi realizada para estudar a expressão de mucina 2 (MUC2) após o tratamento com os ácidos gordos. Um péptido idêntico ao utilizado para gerar o anticorpo Muc-2 foi utilizado num ensaio de competição de péptidos para determinar a especificidade do anticorpo MUC2. As mudanças em (B), CD133, (C) CK20, e a expressão de proteína (D) MUC2 no que diz respeito a p-actina são representativos de três experiências separadas. Os resultados representam a média ± DP de pelo menos três experiências.
p valores
foram calculados com o teste t de Student em amostras tratadas vs. CTRL VH (* p ≤ 0,05, ** p≤0.01).
Em conclusão, observamos que EPA aumentou a expressão da proteína do marcador de diferenciação CK20, e diminuiu a expressão do marcador de CD133 stemness em células COLO 320 DM.
pré-tratamento com 25 uM de ácido eicosapentaenóico aumenta a sensibilidade de COLO 320 MS total populacional e CSLCs a 5-fluorouracil
a capacidade de ácidos graxos ômega-3 para melhorar a eficácia de drogas anticâncer tanto
in vitro Comprar e
in vivo
na maior parte do tumor células foi relatada anteriormente [15], [18], [19], [22], [23], [31]. No entanto, ainda não declarada são os efeitos sensibilizadores de quimioterapia de EPA sobre a maior parte do tumor em comparação com os efeitos sobre a população CSLCs seguintes tratamentos anticancerígenos padrão de atendimento.
Neste trabalho investigou se o pré-tratamento com EPA aumenta a resposta à quimioterapia de drogas anticâncer padrão de atendimento, tanto em massa de células e CSLCs tumor população cultivada a partir de COLO 320 células DM.
Nós descobrimos que 2,5 uM ou 10 uM oxaliplatina resultou em uma viabilidade celular de 75,88 ± 3,23% (IC
25) ou 53 ± 1,18% (IC
50) de controlo (Figura 5A). Nós descobrimos que 100 uM e 1,5 mM de 5-fluorouracil diminuiu COLO viabilidade celular 320 DM para 74,48 ± 4,85% (IC
25) e 52,90 ± 1,09% (IC
50) de controle (Figura 5B).
COLO 320 células DM (a) foram tratados com uma série de Oxaliplatina (0,005-0,1 mM) ou 5-fluorouracilo concentrações (0,05-2 mM) para determinar a concentração inibidora de 25% (IC25) e 50% ( IC50). (B) As células de COLO população total de 320 DM foram pré-tratadas durante 48 horas com 25 uM de EPA ou SA. Depois as células foram expostas durante 24 horas com oxaliplatina (
IC25, 2,5
UM; IC50, 10
um
) e 5 fluorouracil (
IC25, 100
uM; IC50, 1,5
mM
). (C) CD133 (+), as células foram magneticamente ordenados a partir da população total de COLO 320 DM e foram pré-tratadas durante 48 horas com 25 uM de EPA ou SA e, em seguida, expostos durante 24 horas a IC25 e IC50 de oxaliplatina e 5-fluorouracilo. Os resultados representam a média ± DP de pelo menos três experiências.
p valores
foram calculados com o teste t de Student em amostras tratadas vs. CTRL VH (* p ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001).
para determinar se AGPI n-3 foi capaz de aumentar a sensibilidade da população total de células COLO 320 DM para quimioterapia, banhado e pré-tratadas as células como anteriormente com 25 uM de ácido gordo de EPA ou SA. Após 48 horas, removeu os meios e as células tratadas durante 24 horas com o IC25 anteriormente definido e concentrações de IC50 para a oxaliplatina e 5-fluorouracilo (Figura 5 A e B). Descobrimos que EPA, mas não SA (Figura 5C, barras cinzentas claras), melhorou significativamente a eficácia de ambos os fármacos quimioterapêuticos (Figura 5C, barras pretas), em relação ao veículo de controlo.
Para definir se o mesmo tratamento com ácido gordo de 25 uM de EPA afectada similarmente CLSCs resposta à quimioterapia, foi testada a quimiossensibilidade de CD133 magneticamente classificados (+) COLO 320 células DM para a oxaliplatina e 5-fluorouracilo. CD133 (+) CSLCs foram pré-tratadas com 25 uM de EPA durante 48 horas, o que foi seguido por um tratamento durante 24 horas com oxaliplatina ou 5-fluorouracilo. Como demonstrado anteriormente por outros [41], observou-se que a CD133 (+) CSLCs foram mais resistentes aos fármacos antineoplásicos testados (Figura 5D, barras cinzentas escuras) quando em comparação com a população total (Figura 5C, barras cinzentas escuras). Curiosamente, verificou-se que a EPA pré-tratamento (barra preta), mas não SA (barra cinzenta-clara) aumentou significativamente a sensibilidade das células CD133 (+) CSLCs a 5-f luorouracilo, mas não a oxaliplatina (Figura 5D).
Em conjunto, esses dados sugerem que EPA potencia a eficácia de 5-fluorouracil, que é uma das primeira linha padrão de atendimento agentes antineoplásicos, contra o câncer de cólon.
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