Abstract
modificação da histona desempenha um papel fundamental na regulação de genes, como considerado como marcadores epigenéticos globais, especialmente em genes relacionados tumorais. Por isso, as abordagens químicas visando enzimas modificadoras de histonas surgiram no palco principal da descoberta droga anticâncer. Aqui, nós investigamos os potenciais terapêuticos e papéis mecanicista do inibidor da histona deacetilase recentemente desenvolvido, CG200745, em células de câncer de pulmão de células não-pequenas. O tratamento com CG200745 aumentou o nível mundial de acetilação da histona, resultando na inibição da proliferação de células. análise ChIP-on-chip com um anticorpo alterado H4K16ac mostrou H4K16 acetilação em genes críticos para a inibição do crescimento celular, embora diminuído no local de início da transcrição de um subconjunto de genes. Altered H4K16ac foi associada com alterações na expressão de ARNm dos genes correspondentes, os quais foram depois validados em ensaios de RT-PCR quantitativo e Western blotting. Nossos resultados demonstraram que CG200745 provoca a inibição do crescimento de células NSCLC através da modificação epigenética de genes críticos para a sobrevivência da célula cancerosa, fornecendo pistas cruciais como um quimioterapêuticos promissores contra o câncer de pulmão
Citation:. Chun SM, Lee JY, Choi J, Lee JH, Hwang JJ, Kim CS, et al. (2015) epigenética Modulation com HDAC Inibidor CG200745 Induz Anti-Proliferação em Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (3): e0119379. doi: 10.1371 /journal.pone.0119379
Editor do Academic: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, CHINA
Recebido: 22 de agosto de 2014; Aceito: 30 de janeiro de 2015; Publicação: 17 de março de 2015
Direitos de autor: © 2015 Chun et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. subsídios suportados para o estudo foram a coreana Saúde Tecnologia R D Project, Ministério da Saúde Bem-estar, República da Coreia (HI06C0868, HI10C2014), líder em pesquisas Foreign Programa Instituto Recrutamento, Fundo de Promoção de Pesquisa Básica e Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
modificações epigenéticas, como metilação do DNA CpG ou acetilação das histonas são considerados como um passo importante no desenvolvimento do câncer e, portanto, têm sido estudados para descobrir biomarcadores de câncer e Stratege terapêutica [1-3]. Uma vez que ocorre metilação da citosina em dinucleótidos CpG através da acção da ADN-metiltransferase (DNMT), a citosina metilo é mantida para a próxima geração, devido à falta de um ADN-transferase de-metilo em mamíferos. A modificação da histona irreversível foi também utilizado como um biomarcador para o diagnóstico precoce ou prognóstico de cancro, bem como um alvo eficaz na terapêutica do cancro [4,5]. A acetilação ou metilação em resíduos de lisina de H3 e H4 caudas amino terminais são modificações de histonas dominantes, e cada um é responsável pela expressão de genes ligados. Por exemplo, methylations em lisina 4 de H3 e lisina 27 de H3 são conhecidos como activador da transcrição e reprimir eventos para genes ligados histonas, respectivamente. acetilação de histona na lisina 16 de H4 está relacionada com a activação da transcrição e /ou de iniciação da replicação de genes correspondentes. Em células normais, a acetilação de histona está precisamente controlada pela histona acetil transferase (HAT) e histona-desacetilase (HDAC). Hiper-acetilação de oncogenes ou hipo-acetilação de genes supressores de tumores, no entanto, é frequentemente observado em vários cancros. inibidores de HDAC (HDACi) são os mais desenvolvidos fármacos anti-cancro de segmentação modulação epigenética e estão a ser aplicado para o tratamento de vários cancros, em particular em tumores sólidos, tais como cancro da mama, cólon, pulmão, e cancro do ovário, bem como em tumores hematológicos , tais como linfoma, leucemia, mieloma e [6-9]. Além disso, a desregulação epigenética do cancro do pulmão é muitas vezes relacionada com a sobre-expressão de HDAC1 e metilação aberrante de certos genes, resultando em eficácia terapêutica da combinação de terapia epigenética alvo de metilação de DNA e desacetilação da histona. HDACs compreendem três classes: Classe I, HDAC 1, 2, 3 e 8; Classe II, HDAC 4, 5, 6, 7, 9 e 10; e Classe III, HDAC 11 (sirtuins 1-7) [10,11]. HDACi, tricostatina A (TSA) [12,13] ou vorinostat (SAHA) [14-16] inibir as enzimas HDAC de classe II e I, resultando na paragem do crescimento, a apoptose, diferenciação, e anti-angiogénese de células de cancro, quando utilizado independentemente ou em combinação com outros agentes anti-cancro. Mecanisticamente, a restauração de genes supressores de tumores silenciados ou supressão de oncogenes activados em células cancerosas desempenha um papel fundamental nos efeitos anti-cancro de drogas. Isto é seguido pela indução de paragem do ciclo celular na fase G1 através da expressão das proteínas p21 e p27, ou a /M atraso transição G2 através da regulação negativa da transcrição de ciclina B1, PLK1, e survivina.
HDAC inibidor CG200745, (E) -N (1) – (3- (dimetilamino) propil) -N (8) -hidroxi-2 – ((naftaleno-1-Loxy) metil) oct-2-enediamide, foi desenvolvido recentemente e atualmente passando por uma fase I de ensaios clínicos. O seu efeito inibitório sobre o crescimento celular tem sido demonstrada em vários tipos de células de cancro, incluindo cancro da próstata, carcinoma de células renais, e células RKO (células de carcinoma do cólon) em mono- e combinacional-terapia com outros fármacos anticancerígenos [17-19]. O mecanismo subjacente à inibição do crescimento celular de células RKO CG200745 no foi demonstrado que ocorrem de um modo dependente da p53 [19]. Importante, CG200745 aumentou a acetilação de resíduos de lisina em p53 K320, K373, K382 e. CG200745 também induziu a acumulação de p53, promoveu a transactivação dependente de p53, e aumentou a expressão de proteínas codificadas por genes alvo p53,
MDM2
e
p21
(WAF1 /Cip1) no cancro da próstata humana células. No presente estudo, foram avaliados os efeitos antitumorais e explorou os alvos diretos de uma CG200745 em células não-pequenas de câncer de pulmão de células (NSCLC) para verificar a indicação de câncer adicional. Analisou-se a proliferação celular e padrão de expressão genética alterada mediante desacetilação histona através de ensaio de ChIP-on-chip, em tempo real quantificação PCR e transferência de Western. Nossos resultados sugerem que o inibidor HDAC CG200745 provoca a reactivação epigenética de genes críticos que são transcricionalmente reprimida em cancros e, portanto, pode ser um câncer de NSCLC prometendo terapêutico.
Materiais e Métodos
Química e linhas celulares
Os inibidores de HDAC (HDACi), hydroamic suberoylanilide (vorinostat, SAHA) e CG200745, foram fornecidos pela Crystal Genomics Co. (Seoul, Rep. Coreia). Estes compostos foram dissolvidos em DMSO e armazenado a -20 ° C até à sua utilização. linhas de células humanas do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) e uma linha epitelial brônquica normal imortalizada de células (Beas-2B) foram adquiridos da American Type Culture Collection (Rockville, MD). Todas as linhas celulares foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U /mL de penicilina, 100 ug e /mL de estreptomicina, com 5% de CO
2 a 37 ° C.
Western blotting
50 ug de extractos celulares totais foram corridas em géis de SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas e incubadas com anticorpos primários específicos contra H4K16ac, CCND1, p21, e caspase 3 (Cell Signaling, Beverly, MA), anti-H4S1 /K5 /K8 /K12Ac de Santa Cruz (Santa Cruz, CA) e β- actina a partir de Sigma (St. Louis, MO). Após incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano apropriado, as bandas foram detectadas utilizando o reagente de ECL (Amersham-GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA).
-PCR quantitativo em tempo real
preparação de ARN total e a síntese de ADNc foram realizadas utilizando TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA), e III SuperScript First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). Quantitative PCR em tempo real foi realizado utilizando a energia SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Grand Island, NY) no sistema IQ5 multicolorido detecção em tempo real (Bio-Rad) com cada um iniciador directo e de
CCNA2
,
CCNB1
,
CCND1
,
CCNE2
,
CDK2
,
Bax-a
,
Bcl 2
,
p16
,
p21
,
p27
, e
Mxi1
(Bionics, Seoul, Coreia do Sul) (S1 Tabela).
citotoxicidade ensaio
O IC
50 de cada HDACi em células de câncer de pulmão foi determinado através de ensaio de proliferação celular utilizando CellTiter 96 AQ
ueous Um Reagente Solution (Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante. Depois de um tempo diferente período de incubação com HDACis, a absorvência foi então medida a 490 nm na Wallac 1420 Victor3 com software WorkOut 2.
FACS ensaio
foi analisado o efeito de CG200745 no ciclo celular NSCLC em citometria de fluxo utilizando coloração com iodeto de propídio (PI). Após incubação com CG200745 ou DMSO, as células foram fixadas com gelo frio de 70% de etanol a 4 ° C durante a noite. O ADN genómico foi corado com 30 ug de PI /ml e a fluorescência foi medida com uma máquina de FACS Calibur (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). A fluorescência vermelha devido ao DNA PI-coradas foram recolhidos a 560 nm espelho dicróico e um filtro de passagem de 600 nm (largura de banda de 35 um). Um total de 10.000 células foram recolhidas por FACS e analisadas usando o celular Busca 3.1 software (Becton Dickinson).
cromatina imunoprecipitação (CHIP)
Os ensaios ChIP foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente, as células tratadas com 3 um CG200745 ou DMSO durante 24 h foram precipitados com um anticorpo anti-acetil-H4K16 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Depois de reticulação com 1% de formaldeído, cromatina foi fragmentado em 300 ~ 800 pb de tamanho por sonicação em Bioruptor, UCD-200 (Diagenode, Denville. NJ). complexos de cromatina /proteína foram precipitados com um anticorpo de histona modificado proteína específica e A /G mais esferas de agarose imobilizadas. Após eluição das contas, o precipitado de DNA-proteínas foram inversa reticulado e DNA foi purificado com um kit de purificação de PCR (Qiagen, Valencia, CA):
microarrays experimentos sobre produtos Chip:. Experimentos ChIP-on-chip ensaio
chip-on-chip foi realizada num microarray oligonucleotídeo Agilent 244k × 2 como as instruções do fabricante (Agilent Mammalian chIP-on-chip v.10 Protocol). Resumidamente, o controlo de entrada para extractos de células inteiras e os produtos dos pedaços purificados foram amplificados por PCR mediada por ligação utilizando um ligante oligonucleotídico artificial, depois de embotamento a extremidades de ADN, utilizando polimerase de ADN de T4. Em seguida, os produtos de entrada e chip amplificados foram marcadas com fluorescente BioPrime total Genomic Labeling System (Invitrogen). A mesma quantidade de ADN de entrada e de produto chip com diferentes corantes fluorescentes foram misturados com Cot-1 DNA humano (1 mg /mL), e hibridizadas para um Agilent 488k promotor matriz (dois 244k matrizes), contendo ~ 17000 dos transcritos humanos definidos cobrindo desde -5.5 kb para +2,5 kb do local de início da transcrição (SST). imagens hibridizadas foram visualizadas com o scanner microarray (revolução de 4200;. Vidar Sistemas de Cor, Herndon, VA):
Análise de Dados e Ontologia análise
Histon acetilação de produtos chip e entrada foram analisados utilizando o. módulo de chip do DNA Analytics (Agilent, versão 4.0.81) com Tukey biweight normalização, modelo de erro Whitehead, e Whitehead modelo Bairro Per-matriz. Resumidamente, razão log2 para cada gene de produtos chip e entrada foi calculado com a média de sondas em 1,000bp, considerando genes com um valor P de menor que 0,1 como valioso. A fim de descrever estado H4K16ac do sítio de iniciação de transcrição (SAT), a distância para cada sonda foi simplificada, como se segue: a região entre-1000 ~ -500 do TSS foi contado como-2, -500 ~ SST como 1-, e TSS ~ + 500 como um, como a posição TSS definido a partir de-11-10.
anotações funcionais através de RT-PCR e western blot foram seguidos pela análise utilizando o DAVID (banco de dados para anotação, Visualization e Discovery Integrado) de recursos de bioinformática e Gene Ontologies (Função Molecular, Processo Biológico, Cell Components) para vias de sinalização. Foram excluídas todas as categorias que representam menos de 4% do número total de genes aplicadas.
Resultados
CG200745 inibe a proliferação de células NSCLC
Para determinar os efeitos inibitórios da CG200745 sobre a proliferação celular, medimos a IC
50 de CG200745 uma das seguintes linhas de células de câncer de pulmão: Calu6, H358, H596, A549, HOP62, HOP92, H226, H460 e H522, bem como células Beas2B. IC
50 valores de CG200745 nas células do cancro do pulmão testadas foram em níveis micromolares, e foram comparáveis aos obtidos a partir do medicamento de referência, a SAHA (Tabela 1), indicando um efeito de supressão do crescimento significativo de CG200745 em várias linhas celulares de NSCLC. Entre eles, A549, Calu6, HOP92, e H522 células foram os mais sensíveis com IC
50 de 3? M. O efeito de CG200745 sobre a proliferação celular Calu6 foi confirmada como sendo o número de células e morfologia em microscopia óptica após exposição a 3 uM CG200745 em diferentes períodos de tempo (Fig. 1). células Calu6 mostrou regular da pilha crescente padrões de um modo dependente do tempo até 8 horas após o tratamento com fármaco. No entanto, após 8 horas de tratamento CG200745, a taxa de crescimento de células Calu6 foi reduzida, e a morte de células com alterações morfológicas foi observado. O efeito adverso da CG200745 no crescimento celular Calu6 foi analisada através da realização de um ensaio MTT com várias condições, confirmando que a droga reduziu a proliferação de células para 40% das células não tratadas
células
Calu6 (Fig. 1A). cultivadas em placas de 6 poços foram tratadas com 3 uM CG200745 para os períodos de tempo indicados para analisar o efeito anti-proliferação de CG200745, e foram observadas sob microscópio. (B) O crescimento de células Calu6 em placas de 96 poços foi analisada por meio de ensaio de MTS após tratamento com várias concentrações de CG200745 (0 a 10 uM) em tempo-curso (0 a 48 horas). A significância estatística das mudanças na viabilidade celular foi calculado pelo teste t (*** indica p 0,001)
tratamento CG200745 induz /M paragem do ciclo celular G2 e apoptose em células Calu6
HDACi compostos são conhecidos para induzir a paragem do ciclo celular, um importante mecanismo de alvo do cancro, em várias células de cancro. Para examinar se CG200745 induziu a paragem do ciclo celular na linha Calu6, estas células foram tratadas com esta molécula HDACi para vários pontos de tempo de 0 a 24 horas, seguido por análise de citometria de fluxo (FACS). Como mostrado na Fig. 2A, um aumento na população de G2 /M foi observada de um modo dependente do tempo. células Calu6-tratados CG200745 mostrou um aumento significativo da percentagem de células na fase G2 /M (de 69%) em comparação com células de controlo não tratados (26%) (Fig. 2B e 2C). Estes resultados indicam que CG200745 provoca a inibição do crescimento celular através de G2 /M do ciclo celular fase parada.
Células
Calu6 tratados com 3 uM de CG200745 foram analisados ciclos celulares no citómetro de fluxo. Cada histograma consiste em dois picos de preto e uma região riscado indicando G0 /G1 fase, fase G2 /M, e a fase S, respectivamente. O efeito de CG200745 sobre a distribuição do ciclo celular foi analisada em vários pontos de tempo (A), ou em comparação com células não tratadas (B) que descreve como uma visualização gráfica (C).
CG200745 provoca aumento da histona acetilação
Para examinar os efeitos inibidores de HDAC de CG200745 sobre células de cancro do pulmão de células não-pequenas, que trataram células Calu6 com diferentes concentrações de CG200745 e analisados acetilação das histonas por transferência western, bem como a actividade de HDAC HAT e em várias Os pontos de tempo. Como mostrado na Fig. 3A, a baixa concentração de tratamento CG200745 aumentou significativamente a acetilação das histonas H3 e H4 em vários locais, incluindo K9 em H3, e K16, assim como S1 /K5 /K8 /K12 em H4, de uma forma dependente do tempo até 24 horas depois tratamento na análise de transferência de western. Para confirmar os efeitos inibidores de histona CG200745 de desacetilação, medimos a actividade de HDAC HAT e em extractos nucleares de células Calu6 antes e após o tratamento CG200745. Em contraste com a actividade CHAPÉU inalterados após tratamento CG200745 (Fig. 3B), a actividade de HDAC em células Calu6-tratados CG200745 foi significativamente menor do que nas células de controlo não tratadas (Fig. 3C), indicando que CG200745 aumento do nível de acetilação da histona, devido à inibição da actividade de HDAC.
(A) de estado de acetilação de histonas foram analisados em Western blot de células Calu6 tratados com várias concentrações de CG200745 (0 a 10