Abstract

Fundo

A mortalidade é significativamente maior em pacientes sépticos com câncer do que em pacientes sépticos sem um histórico de câncer. Temos anteriormente descrito um modelo de câncer pancreático seguido por sepse de

Pseudomonas aeruginosa

pneumonia em que camundongos com câncer séptico apresentam maior mortalidade do que os ratos sépticos previamente saudáveis, associada ao aumento da apoptose intestino epitelial e diminuição da apoptose das células T. O objetivo deste estudo foi determinar se isso representa uma resposta do hospedeiro comum através da criação de um novo modelo em que tanto o tipo de câncer e do modelo de sepse são alterados.

Métodos

C57BL /6 ratinhos receberam uma injecção de 250.000 células da linha de cancro do pulmão LLC-1 para o coxa direita e foram seguidas de três semanas para o desenvolvimento de tumores palpáveis. Camundongos com câncer e ratos sem câncer foram então submetidos a ligadura e perfuração cecal e sacrificados 24 horas após o início da sepse ou seguido de 7 dias para a sobrevivência.

Resultados

Cancro ratos séptico tiveram maior mortalidade de ratinhos previamente saudável séptico (60% vs 18%, p = 0,003). camundongos séptico câncer havia diminuição do número e frequência de CD4 + do baço linfócitos secundárias ao aumento da apoptose, sem mudanças na CD8 + do baço números. proliferação intestinal também foi diminuída em ratos sépticos cancerosas. ratinhos sépticas cancro tinha uma maior carga bacteriana no interior da cavidade peritoneal, mas isto não foi associada com alterações no local de citocinas, neutrófilos ou respostas de células dendríticas. camundongos séptico câncer havia evidências bioquímicas da função renal piorou, mas não havia nenhuma evidência histológica de lesão renal.

Conclusões

Animais com câncer têm uma mortalidade significativamente maior do que os animais previamente saudáveis ​​seguintes sepse. Os mecanismos potenciais associados com esta elevada mortalidade diferem significativamente com base no modelo de câncer e sepse utilizado. Enquanto a apoptose de linfócitos e integridade intestinal são ambos alterados pela combinação de câncer e sepse, os padrões dessas alterações variam muito, dependendo dos modelos utilizados

Citation:. Lyons JD, Mittal R, Fay KT, Chen CW, Liang Z, Margoles LM, et ai. (2016) Murino Lung Cancer Aumenta CD4 + células T apoptose e diminui Gut proliferativa Capacidade na sepse. PLoS ONE 11 (3): e0149069. doi: 10.1371 /journal.pone.0149069

Autor: Philip Alexander Efron, University of Florida, United States |

Recebido: 26 de agosto de 2015; Aceito: 27 de janeiro de 2016; Publicação: 28 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Lyons et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (GM104323, GM095442, GM072808, GM109779, GM113228). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Dr. Coopersmith é o presidente da Society of Critical Care Medicine. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A sepse é uma das principais causas de morte entre pacientes criticamente doentes nos Estados Unidos com entre 230.000 e 370.000 pessoas que morrem da doença anualmente [1]. Os pacientes com doença maligna são cerca de dez vezes mais probabilidade de desenvolver sepse do que a população em geral [2], e câncer representa o co-morbidade mais comum em pacientes sépticos [3-5]. A sepse é também a principal causa de internação na UTI em pacientes com câncer [6,7]. Importante, câncer também é o co-morbidade associada ao maior risco de morte na sepse, com mortalidade hospitalar superior a 50% em pacientes com câncer e ou sepse grave ou choque séptico [5,7-9].

a etiologia por trás do aumento da mortalidade observada em pacientes com câncer que desenvolvem sepse em comparação com pacientes previamente saudáveis ​​que desenvolvem sepse é multifatorial [2,10]. Enquanto algumas mortes estão relacionadas com a imunossupressão causada pelo tratamento do câncer, como quimioterapia ou radioterapia, outros estão provavelmente relacionados com uma redução da capacidade do hospedeiro para responder adequadamente a infecção no contexto de mudanças sistêmicas crônicas relacionadas à doença subjacente. Os modelos animais de cancro, de forma isolada, demonstram que não só é o microambiente do tumor alterada, mas que o esgotamento de células T e a supressão imunitária sistémica generalizada também são induzidos pelo cancro [11]. Além disso, a resposta do hospedeiro a uma infecção não-letal é marcadamente alterada a seguir ao cancro, com exaustão fenotípica em células T associado com expressão crescente de receptores co-inibidor [12].

Existem numerosas semelhanças na resposta do hospedeiro para ambos cancro e sepsia [13]. Na tentativa de entender por que os hosts com câncer têm aumentado mortalidade após sepsis, em comparação aos anfitriões previamente saudáveis, descrevemos um modelo de câncer pancreático seguido por sepse de

Pseudomonas aeruginosa

pneumonia [14]. A mortalidade foi mais elevada em ratinhos séptico cancro do que os ratos previamente saudáveis ​​e isto foi associado com uma diminuição na apoptose de linfócitos T e um aumento da apoptose tanto epitelial do intestino e bacteremia. Curiosamente, impedindo linfócitos apoptose uma estratégia associada ao sucesso uniforme em outros modelos pré-clínicos de sepse-foi associada com aumento da mortalidade em ratos sépticos câncer [15].

Apesar de ter uma maior compreensão da fisiopatologia da sepse do que nunca [16-18], tem havido uma incapacidade notável para traduzir modelos pré-clínicos de sepse em tratamentos eficazes à beira do leito, onde a gestão é geralmente de suporte ainda não selectivo, com exceção da terapia antimicrobiana alvo [19]. Uma razão (de muitos) para o fracasso de ensaios pré-clínicos para traduzir em terapias eficazes para sepse é que estudos com animais são realizadas em uma população previamente saudável homogênea, enquanto que estudos em humanos são realizados em pacientes heterogêneos frequentemente com múltiplas co-morbidades. Como tal, procurou-se determinar se os nossos resultados pré-clínicos anteriores em câncer e sepse seria generalizável se alterou tanto o tipo de câncer e do modelo de sepse. Para examinar isso, foi desenvolvido um novo modelo clinicamente relevante de câncer de pulmão seguido de sepse induzida pela ligadura e perfuração cecal.

Materiais e Métodos

Animais

Homem e C57BL feminino /6 murganhos foram usadas em todas as experiências, com o correspondente género entre os grupos experimentais e de controlo. Os animais foram de 6-8 semanas de idade, antes do início das experiências. Um subconjunto de animais foram então injectados com células tumorais (em baixo) e todos os ratinhos foram, em seguida, observou por um período adicional de três semanas antes de um subconjunto foram submetidos a ligação cecal e perfuração (CLP, também descrito abaixo) no momento em que eles eram observados durante 1 dias -7, dependendo se eles foram usados ​​para a não-sobrevivência ou a sobrevivência experimentos. Assim, os animais foram um mínimo de 9 semanas de idade e um máximo de 12 semanas de idade no momento do sacrifício. Os experimentos foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Diretrizes saúde para a utilização de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use na Emory University School of Medicine (Protocolo DAR-2001875-082815BN). Todos os animais foram alojados em uma instalação universidade animais aprovados e tiveram livre acesso a comida e água por toda parte. Os animais que foram injectados com células de tumor foram monitorizados para assegurar que os tumores não ulceração e não impedem a deambulação animal de acordo com as orientações de Emory IACUC para a carga tumoral. Seguindo CLP, todos os animais receberam buprenorfina no pós-operatório em uma tentativa de minimizar o sofrimento animal. Para os estudos de não-sobrevivência, os animais foram sacrificados 24 horas no pós-operatório através de asfixia por CO2 ou sangria sob anestesia cetamina profundo. Um subconjunto diferente de animais foi seguido para a sobrevivência durante 7 dias pós-operatório. Durante esta experiência de sobrevivência, os animais foram verificados duas vezes por dia. Além de observar os mesmos parâmetros descritos acima circundante crescimento do tumor, os animais também foram verificadas para determinar se eles estavam moribundas relacionada com a operação. Os animais que cumpriram endpoints tumorais ou estavam moribundos foram sacrificados usando endpoints sem crueldade. foram identificados animais moribundos, da seguinte forma: a) complicações cirúrgicas que não respondem a intervenção imediata (deiscência da ferida, sangramento, infecção), b) condições médicas que não respondem ao tratamento, tais como auto-mutilação, angústia respiratória grave, icterícia, insuficiência de órgão major ou diarreia intratável, ou c) sinais clínicos ou de comportamento que não respondem a intervenção apropriada persistindo por 1 dia, incluindo inatividade significativo, dificuldade para respirar, olhos encovados, postura arqueada, piloereção /pêlo emaranhado, um ou úlceras de pele mais unresolving e vocalização anormal quando manuseado. Os animais que sobreviveram 7 dias de pós-operatório foram sacrificados na conclusão deste experimento usando asfixia por CO2.

Cancro modelo

A linha de células de carcinoma de pulmão murino (LLC1, American Type Culture Collection, Manassas , VA) foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10%, 1% de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina e 1% de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazina. A justificativa para o uso de uma linha de células do cancro do pulmão é que o cancro do pulmão tem a segunda maior taxa de mortalidade por tumores sólidos em pacientes sépticos (2) (câncer de pâncreas é o mais alto e foi usado para nossas experiências anteriores em sepse e câncer). Após expansão, as células cancerosas foram dissociadas dos frascos de crescimento através de incubação com 0,25% de tripsina, lavadas, centrifugadas durante 10 minutos a 1500 rpm e em seguida, re-suspenso em solução de fosfato tamponada (PBS) a uma concentração final de 250.000 células por 0,2 ml (Live As células seleccionadas por meio de exame com azul de tripano). Ratos randomizados para receber o câncer tinha uma única injecção subcutânea de 250.000 células tumorais ao longo da parte interna da coxa direita (grupo com câncer) e foram seguidos durante 3 semanas antes da CLP para permitir o crescimento do tumor. Os ratinhos de controlo foram unmanipulated e, portanto, não tinha nenhuma intervenção antes da CLP (grupo previamente saudável), mas foram vistos por um tempo idêntico como camundongos com câncer para que os animais seria a mesma faixa etária.

modelo de Sepse e grupos experimentais

um subconjunto de ratos com cancro e ratinhos previamente saudáveis ​​foram então sujeitas a CRE, um modelo estabelecido de peritonite polimicrobianas [20]. Resumidamente, sob anestesia com isoflurano, uma pequena incisão abdominal na linha média foi feita, e o ceco foi exteriorizado e ligou-se a seguir a válvula íleo-cecal, evitando obstrução intestinal. O ceco foi puncionada por duas vezes com uma agulha de calibre 25 e espremida suavemente para expulsar uma pequena quantidade de fezes. Depois de colocar o ceco volta no abdômen, a parede abdominal foi fechada em camadas. Imediatamente após CLP, os ratinhos receberam injecções subcutâneas de a) fluidos (1 ml de solução salina a 0,9%) para compensar perdas de insensíveis, B) antibióticos (50 mg /kg de ceftriaxona, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO e 35 mg /kg metronidazol, Apotex Corp, Weston, FL) para imitar o cenário clínico em que pacientes sépticos receber a terapia antimicrobiana e c) dor medicamentos (0,1 mg /kg Buprenex, McKesson Medical, San Francisco, CA) para minimizar a dor e sofrimento. Animais foram ou seguido de 7 dias de sobrevivência ou sacrificados em 24 horas para coleta de amostras. Os antibióticos foram re-administrado em doses de 12, 24 e 36 horas após a cirurgia em estudos de sobrevivência.

Nós já publicou uma extensa avaliação imunológica de câncer de pulmão em camundongos não manipuladas [11], portanto não repetir esses estudos. No entanto, não tínhamos anteriormente dados sobre muitos dos resultados testados neste estudo e experiências, de modo realizadas em ambos os sépticas e não sépticas animais sempre que adequado, a fim de compreender o impacto de câncer isoladamente, septicemia isoladamente, ea combinação de câncer e sepse. O seguinte é a terminologia utilizada para cada grupo experimental: a) unmanipulated (ratos que não receberam nem câncer nem sepsis), b) câncer (ratos que receberam injeção de células tumorais sozinho), c) sépticas previamente saudáveis ​​(ratos submetidos a CLP sozinho, sem prévia intervenção), e d) séptico cancro (ratos com injecção de células tumorais, seguida de três semanas mais tarde por CRE).

leucócitos análise

fenotípica análise de citometria de fluxo de leucócitos foi realizada em suspensões celulares transformados de esplenócitos (baços inteiros removido no momento do sacrifício) ou líquido peritoneal (2,5 ml PBS injetado peritônio e retirado após 5 segundos de agitação suave). O número de células por ml de suspensão foi calculado utilizando um Auto Nexcelom Cellometer, cujos resultados foram utilizados para determinar os números de células absolutos. Os anticorpos seguintes foram usadas para corar as células antes da análise: para o fluido peritoneal, anti-GR1.1 FITC (BD Bioscience, San Jose, CA), anti-CD11b PerCP (BioLegend, San Diego, CA), anti-CD11c PeCy7 ( eBioscience, San Diego, CA), e anti-MHC II da APC Cy7 (eBioscience); para fenotipagem de esplenócitos, anti-F4 /80 PerCP (BioLegend), anti-CD11c PeCy7 (eBioscience), anti-CD11b APC (eBioscience), anti-B220 Alexa700 (BD Bioscience), e anti-MHC II da APC Cy7 (eBioscience).

para determinar a frequência de linfócitos apoptóticos, esplenócitos foram coletadas de animais sacrificados e processados ​​a uma suspensão de 1×10

7cells /ml e 1×10

6 esplenócitos foram então processados ​​usando um comercialmente disponível anexina V e 7-AAD kit (BioLegend) instruções a seguir do fabricante. As células foram então coradas com anti-CD4-PO (Invitrogen, Carlsbad, CA), anti-CD8-PB (eBioscience) para determinar a frequência de células T CD4 e CD8 pró-apoptóticos. Uma estratégia gating excluídas as células mortas coradas positivamente para 7-AAD de análise.

Para as amostras submetidas a coloração de citocinas intracelulares, 1x 10

6 esplenócitos foram plaqueadas numa placa de 96 poços. As células foram suspensas e incubadas em meio de cultura RPMI 1640 e estimuladas durante quatro horas utilizando forbol 12-miristato 13-acetato (30 ng /mL) e ionomicina (400 ng /mL) com 10 ug /mL de Brefeldin A a 37 ° C. Após a estimulação, as células foram coradas com anti-CD4 PacBlue (BD Bioscience), anti-CD8 PacOrange (Life Technologies Carlsbad, CA), anti-IL-2 com FITC (BD Bioscience), anti-IL-4 de PE (eBioscience), anti-CD44 PerCP (BioLegend), anti-R4CC PeCy7 (BioLegend), anti-CXCR3 APC (eBioscience), e anti-IFNy Alexa700 (BD Bioscience). Um fluxo LSR II citômetro (BD Biosciences) foi usado para executar todas as amostras e software FlowJo 10.0.8r1 (Árvore Star, San Carlos, CA) foi utilizado para analisar todos os dados.

permeabilidade intestinal

Aos 19 horas seguintes CLP, os ratinhos foram tratadas por gavage com 0,5 ml de isotiocianato de f luoresceina-dextrano (FD4) a uma concentração de 22 mg /ml em PBS (Sigma-Aldrich) [21,22]. Plasma colhido na altura do sacrifício 5 horas mais tarde foi então diluída com um volume igual de PBS, e a concentração foi determinada por FD4 flourospectrometry com comprimentos de onda de excitação /emissão de 485/520 nm com uma curva padrão de diluições em série (Biotex Synergy HT, Winooski, VT).

intestinal proliferação

a proliferação de células epiteliais do intestino foram coradas com 5-bromo-2’desoxiuridina (BrdU). As células em fase S em 90 minutos antes do sacrifício, os ratos receberam injecções intraperitoneais de BrdU (5 mg /ml em 0,9% de solução salina, Sigma-Aldrich) para rotular [23,24]. tecido de jejuno foi então fixado em 10% de formalina durante 24 horas antes de serem embebidos em parafina e em secções de 5 um em lâminas. As lâminas foram depois desparafinizadas, reidratadas e incubadas em peróxido de hidrogénio a 1% durante 15 minutos antes de ser aquecida em uma panela de pressão em decloaker antigénio (Biocare médica, Concord, CA) durante 45 minutos. bloco de proteína (Dako, Carpinteria, CA) foi realizada durante 30 minutos à temperatura ambiente e as lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo monoclonal de rato anti-BrdU (1: 500; Accurate Chemical e Scientific, Westbury, NJ). As amostras foram então incubadas com anticorpo de cabra anti-rato (1: 500; Accurate Chemical Scientific) e estreptavidina peroxidase de rábano (1: 500; Dako), cada um durante uma hora à temperatura ambiente. Diaminobenzidina (DAB) foi utilizada para desenvolver as lâminas durante 2-3 minutos, e A contracoloração foi realizada com hematoxilina. As células BrdU-positivas foram quantificados em 100, criptas intestinais bem orientadas contíguos

intestinal apoptose

A apoptose de células epiteliais intestinais foi quantificada utilizando duas técnicas complementares:. caspase-3 activa de coloração e análise morfológica de secções coradas por hematoxilina-eosina [25,26]. Os cortes foram tratados como acima com decloaker antigénio e foram então bloqueadas com 20% de soro de cabra normal (Vector Laboratories, Burlingame, CA). As lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com coelho-caspase-3 anti (1: 100; Cell Signaling, Beverly, MA), e depois com anticorpo de cabra anti-coelho biotinilado (1: 500; Vector Laboratories) e estreptavidina peroxidase de rábano ( 1: 500; Dako) durante uma hora cada um, à temperatura ambiente. As lâminas foram desenvolvidas com DAB e então contrastadas. células positivas caspase-3 foram contados em 100 criptas intestinais contíguas.

As células apoptóticas foram identificados em seções hematoxilina-eosina-manchada por identificar alterações morfológicas características incluindo encolhimento celular com núcleos condensados ​​e fragmentados e quantificá-los em 100 criptas contíguas .

comprimento das vilosidades

villus comprimento foi medido como a distância em mm do pescoço cripta até a ponta das vilosidades em 12 vilosidades jejunal bem orientado consecutivo usando Nikon Elementos de imagem em software EIS-Elements BR 3,10 (Nikon Instruments, Melville, NY).

As culturas bacterianas

culturas quantitativas de sangue total e líquido peritoneal foram preparados a partir de diluições de 10 vezes em série de amostras em solução salina estéril a 0,9%. Uma alíquota de 100 ul da amostra não diluída e cada diluição a partir de 10

-1 10

-3 foi plaqueada em placas de agar de sangue (Remel, Lenexa, KS) e incubou-se a 35 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 ambiente durante 24 horas. as contagens de colónias foram obtidos a partir de placas contendo menos do que 300 colónias. O número de unidades formadoras de colónias (CFUs) por ml da amostra original foi determinada multiplicando o número de colónias por o recíproco da diluição contadas e ajustadas para o volume da amostra inoculada.

Citocinas

O sangue inteiro, fluido de lavagem broncoalveolar e fluido peritoneal (BAL) foram recolhidas e em seguida centrifugou-se a 10000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante a partir de cada um foi, em seguida, recolhidas e analisadas quanto à concentração de citocinas utilizando uma matriz de 6-Plex citocina de saliências de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

A função renal

Total sangue foi centrifugado a 10000 rpm durante 10 minutos. A creatinina do soro foi então medida utilizando um ensaio de creatinina de microplacas (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, MI), enquanto azoto da ureia no sangue (BUN) foi determinada utilizando um kit de detecção colorimétrica de azoto de ureia (Ensaios Arbor, Ann Arbor, MI). rins inteiros foram removidos e fixados em formalina a 10% durante 24 horas antes da fixação de parafina e de corte. Após a coloração hematoxilina-eosina, os cortes foram avaliadas por lesão por um patologista cegado para a identidade da amostra (ABF). Os pesos dos animais foram medidos no momento do CLP e imediatamente antes do sacrifício para avaliar a perda de peso potencial devido à desidratação.

A lesão hepática

A lesão hepática foi avaliada por ambas as enzimas hepáticas e histologia. A alanina aminotransferase (ALT) foi medida num AU480 química auto-analisador Beckman (Beckman Diagnostics, labrea, CA) seguindo as instruções do fabricante. Além disso, porções de fígado inteiro foram removidos e fixados em formalina a 10% durante 24 horas antes da inclusão em parafina. Os cortes foram em seguida, deslize-montadas e coradas com hematoxilina-eosina para análise por um patologista (ABF) cegos para provar identidade.

Lung lesão

Para a análise histológica, pulmões dos animais foram lavados com 1 ml de formalina a 10%, e secções foram então retirados e fixados em formalina a 10% durante 24 horas antes de serem embebidos em parafina. secções de pulmão foram então coradas com hematoxilina-eosina e examinados por um patologista (ABF) cegos para provar identidade.

atividade da mieloperoxidase (MPO) também foi avaliada em LBA. A traqueia foi irrigada com 1 ml de PBS e o fluido foi então retirado e centrifugado a 10000 RPM durante 10 minutos. tampão de substrato contendo 0,0005% de peróxido de hidrogénio e O-dianisidina foi adicionado ao sobrenadante e a actividade de MPO foi ensaiada ao longo de 6 minutos, no comprimento de onda de 460 (BioTek Synergy HT, Winooski, VT). actividade de MPO foi calculada como densidade óptica /minuto por ul de fluido de BAL.

concentração de proteína de fluido

pulmonar foi medida por análise de amostras tratadas com o reagente de ensaio de proteína (Thermo Scientific, Rockford, IL) a 660 nm, em conjunto com um curva padrão de albumina do soro bovino.

hemogramas completos

O sangue total coletado no momento do sacrifício foi coletado em tubos de sangue anti-alinhado-coagulantes e foi analisado para a concentração de hemoglobina, contagem de leucócitos, e contagem de plaquetas em um Heska HemaTrue

® veterinária analisador hematológico por instruções do fabricante (HESKA, Loveland, CO).

Estatísticas

Todos os dados foram analisados ​​usando o programa de software estatístico Prism 6.0 (GraphPad , San Diego, CA) e estão apresentados como média ± SEM. Os dados foram testados para a distribuição de Gauss usando o teste de normalidade omnibus D’Agostino-Pearson. Dois comparações -WAY sobre os dados com uma distribuição de Gauss foram realizadas utilizando o teste t de Student. Two-way comparações sobre dados que não têm uma distribuição de Gauss foram realizadas utilizando o teste de Mann-Whitney. comparações Multi-grupo foram analisados ​​através de ANOVA one-way, seguido do pós-teste de Tukey. A sobrevivência foi analisada pelo teste de Log-Rank. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todo

Resultados

Os ratos que receberam injeções subcutâneas de células de câncer de pulmão de murino desenvolveram tumores solitários bem circunscritos no local da injecção três. semana mais tarde (tamanho médio de 1,5 cm de diâmetro). revisão post-mortem da histologia do pulmão demonstrou doença metastática microscópica em alguns animais, apesar de não disseminação do tumor bruta foi observada em todos os animais no momento do sacrifício.

A presença de cancro do pulmão preexistente piora mortalidade após sepse

mortalidade em sete dias foi de 18% nos ratos sépticos previamente saudáveis. Em contraste, a mortalidade em sete dias foi de 60% no câncer de ratos séptico (Fig 1).

ratos previamente saudáveis ​​e aqueles que receberam uma injeção de células LLC1 três semanas antes (n = 15-17 /grupo) foram submetidas a CLP. camundongos séptico câncer havia mortalidade significativamente maior do que os ratos séptico previamente saudáveis ​​(p = 0,003).

A presença de cancro do pulmão pré-existente diminui linfócitos CD4 +, mas não linfócitos CD8 + seguinte sepse

camundongos séptico câncer teve uma redução tanto na frequência e número absoluto de CD4 + do baço linfócitos em comparação com camundongos séptico previamente saudável (Fig 2A e 2B). Além disso, os ratinhos séptico cancro tinha uma frequência mais elevada de anexina-positivo coloração linfócitos CD4 + em comparação com ratinhos sépticas anteriormente saudáveis, sugerindo um aumento da apoptose era responsável pela perda de células CD4 + (fig 2C e 2D). Em contraste, enquanto que a frequência de linfócitos do baço CD8 + foi maior em ratinhos séptico cancro (Fig 3A), este foi provavelmente devido ao decréscimo das células CD4 + uma vez que não foi observada diferença no número de células CD8 + (Fig 3B) ou coloração com anexina (Fig 3C e 3D) entre ratos sépticos cancerosas e ratos sépticos previamente saudáveis. expressão de células CD4 + do marcador ao CXCR3 Th1 foi aumentada em ratinhos séptico cancro (Fig 4A e 4C), enquanto que a expressão do marcador de CCR4 Th2 não foi diferente entre ratos saudáveis ​​anteriormente sépticas e ratinhos séptico cancro (Fig 4B e 4C). produção estimulada de Th1 efetoras citocina IFN-γ pelas células T CD4 + não foi afetada pelo câncer (Fig 4D, 4F e 4G), enquanto a produção do Th2 efetoras IL-4 foi diminuiu significativamente em ratos séptico câncer (Fig 4E, 4F e 4G) .

cancro ratinhos séptico tinha uma frequência significativamente mais baixa de células T CD4 + como uma percentagem do total de células T CD3 + (a, p = 0,02, n = 7-9), bem como uma diminuição no número total de As células T CD4 + (B, p = 0,03, n = 8-10), em comparação com os ratinhos sépticas anteriormente saudáveis. Isto foi associado com um aumento das células T CD4 + anexina-positivo em ratinhos séptico cancro (C, p = 0,04, n = 7-8). Um fluxo representante citometria histograma demonstra um aumento da coloração de anexina no séptico cancro (azul) células T CD4 + em comparação com células T CD4 + séptico previamente saudável (vermelho) (D).

Cancro ratos séptico teve um aumento significativo da frequência de células T CD8 + como uma percentagem do total de células T CD3 + (a, p = 0,007, n = 8-10). No entanto, não houve qualquer alteração estatisticamente significativa no número total de células CD8 + (B, p = 0,10, n = 8-10) ou anexina-positivo células T CD8 + (C, p = 0,31, n = 7-10), sugerindo a mudança na percentagem de células CD8 + foi relacionado com o decréscimo das células CD4 +. Um fluxo representante citometria histograma demonstra nenhuma diferença na coloração de anexina no séptico cancro (azul) e séptico previamente saudável (vermelho) células T CD8 + (D).

Ratos séptico

Cancro teve um aumento modesto em CD4 + T expressão celular do tipo Th1 marcador CXCR3 (a, p = 0,01, n = 9-10), mas não têm uma alteração estatisticamente significativa na expressão do marcador de CCR4 Th2 (B, p = 0,21, n = 9-10). Um lote de citometria de fluxo representativo para ambos os marcadores está incluída (C). produção estimulada de IFN-γ não foi estatisticamente diferente nas células T CD4 + a partir de ratinhos do cancro séptico (D, p = 0,17, n = 9-10); No entanto, estimulou a produção de IL-4 foi mais baixa em células T CD4 + a partir de ratinhos do cancro séptico (E, p = 0,006, n = 9-10). fluxo representante citometria de lotes para tanto não estimuladas e estimuladas IFN-γ e IL-4 são mostradas para ratos previamente saudável séptico (F) e camundongos séptico câncer (G).

A presença de pulmão pré-existente câncer diminui a capacidade para limpar a infecção

carga bacteriana peritoneal local, foi maior nos ratos séptico câncer do que os ratos séptico previamente saudável (Fig 5A). Este não foi associada com as alterações nos níveis de interleucina (IL) -1β, IL-6, IL-10, IL-13, MCP-1, TNF-α, ou IFN-γ no fluido peritoneal (Fig 5B-5H). líquido peritoneal também continha percentagens semelhantes de neutrófilos (Fig 6a) e células dendríticas (Fig 6B) entre ratos sépticos previamente saudáveis ​​e ratos sépticos câncer. activação das células dendríticas, como determinado por expressão de MHC II em células de fluido peritoneal também foi semelhante entre os grupos (Figura 6c). frequência de células dendríticas do baço e de activação também não foram afectados pela presença de cancro (Figura 6D e 6E). Não houve diferença no número absoluto de neutrófilos ou de células dendríticas (dados não mostrados).

Ratinhos séptico

Cancro tinham níveis mais elevados de bactérias nas suas cavidades peritoneais do que os ratos séptico previamente saudável (A, p = 0,005, n = 8-9). Esta mudança não foi associada com as diferenças na concentração de peritoneal IL-1β (p = 0,32), IL-6 (p = 0,18), IL-10 (p = 0,52), IL-13 (p = 0,97), a MCP-1 (p = 0,67), o TNF-α (p = 0,40), ou IFN-γ (p = 0,27) (BH, N = 8 para todos os grupos).

ratinhos sépticas

cancro e previamente saudável ratinhos séptico tinham frequências semelhantes de neutrófilos (a, p = 0,52, n = 7 /grupo) e células dendríticas (B, p = 0,52, n = 7 /grupo) no seu fluido peritoneal, e não houve diferença na frequência de a expressão de MHC II de células dendríticas entre os dois grupos (C, p = 0,52, n = 7 /grupo). ratos sépticos cancerosas e ratos sépticos previamente saudáveis ​​também tinham frequências semelhantes de células dendríticas (D, p = 0,73, n = 9-10) e ativado células dendríticas (E, p = 0,83, n = 9-10) em esplenócitos.

citocinas no soro foram semelhantes entre os ratos sépticos cancerosas e ratos sépticos previamente saudáveis, exceto para um aumento da MCP-1 em ratos séptico câncer (Fig 7). Não houve diferença na carga bacteriana foi identificada em culturas de sangue quantitativas entre os ratos saudáveis ​​e sépticos anteriormente ratinhos séptico cancro (dados não mostrados).

Não foram observadas diferenças significativas nos níveis de IL-1β (p = 0,10), IL-6 (p = 0,63), IL-10 (p = 0,24), IL-13 (p = 0,07), ou TNF-α (p = 0,99) (BF, n = 7-8 /grupo). Em contraste, o aumento da MCP-1 foi detectado no soro de ratinhos séptico cancerosas em comparação com ratinhos previamente saudável séptico (E, p = 0,04, n = 7-8).

A presença de pré- câncer de pulmão existente diminui a proliferação das criptas, mas não altera outros componentes da integridade intestinal seguintes sepse

Cancro em isolamento diminui a proliferação das criptas em comparação com ratos não manipuladas. Sépsis isoladamente também diminui a proliferação da cripta em comparação com ratinhos não manipuladas. A combinação de câncer e sepse provoca uma diminuição adicional desproporcional na proliferação cripta em comparação com sepse sozinho como ratos sépticos cancerosas têm a proliferação menor do que os ratos séptico previamente saudável (Fig 8A-8C).

camundongos séptico Anteriormente saudável (A) qualitativamente tinham níveis mais elevados de proliferação do que os ratos do cancro séptico (B, positivas para BrdU células da cripta mancha castanha). Quantitativamente, ambas cancro no isolamento e sepsia em proliferação isolamento diminuição cripta (C, P = 0,02 e 0,008, respectivamente, em comparação com ratos não manipulados). A combinação de cancro e sépsis diminuiu ainda mais a proliferação intestinal, mais ainda do que foi observada com ambas as variáveis ​​isoladamente (p 0,001 vs séptico previamente saudável séptico cancro, n = 8-10 para todos os grupos no painel C). Em contraste, enquanto que o comprimento das vilosidades foi diminuída por sépsis (mas não o cancro) isoladamente (p = 0,008), não houve diferença no comprimento das vilosidades entre séptico previamente saudável e ratinhos séptico cancro (D, P 0,99, n = 8-9 para todos os grupos).

em contraste, o comprimento das vilosidades não é afectada pelo cancro em isolamento, é diminuída tal como foi previamente mostrado por sépsis (26), mas não é diferente entre ratos sépticos e saudáveis ​​anteriormente ratinhos sépticas de cancro (Fig 8d). Câncer e sepse, também não teve impacto permeabilidade intestinal ou apoptose cripta em comparação com somente sepse (dados não mostrados).

A presença de cancro do pulmão preexistente piora da função renal bioquímica sem causar lesão hepática seguinte sepse

nem câncer nem sepse isoladamente afetados função renal como os níveis de BUN e Cr foram semelhantes em unmanipulated, câncer e ratos sépticos previamente saudáveis. Em contraste, tanto BUN e Cr foram mais elevados em ratos séptico cancro (Fig 9A e 9B); No entanto rins grosseiramente apareceu histologicamente normal (dados não mostrados).