Abstract

infusões celulares imunoterapia com base em células natural killer (NK) é um adjuvante potencial tratamento para muitos tipos de cancro. Tal aplicação terapêutica em seres humanos requer um grande número de células NK funcionais que foram seleccionados e expandidos, utilizando protocolos de qualidade clínica. Nós estabelecemos um sistema de cultura à base de citocina extremamente eficiente para

ex vivo

expansão das células NK do tronco e progenitoras células hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical (SCU). refinamento sistemático desse sistema de duas etapas usando um meio de grau clínico romance resultou em um protocolo de cultura de células terapeuticamente aplicável. CD56

+ CD3

– produtos de células NK pode ser rotineiramente gerado a partir de recém-CD34 seleccionado

+ células de SCU com uma expansão média de 15000 vezes e com uma pureza quase 100%. Além disso, o nosso protocolo tem a capacidade de produzir mais de 3-log expansão das células NK de CD34 congelado

células + UCB. Estes

ex vivo

produtos de células -generated conter subpopulações de células NK diferencialmente expressam receptores do tipo imunoglobulina NKG2A e assassinas. Além disso, UCB-CD56 derivados

+ NK células geradas pelo nosso protocolo uniformemente expressam níveis elevados de receptores de activação e NKG2D citotoxicidade natural. Análise funcional mostrou que estes

ex vivo

-generated células NK alvo de forma eficiente linhas celulares de leucemia e de tumores de melanoma mielóides, e mediar a citólise de células de leucemia primárias em proporções baixas NK-alvo. Nosso sistema de cultura exemplifica um grande avanço na produção de produtos de células NK puras de um número limitado de

células CD34 + para imunoterapia de câncer

Citation:. Spanholtz J, Tordoir M, Eissens D, Preijers F, van der Meer Um, Joosten I, et al. (2010) Expansão alta Log-Scale of funcionais células humanas assassinas naturais a partir de células CD34 positivas Cord sangue de cordão umbilical para adoptivo Cancer Imunoterapia. PLoS ONE 5 (2): e9221. doi: 10.1371 /journal.pone.0009221

editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxemburgo

Recebido: 16 de outubro de 2009; Aceito: 21 de janeiro de 2010; Publicação: 15 de fevereiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Spanholtz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Universidade Radboud Nijmegen Medical Centre e Glycostem Therapeutics. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. O trabalho relaciona-se com GBGM® meio para geração ex-vivo de células NK, que é um meio de cultura de células comercialmente disponível anteriormente desenvolvido por Glycostem Therapeutics. Compra e /ou uso de meio GBGM® não está restrito por direitos de patente. Glycostem Therapeutics agiu como patrocinador na parte desta pesquisa. Autores Spanholtz e Tordoir são funcionários da Glycostem, cientificamente dirigido por Dolstra. Compensação para o envolvimento de Dolstra neste projecto é pago pelo Glycostem ao orçamento global de pesquisa de RUNMC. RUNMC e Glycostem cooperar com base em um acordo de colaboração de pesquisa que regula os interesses acima. Nem Dolstra nem RUNMC têm um interesse financeiro em Glycostem. Todos os autores confirmam que isso não altera a sua adesão a todos os PLoS ONE políticas sobre dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores. Os autores concordam em disponibilizar gratuitamente todos os materiais e informações associadas à sua publicação que sejam razoavelmente solicitados por outras pessoas para fins de investigação académica e não-comercial.

Introdução

Natural Killer (NK) células são CD56

+ CD3

– linfócitos granulares grandes que exercem a imunidade inata contra infecções virais e cancro [1]. células NK reconhecem e reagem subsequentemente com células transformadas e infectadas com vírus, sem imunização prévia, basicamente, através do equilíbrio dos sinais a partir de receptores inibidores e activadores [2]. Portanto, as células NK foram previamente descritos como efectores promissores para imunoterapia adoptiva contra o cancro [3]. O potencial anti-tumoral das células NK foi demonstrado melhor durante o tratamento de pacientes com leucemia com transplante de células-tronco hematopoiéticas (SCT). Ruggeri et ai. demonstraram que alloreactivity células NK pode controlar recaída de leucemia mielóide aguda (LMA), sem causar doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) na definição de HLA desemparelhado haploidentical SCT alogénica [4]. Além disso, haploidênticos infusões de células NK em associação com IL-2 em um ambiente não-transplante têm sido associados com remissão hematológica completa em pacientes com mau prognóstico-LMA [5]. Estes resultados encorajadores salientar que a imunoterapia com base em células NK alogénica pode ser uma estratégia terapêutica promissora para a AML em ambos os não-transplante e configuração de pós-transplante [5], [6].

Até à data, a maioria clínica estudos que exploram as células NK alogénicas para imunoterapia adoptiva foram realizados com células NK seleccionados a partir de produtos de leucoferese de esferas imunomagnéticas protocolos de selecção [7] – [12]. A fim de contornar as limitações no número de células, a pureza e o estado de activação de tais células NK derivadas de sangue,

ex vivo

expansão de células NK com uma pureza mais elevada irá facilitar a infusão de um maior número de células NK activadas in doentes com uma relativamente grande carga tumoral ou permite múltiplas infusões de células NK [8], [13], [14]. Portanto, o desenvolvimento de estratégias inovadoras que permitam a geração de produtos clinicamente relevantes de células NK com números de alta celulares, de alta pureza e funcionalidade promete um grande avanço em imunoterapia baseada em células NK.

Neste estudo, desenvolvemos uma citocina método baseado em expansão em grande escala de CD56 funcional

+ NK células a partir de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas. Estudos semelhantes foram realizados previamente concentrando-se em ambos os CD34

+ células progenitoras hematopoiéticas (HPC) a partir de medula óssea (MO) ou sangue do cordão umbilical (UCB) [15] – [17]. No entanto, a maioria destes sistemas de cultura são inadequados para aplicação clínica por causa da utilização de soros de animais, proteínas derivadas de animais e linhas de células de suporte do alimentador. Além disso, a maioria destes métodos produziram o número de células NK única limitado para imunoterapia adoptiva bem sucedida em doentes com cancro. A fim de superar essas deficiências, foi estabelecido um esquema de cultura de duas etapas em que foi utilizado um meio de grau clínico romance para gerar mais de 3 a 4-Log fold-expandida CD56 funcional

+ NK células de CD34 recém-selecionada ou criopreservados

+ células UCB, respectivamente. O CD56

produtos de células NK + gerados por este método tem um grau de pureza muito elevado, contêm vários receptor NKG2A e assassino semelhante a imunoglobulina (KIR) expressando subconjuntos maduros e AML eficiente lise e as células de tumores sólidos. Estes achados exemplificam que este sistema de cultura poderia realizar uma grande promessa para o

ex vivo

geração de grau clínico produtos de células NK para imunoterapia celular contra o câncer.

Resultados

ex vivo

Progenitor celular expansão e NK Diferenciação celular

o objetivo deste estudo foi desenvolver um

ex vivo

sistema de cultura à base de citocina eficiente para a expansão do CD34

+ células seguido pela geração seguinte escala log de CD56

+ CD3

– células NK. Para identificar um meio adequado para a expansão aplicável clínica e diferenciação de células NK, testou-se diferentes meios basais utilizando um de dois passos

In vitro

esquema de diferenciação (Figura 1). Inicialmente, foram comparados os H3000 mídia, Stemline I e II Stemline semeadura 1 × 10

4 CD34

+ células usando o método I. Detectamos um forte aumento da CD34

+ número de células em todos os três meios de comunicação, resultando em uma taxa de expansão média para todas as experiências (n = 15) de 48 ± 7 e 78 ± dobra 27 vezes após 1 e 2 semanas de cultura, respectivamente. A expansão celular total foi associada com uma diminuição gradual da frequência de CD34

+ células a partir de 84% ± 16% no dia 0 até 47% ± 14% na Semana 1 e 17% ± 9% na semana 2 (Figura S1a e S1b).

no Método I-III de diferentes combinações de citoquinas foram testados como descrito em detalhe em Materiais e Métodos começando com números diferentes de

células inicialmente semeadas CD34 +. No método I e II, as células NK foram geradas a partir de dadores de SCU recém-seleccionados e a duração da cultura foi de 5 semanas. No Método III, CD34

+ células foram usadas a partir de doadores de SCU criopreservados e o período de cultura foi de 6 semanas. Finalmente, o diagrama mostra que os produtos NK foram usados ​​e apresentados como resultados em figuras e material suplementar.

Em seguida, investigou-se a CD34 expandiu UCB-derivado

+ células foram capazes de se diferenciar em CD56

+ NK células. O passo de diferenciação foi monitorizada por análise das moléculas de superfície celular CD34, CD117, CD56, CD94 e CD161, que foram descritas para ser expresso em diferentes estágios de desenvolvimento de células NK humana

In vivo

[18]. Observou-se depois de 3 semanas de duração total da cultura que a percentagem de células CD34

+ células diminuiu ainda mais, enquanto o CD56

+ CD161

+ CD94

+ população de células NK aumentou para 10-18% (por exemplo, Figura 2a). Depois disso, a população de CD56

+ CD161

+ CD94

+ células aumentou rapidamente para 60-77% após 4 semanas e 80-96% após 5 semanas de cultura (por exemplo, Figura 2A).

células de SCU enriquecido com CD34 foram expandidas durante duas semanas utilizando três meios diferentes (H3000, Stemline I e Stemline II) e, subsequentemente, se diferenciam em células NK durante três semanas adicionais no mesmo meio basal utilizando o Método I (ver Figura 1). As culturas celulares foram analisadas semanalmente para números de celulares e fenótipo usando FCM. (A) Exemplo representativo de expressão do antigénio durante o período de cultura em duas fases, utilizando meio H3000. Uma semana após o início da diferenciação celular passo NK 2 (isto é, após 3 semanas de duração total de cultura) a CD56

+ CD161

+ CD94

+ NK população de células aumenta e atinge alta pureza após 3 semanas de diferenciação (isto é, a semana 5). (B) A média CD56

+ frequência de células durante o período de cultura de 5 por semana durante três meios diferentes, que foram testadas em experiências paralelas utilizando 3-6 doadores de SCU. (C) A média total de CD56

+ NK número de células após a semeadura inicial de 1 × 10

4 CD34

+ UCB células durante 5 semanas de cultura usando o método I. Os dados representam um cálculo teórico baseado na expansão real taxas de CD56 As células Sup

+. O rendimento total de CD56

+ células em cada semana foi calculado multiplicando a taxa de expansão por semana com o número de células em cultura. (D) A média de dobrar expansão de células totais após a semeadura inicial de 1 × 10

4 CD34

+ células UCB durante 5 semanas de cultura usando o método I. Os dados representam um cálculo teórico com base nas taxas de expansão real de células totais .

Embora nós não poderíamos detectar diferenças significativas entre os diferentes meios basais, a pureza do CD56

+ medicamento celular apareceu um pouco maior com o meio H3000 (77% ± 24%; n = 3 ) e Stemline eu média (75% ± 21%; n = 6), em comparação com meio Stemline II (66% ± 17%; n = 6) (Figura 2b). Além disso, a tendência foi observada para uma maior CD56

+ número de células com Stemline I médio (faixa 4 × 10

6-1,1 × 10

8 CD56

+ células; n = 6), seguido por H3000 (5,2 × 10

6-5.4 × 10

7 CD56

+ células; n = 3) e médio Stemline II (intervalo de 1 × 10

6-2 × 10

7 CD56

+ células; n = 6) (Figura 2c). A expansão total de células significativo após 5 semanas de cultura com meio Stemline I foi ~4,400 vezes com meio e H3000 ~3,200 vezes, mas apenas expansão ~850 vezes com Stemline II (Figura 2d). Estes resultados indicam que as condições de cultura suportar um crescimento eficaz de CD56

+ NK células com um elevado grau de pureza do produto final, de células NK após um período de cultura de 5 semanas, utilizando vários meios basais.

expansão Superior de extremamente pura Células NK produtos foi realizada utilizando uma Novel Clínica Grau Médio

Embora altas taxas de expansão e purezas podem ser obtidas com a corrente media basal comercialmente disponível, que não estavam satisfeitos com a pureza do CD56

+ NK produto de células após 5 semanas de cultura utilizando o Método I (Figura 1). Para aumentar ainda mais a eficiência de nosso método de cultura, testámos um meio isento de soro recentemente formulado, designado Glycostem basal Meio de Crescimento (GBGM®), que é produzido sob condições GMP, e adequado para aplicações clínicas. Além disso, foi ajustado ligeiramente as condições de citocinas durante a etapa de expansão, uma vez que observou-se que a expansão de CD34

+ células, bem como células totais foi mais proeminente durante a primeira semana de cultura (Figura S1a e S1C). Além disso, para aumentar o equilíbrio para a expansão de células progenitoras de células NK que foram adicionadas a IL-15 em vez de TPO ao meio de expansão a partir do dia 9 da cultura, e deixados de fora Flt3L no meio de diferenciação (Figura 1). Usando este método modificado II, em cultura GBGM® resultou na expansão celular total mais elevado durante a primeira semana e subsequente diferenciação em CD56

+ células NK (Figura 3 e Figura S1E). A taxa de expansão total de células no GBGM® aumentada para 15000 vezes (gama de 16,991-73,666; n = 3) (Figura 3a). Mais importante ainda,

ex vivo

geração de CD56

+ células NK em GBGM® proporcionou um maior grau de pureza significativa de 99% ± 1% (n = 3) em comparação com H3000 com 88% ± 3% (n = 3; P 0,05) e Stemline I com 63% ± 24% (n = 3; P 0,05), respectivamente (Figura 3b). Estes dados demonstram que o sistema de cultura modificada do invento que utiliza os resultados médios GBGM® recém formulados em expansão mais de 4 log de células NK humana pura a partir de recém-CD34 seleccionado

+ células UCB.

O novo GBGM® meio foi comparado com dois meios previamente testados no sistema de geração de células NK de acordo com o Método II (ver Figura 1). As culturas celulares foram analisadas semanalmente para números de celulares e fenótipo usando FCM. (A) Dobre expansão de células totais após a semeadura inicial de 1 × 10

4 CD34

+ células UCB foi determinada durante 5 semanas de cultura. Os dados representam o cálculo com base nas taxas de expansão real de células totais e são apresentados como média ± DP de três experiências diferentes. (B) CD56 frequência

+ célula durante a fase de diferenciação para três meios diferentes, que foram testadas em experiências paralelas utilizando três dadores de SCU. Os dados são representados como média ± DP. * Representa um valor de p 0,05

fenotípica Perfil de CD56

+ NK células derivadas de CD34

Células expandidas +

Fluxo de análise de citometria revelou que. as células

ex vivo

-generated NK após 5 semanas de cultura continha uma população de células homogéneas exibindo uma expressão elevada de CD56, na ausência de CD3 (Figura 4a). A elevada freqüência desse CD56

+ CD3

– população de células NK exibido expressão de CD94, enquanto apenas um subconjunto limitado foi positivo para CD16. Além disso, produtos de células NK exibido expressão homogênea e relativamente alta de NKG2D e os receptores de citotoxicidade naturais (NCR) NKp30, NKp44 e NKp46, enquanto NKG2A foi mais diferencialmente expressos (Figura 4b e figura S2a). Adicionalmente a estas conclusões foram detectados alta expressão de receptores de células 2B4 (CD244) e NKR-P1 (CD161) como típicos NK, enquanto NKG2C e NKp80 estavam ausentes ou expresso em níveis relativamente baixos. Além disso, observou-se forte expressão de MHC de classe I (HLA-ABC) e cadeias de receptor de citoquina para a IL-2 e IL-15 (CD122; IL-2 /IL-15Rβ) e SCF (CD117; c-kit-R) , que são importantes para a diferenciação de células NK, a expansão e a activação.

(a) análise de citometria de fluxo de um produto das células NK representativa produzida a partir de células CD34

células progenitoras + SCU. As células com 5 semanas de cultura foram analisados ​​quanto à expressão de CD56, CD3, CD94 e CD16. (B) Expressão de um repertório de receptores importantes para a regulação da actividade das células NK, incluindo receptores de lectina do tipo C, receptores de citotoxicidade naturais e receptores de citoquinas. Os histogramas mostram a expressão do antigénio de interesse (histograma preto) em comparação com o controlo de isotipo específico (histograma cinzento). (C) Aquisição de KIR

+ NK subpopulações de células durante

ex vivo

geração de células NK a partir expandiu CD34

+ células UCB. expressão KIR foi determinada na semana 4 e 5 durante a etapa de diferenciação por FCM. análise

KIR repertório mostrou diferenças individuais significativas na frequência de KIR-expressando subpopulações de células NK entre vários doadores UCB. KIR

+ NK subpopulações de células já poderia ser detectado na semana 4 da cultura e manteve-se relativamente estável até o final do período de cultura na semana 5 (Figura 4c e Figura S2B). Enquanto alguns CD56

+ NK produtos de células continha células positivas para todos os quatro fenótipos KIR analisados ​​(Figura 4C), outros especificamente faltava a KIR2DL1 /DS1

+ subconjunto (Figura S2B). Geralmente, o KIR2DL2 /DL3 /DS2

+ subconjunto estava presente em uma proporção mais elevada de todos os produtos de células NK analisados ​​até agora, que está de acordo com observações anteriores de que a recuperação de KIR2DL2 /DL3 /DS2

+ células NK é mais rápido em comparação com o KIR2DL1 /DS1

+ subconjunto pós-transplante [19].

Tomados em conjunto, estes resultados ilustram que as células NK derivadas de UCB gerados com o nosso sistema de cultura optimizado contêm populações de células NK que expressam desenvolvente maduros NKG2A , KIR e vários receptores de activação.

Ex vivo

-Generated CD56

+ KIR

+ e CD56

+ NKG2A

+ NK As células são funcionalmente Regulado por MHC Classe I Expressão

a análise fenotípica mostrou que nosso

ex vivo

-generated produtos de células NK continha até 10% CD56

+ KIR

+ células e uma alta proporção (40 -60%) CD56

+ NKG2A

+ células. Para determinar a actividade citolítica destes subconjuntos e investigar se esta actividade é regulada pelos receptores inibitórios expressas, foram realizados ensaios de desgranulação baseados em CD107a utilizando células K562 HLA-negativas e células KG1a expressam níveis relativamente elevados de HLA-ABC e -E (ver Tabela 1). Para estas experiências, nós utilizamos dois

ex vivo

-generated produtos de células NK que continham cerca de 15-30% CD56

+ CD107a

+ células mediante co-cultura com K562 (Figura 5 e Figura S3 ). Em contraste, as células estimuladas KG1a dificilmente desgranulação destes produtos de células NK, indicando que a actividade citolítica é inibida pela expressão de HLA. Da mesma forma, cerca de 35% do CD56

+ KIR2DL2 /DL3

+ subconjunto degranulados sobre desencadeando por K562, enquanto que apenas uma pequena percentagem ( 5%) expressa CD107a seguinte co-cultura com KG1a (Figura 5a e Figura S3). Em concordância com estes resultados, a desgranulação de CD56

+ KIR2DL2 /DL3

+ subconjunto pode ser especificamente inibida por células K562 transfectadas com o grupo de HLA-C 1 alelo HLA-CW3, enquanto que a transfecção do grupo HLA-C 2 alelo HLA-Cw4 alelo não teve efeito (Figura S4). Finalmente, observou-se que também o dominante CD56

+ NKG2A

+ subconjunto foi capaz de desgranulam eficiente em resposta a K562 (28% CD107a

+ células), enquanto desgranulação em direção KG1a foi baixa, provavelmente devido à relativa alta expressão de moléculas de HLA-e (Figura 5b e Tabela 1). Estes dados demonstram que o KIR

+ e NKG2A

+ subconjuntos dentro dos produtos de células NK UCB-derivados são totalmente sensível atividade degranulação forte mediação, que é regulado pela expressão de moléculas MHC classe I nas células-alvo envolvidos.

Ex vivo

-generated células NK utilizando o Método II com GBGM foram incubadas sozinho, ou 18 horas com MHC classe I-negativo K562 ou classe MHC I-expressando células KG1a em um E:T proporção de 01:01. As células foram então coradas para CD56, CD3, KIR ou NKG2A, e o CD107a antigénio desgranulação. (A) Degranulação do total CD56

+ CD3

– células NK e KIR2DL2 /DL3

subconjunto de células NK + expandidas durante 5 semanas de CD34

células + UCB. parcelas densidade são delimitação de CD56

+ CD3

– células NK e as parcelas do histograma mostram a desgranulação CD107a do KIR2DL2 /DL3

+ NK células. (B) Degranulação do total CD56

+ CD3

– células NK e NKG2A

+ subconjunto de células NK expandiu durante 6 semanas a partir CD34

células + UCB. parcelas densidade são delimitação de CD56

+ CD3

-. células NK e as parcelas do histograma mostram a desgranulação CD107a do NKG2A

+ NK células

ex Cells vivo

-Generated NK eficiente alvo leucemia e células tumorais sólidos

Para determinar o potencial citotóxico do

ex vivo

-generated produtos de células NK, foi realizada a citotoxicidade fluxo baseado em citometria ensaios utilizando várias linhas celulares de leucemia mielóide (K562, Lama, Kasumi e KG1a), células de LMA primárias e duas linhas de células de melanoma (BLM e FM3).

ex vivo

-generated células NK em GBGM® lise mediada eficiente de células K562 (~ 40% e ~ 90% após 4 e 24 horas, respectivamente) a uma proporção muito baixa E:T de 02:01 ( Figura 6a). Além disso, a lise profunda pode ser observada contra MHC de classe I expressando células KG1a (~ 20% e ~ 40% após 4 e 24 horas, respectivamente). Interessantemente, as células NK cultivadas em GBGM® apresentaram maior actividade citotóxica e desgranulação em comparação com células NK H3000 cultivadas em meio a partir do mesmo doador UCB (Figura S5a-C). Além disso, descobrimos que as células NK GBGM derivados apresentaram maior expressão dos receptores de activação NKG2D, NKp30, NKp44 e NKp46 (Figura S5D).

(a) citotoxicidade específica de um CD56

+ produto de células NK (98% de pureza) contra as linhas de células K562 de leucemia mielóide e KG1a. A lise específica foi determinada após 4 e 24 horas de co-cultura num ensaio de citotoxicidade baseado em FCM em uma proporção de 02:01 E:T. Os dados são apresentados como média ± DP de poços em triplicado. (B) A desgranulação de CD56

+ células NK foi determinada por FCM como a percentagem de CD107a

+ células. Os resultados estão representados como a média ± DP de poços em triplicado. (C) a produção de IFN-y foi determinada por ELISA e representados como a média ± SD de medições em triplicado. (D) a citotoxicidade específica de outro CD56

+ produto das células NK (95% de pureza) contra as linhas de células K562 de leucemia mielóide, lama, Kasumi e KG1a, e as linhas celulares de melanoma FM3 BLM e. A lise específica foi determinada após 18 horas de co-cultura num ensaio de citotoxicidade baseado em FCM em uma proporção de 01:01 E:T. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de amostras em triplicado. (E) A desgranulação de CD56

+ células NK foi determinada por FCM como a percentagem de CD107a

+ células após estimulação durante a noite com diferentes objectivos. Os dados estão representados como a média ± desvio padrão de amostras em triplicado. produção (F) de IFN-y foi determinada por ELISA e representados como a média ± SD de medições em triplicado. (G) citotoxicidade específica de um terceiro CD56

produto de células NK + (97% de pureza) contra células AML primárias a partir de 5 diferentes pacientes. A lise específica foi determinada após 24, 48 e 72 horas de co-cultura num ensaio de citotoxicidade baseado em FCM em uma proporção de 03:01 E:T. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de amostras em triplicado.

Além de lise eficaz das células K562, também as linhas celulares de leucemia e Lama Kasumi, bem como as células de melanoma FM3 BLM e foram eficientemente lisadas pela As células NK (Figura 6D). Curiosamente, uma monocamada de células de melanoma FM3 foi completamente destruído dentro de uma hora de co-cultura com células NK (Filme S1). Alta NK celular mediada por actividade citolítica contra linhas celulares de leucemia e melanoma foi associado com uma elevada percentagem de CD107a

+ NK células (Figura 6B e 6e) e produção significativa de IFN-y (Figura 6C e 6f).

Finalmente, nós investigamos se células de leucemia primários são susceptíveis à morte pelas

ex vivo

-generated células NK. Portanto, realizamos ensaios de citotoxicidade com células de LMA de cinco pacientes diferentes. células AML primárias de três pacientes (Pt 2, 4 e 5) foram substancialmente mortas no prazo de 3 dias de co-cultura, a uma baixa proporção de 3:01 E:T embora menos potente do que as células K562 (Figura 6g). Estes resultados indicam que as células NK UCB-derivados gerados pelo nosso método de cultura eficiente tem a capacidade de matar leucemia mielóide e células de tumores sólidos.

Ex vivo

Geração de Células NK Produtos de Congelados CD34

+ células UCB

para investigar se o nosso protocolo de expansão de células NK poderia ser adaptada para um procedimento clinicamente aplicável, realizamos experimentos utilizando meio GBGM® em que deixou de fora LIF e MIP-1α na baixa mistura de citocinas da dose porque estas citocinas não são de qualidade clínica disponível. Além disso, foi realizada a estas experiências utilizando CD34

+ células seleccionados a partir de UCB descongelado de acordo com o Método III representada na Figura 1. O descongelamento e CD34 selecção

+ de células resultou na obtenção de 1,30 ± 0,61 x 10

6 (gama 0,84 -2,50 × 10

6) CD34

+ células de SCU de seis doadores (Tabela 2).

Ex vivo

geração utilizando o Método III resultou em um rendimento calculado de células NK de 4,6 ± 2,4 × 10

9 (intervalo 1,9-7,8 × 10

9) células NK com uma pureza 95 % após 6 semanas de cultura (Tabela 2). A taxa de expansão variou entre 1.500 e 6.500 vezes começando com CD34

+ células de UCB criopreservados. Estes dados demonstram que a transferência do nosso procedimento descrito para as condições clínicas aplicáveis ​​é viável, e gera produtos de células NK puras com mais de 3-log potencial de expansão.

Discussão

Aqui Descrevemos um método altamente potente cultura em duas fases novo e para o

ex vivo

geração de células NK funcionais para aplicação clínica no tratamento de pacientes com AML e outras doenças malignas. Nós implementamos um novo meio basal grau clínico, designado GBGM®, o que facilita eficientes

ex vivo

HPC e de células NK expansões. O nosso método permite a geração de células NK humanas funcionais mais do que 4-logs de CD34

+ células enriquecidas a partir de unidades de SCU recolhidas recentemente e mais de 3-log da UCB congelado. Para o melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira demonstração de que a CD56 humana

+ NK células podem ser gerados de forma eficiente

ex vivo

em tal magnitude alta escala log.

Estudos semelhantes têm foram relatados anteriormente utilizando diferentes combinações de citoquinas com ou sem linhas de alimentação e utilização de células de animais e soros humanos [15] – [17], [20] – [24]. Por exemplo, um estudo recente da Kao et al. mostraram que CD34

células isentas de soro + expandidas podem ser diferenciadas em um produto das células NK, com uma pureza média de 40% -60% após 5-7 semanas de cultura. Chegaram a uma taxa de expansão média calculada de 300 vezes, mas utilizado soro fetal bovino durante a fase de geração das células NK [16]. Em comparação com estes dados publicados recentemente, o nosso novo sistema de cultura é uma grande promessa, resultando em mais de 3-log-escala

ex vivo

geração de produtos de células NK, com quase 100% de pureza, utilizando meio grau clínico, soro humano, e citocinas. As únicas citocinas que estão atualmente ou no futuro próximo não disponível como reagentes de grau clínicos são LIF e MIP-1α, que fazem parte da baixa dose de apoio cocktail de citocinas. No entanto, experiências utilizando CD34

+ células seleccionados a partir de UCB criopreservadas revelou que estes dois factores pode ser descartado sem a perda do potencial de diferenciação das células NK do nosso protocolo refinado (Tabela 2). Tomando o potencial de expansão elevada, o nosso sistema permite a geração de um número médio de 4,6 x 10

9 células NK altamente pura a partir de congelado CD34

+ de SCU células (Tabela 2). Além disso, experimentos upscaling preliminares em sacos de cultura celular revelou que o procedimento de cultura estabelecida gera até 2 × 10

9 NK células com o mesmo fenótipo e função, como mostrado para as populações de células NK gerados em placas de cultura de tecidos (dados não apresentados) . Estes resultados indicam que o nosso refinado

ex vivo

protocolo de expansão tem o potencial para produzir mais células NK (IE 2 × 10

9 com uma pureza entre 95-99%) em comparação com a purificação do madura as células NK de um procedimento lymphapheresis 15 litros, que produz 0,25 × 10

9 ± 0,14 x 10

9 (intervalo 0,01-0,47 × 10

9) células NK de acordo com os dados publicados de McKenna et al. em 2007 [7] – [12]

O produto de células NK gerada por nosso método exibido reproducibly um fenótipo ativado com uma elevada expressão de CD56 e vários receptores de activação, tais como NKG2D, NKp30, NKp44 e NKp46.. Em conformidade com as observações anteriores, a

ex vivo

-generated células NK cultivadas na presença de IL-2 e IL-15 mostraram um CD56

fenótipo brilhante de que apenas um subconjunto CD16 expressa [20], [21], [25], [26]. Os produtos de células NK resultantes continham 40-60%

+ NKG2A

+ NK células CD56 e até 10% do CD56

+ população expressa vários KIR, embora houvesse variação considerável na frequência de KIR

+ NK subpopulações de células entre os diferentes doadores UCB. De acordo com o modelo de diferenciação de células NK de Freud e Caligiuri, a

ex vivo

-generated produtos de células NK predominantemente contêm células NK desenvolvente maduros que expressam CD94 alta /NKG2A, CD117 e /ou medeiam a actividade citolítica KIR potente contra células K562 [27]. Uma minoria do CD56

+ NK células em nossos produtos são fenotipicamente imatura falta NKG2A e KIR. No entanto, estas células NK imaturas podem ter o potencial para maturam

In vivo

após a transferência adoptiva. Curiosamente, Cooley et ai. mostraram que CD56

+ NKG2A

-KIR

– as células NK são capazes de amadurecer

in vitro

sobre a cultura com IL-15 e uma linha de células de alimentação do estroma [28]. análise fenotípica revelaram que as células NK gerados com a nossa expressão de receptores de citocinas, incluindo IL-2 /IL-15Rβ (CD122) visor protocolo UCB-derivada, que pode promover a

in vivo

sobrevivência, expansão e maturação aquando da transferência seguinte terapia imunossupressora.

a actividade citotóxica forte das nossas células NK derivadas de UCB contra várias linhas de células de tumor, bem como a citólise de células AML primários foram exibidos por lise específica, a desgranulação CD107a-mediada e a produção de IFN-y. A maioria dos ensaios foram realizados com linhas celulares e células AML LMA primária, que foi demonstrado ser um alvo atractivo para imunoterapia mediada por células NK [5], [6]. Curiosamente, também se observou lise eficiente de linhas de células de melanoma, o que reforça o potencial terapêutico deste produto células NK, também no sentido de cancros não-hematológicos. Mais recentemente, vários estudos demonstraram, que a citotoxicidade mediada por células NK e a utilização da imunoterapia baseada em células NK poderia ser uma abordagem eficaz para o tratamento de melanoma, que também foi demonstrada num ensaio de fase I utilizando a linha celular de NK-92 [ ,,,0],29] – [31]

em conclusão, o método aqui apresentado fornece um avanço importante para a geração de produtos clinicamente relevantes de células NK a partir de células estaminais hematopoiéticas e progenitoras com números celulares elevadas, elevada pureza e funcionalidade para utilização em NK. imunoterapia com base nas células.