Abstract

Fundo

Proteomics é esperado para jogar um papel fundamental na descoberta de biomarcadores de câncer. Embora tenha se tornado viável para analisar rapidamente proteínas a partir de extractos celulares brutos usando espectrometria de massa, composição da amostra complexa dificulta este tipo de medição. Portanto, para a análise do proteoma eficaz, torna-se fundamental para enriquecer amostras para os analitos de interesse. Apesar de que um terço das proteínas em células eucarióticas são pensados ​​para ser fosforilada em algum ponto no seu ciclo de vida, apenas uma baixa percentagem de proteínas intracelulares é fosforilada num dado momento.

Metodologia /principais conclusões

neste trabalho, aplicamos técnicas de enriquecimento fosfopeptídeo cromatográficas para reduzir a complexidade de amostras clínicas humanas. Um novo método para a high-throughput perfis péptido de amostras de tumores humanos, utilizando IMAC paralela e MALDI-TOF MS, é descrito. Nós aplicamos esta metodologia para analisar amostras de pulmão normais e cancerosas humanas na busca de novos biomarcadores. Usando um algoritmo de processamento espectral altamente reprodutível para produzir perfis de massa de peptídeos com variabilidade mínima além das amostras, modelos de classificação lineares baseados em discriminantes e de decisão baseada em árvores foram gerados. Estes modelos podem distinguir normal a partir de amostras de tumores, bem como diferenciar os vários subtipos histológicos de câncer de pulmão de células não pequenas.

Conclusões /Significado

A novela, otimizado amostra método de preparação e de dados cuidadosa estratégia de aquisição é descrito para high-throughput profiling peptídeo de pequenas quantidades de amostras de pulmão e câncer de pulmão humanos normais. Mostra-se que a combinação apropriada de valores de expressão de péptido é capaz de discriminar pulmão normal a partir de amostras não-pequenas de cancro do pulmão de células e entre diferentes subtipos histológicos. Nosso estudo enfatiza o grande potencial da proteômica na caracterização molecular de câncer

Citation:. Gámez-Pozo A, Sánchez-Navarro I, Nistal M, Calvo E, Madero R, Díaz E, et al. (2009) MALDI Profiling do cancro do pulmão humano subtipos. PLoS ONE 4 (11): e7731. doi: 10.1371 /journal.pone.0007731

editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 03 de julho de 2009; Aceito: 08 de outubro de 2009; Publicação: 05 de novembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Gámez-Pozo et al. . Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Conceder um apoio : FIS CP05 /00248, FIS PI050668 e Red Tematica de Investigación en Cooperativa Câncer (RTICC, RD06-0020-1022) do Fondo de Investigación Sanitaria (Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovacion, Espanha). Subvenção financiada pelo Fundacion Mutua Madrilena. A. Gamez-Pozo é o destinatário de uma bolsa pelo Ministerio de Educación, Espanha. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Nos países ocidentais, o cancro do pulmão representa a principal causa de morte relacionada ao câncer [1]. A taxa de sobrevida global em 5 anos é de 15% e não tem melhorado ao longo de muitas décadas. Isto é principalmente porque cerca de dois terços dos cancros do pulmão são descobertos em estágios avançados. Além disso, mesmo entre pacientes em início de carreira que são tratados principalmente por cirurgia com intenção curativa, 30-55% irão desenvolver e morrer de reincidência metástase [2].

Hoje, o cancro do pulmão é classificado de acordo com critérios histológicos. Os quatro subtipos principais são: o cancro do pulmão de pequenas células (SCLC), o carcinoma de células escamosas (SC), adenocarcinoma (AC), e carcinoma de células grandes (LC). Clinicamente, os três últimos são considerados como o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), que representa cerca de 85% de todos os cancros do pulmão [3]. O diagnóstico preciso e classificação dos cancros são críticos para a selecção de terapias adequadas. O advento de terapias específicas eficazes para o cancro do pulmão, como o fator de crescimento epidérmico inibidores do receptor do erlotinib e gefitinib, ea perspectiva de desenvolvimento de terapias específicas adicionais, enfatizou a importância do diagnóstico preciso [4].

Proteomics é espera-se que desempenham um papel fundamental na descoberta de biomarcadores de cancro. Embora tornou-se viável para analisar rapidamente proteínas a partir de extractos celulares brutos usando espectrometria de massa, a complexidade da amostra destes estudos complica [5], [6]. Portanto, para a análise do proteoma eficazes é essencial para enriquecer amostras para os analitos de interesse [7]. Apesar do facto de que um terço das proteínas em células eucarióticas são pensados ​​para ser fosforilada em algum ponto no seu ciclo de vida, apenas uma baixa percentagem de proteínas intracelulares é fosforilada num dado momento [8], [9]. Assim, uma purificação ou etapa de enriquecimento que isola espécies fosforiladas iria reduzir a complexidade e aumentar a sensibilidade [10].

profiling MALDI é uma das técnicas mais promissoras para reduzir a lacuna entre proteômica de alto rendimento e clínica [7] , [11]. MALDI MS pode ser utilizada como um método de alto rendimento com sensibilidade excepcional [6], permitindo estudos comprometedoras grande série de pacientes, e tem o potencial de revolucionar o diagnóstico precoce de várias doenças [12]. Esta capacidade foi exemplificada pela criação de perfis de proteínas MALDI em amostras de tumor, o que permitiu a identificação de marcadores que podem ser correlacionados com os resultados de avaliação e paciente histológicos através de análise estatística [13], [14]. Neste trabalho, aplicamos técnicas de enriquecimento fosfopeptídeo de amostras clínicas humanas pequenas baseadas em Metal Imobilizado cromatografia de afinidade (IMAC) para reduzir a complexidade da amostra. Para detectar novos biomarcadores, definimos um fluxo de trabalho de análise de dados da aplicação de métodos de classificação lineares baseados em discriminantes e de decisão baseada em árvore para analisar perfis de peptídeos a partir de amostras pulmonares normais e cancerosas humanas por espectrometria de massa.

Métodos

Ética declaração

no momento do diagnóstico inicial, todos os pacientes tinham dado o consentimento no sentido em que as suas amostras de tumor podem ser utilizados para fins experimentais. aprovação institucional do nosso comitê de ética foi obtido para a realização do estudo (Comité Ético de Investigação Clínica, Hospital Universitário La Paz). Os dados foram analisados ​​de forma anónima. Pacientes forneceram consentimento por escrito para que suas amostras e dados clínicos poderiam ser usados ​​para fins de investigação

Amostra selecção

As amostras congeladas de pacientes com diagnóstico de câncer de pulmão:. (15 Adenocarcinoma (AC), 15 escamosas carcinoma de células (SC) e 14 de carcinoma de grandes células (LC) amostras) e 15 amostras normais de pulmão (NL) foram obtidos a partir do Departamento de Patologia do Hospital Universitário La Paz (Madrid, Espanha). O exame histopatológico de cada amostra foram analisadas por um patologista pulmonar experiente para confirmar o diagnóstico e o conteúdo do tumor. amostras elegíveis tinham de incluir, pelo menos, 50% das células tumorais.

extração de proteína total, solubilização, e digestão

As amostras foram cortadas num criostato Leica CM3050 S, obtendo 10 seções de 10 microns de espessura de cada. O tecido foi processado com o reagente TRIzol (Invitrogen, Carsbald, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Os sedimentos foram ressuspensos em cloridrato de guanidina 6 M e aquecida a 10 minutos a 95 ° C com agitação. Subsequentemente, foram adicionados 950 ul de bicarbonato de amónio 50 mM (pH 7-9) por amostra. concentração da amostra de proteína foi medida pelo kit de ensaio de proteína MicroBCA (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). Tripsina MS teor em ouro (Promega, Madison, WI, EUA) foi adicionado a cada amostra para uma relação de 01:50. A digestão foi realizada durante a noite a 37 ° C. A amostra digerida foi dividida em duas alíquotas.

paralela IMAC (PIMAC)

IMAC-Fe (III) foi realizada com base em uma aliquota de proteína digerida com PHOS-Select gel de afinidade de ferro (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, EUA) seguindo as instruções do fabricante. baseada-IMAC Ga (III) foi realizada na outra aliquota de proteína digerida com Kit de Isolamento de fosfopéptido (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) seguindo as instruções do fabricante. As amostras foram armazenadas a -20 ° C até análise posterior.

fosfopéptido análise por espectrometria de massa

misturas de péptidos foram secos sob vácuo e dissolvidos em uma solução que contém acetonitrilo (30%) e TFA (0,1% ). Após o banho-ultra-sons (3 min), os péptidos foram 01:01 misturado com ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA) ou ácido 2,5-di-hidroxibenzóico (DHB) utilizados como matrizes. Um volume de 0,5 ul foi depositado sobre a placa de MALDI e foi mantida à temperatura ambiente até seca. MALDI-MS Os espectros (duas réplicas) foram medidos num espectrómetro de massa Bruker Ultraflex TOF /TOF MALDI (Bruker Daltonics-, Billerica, MA, EUA) [15] no modo de ião positivo reflector. Para a identificação de proteínas, os iões peptídicos de interesse foram sujeitas a análise de MALDI-MS /MS no modo TOF /TOF, e o correspondente espectros MS /MS foram transferidos por meio do programa MS BioTools (Bruker-Daltonics, Billerica, MA, EUA) como entradas para procurar o banco de dados NCBInr usando software MASCOT (Matrix Ciência, Londres, Reino Unido) [16].

Diferencial m /z picos selecção

ClinProTools (CPT) software 2.1 (Bruker-Daltonics , Billerica, MA, EUA) foi utilizado para seleccionar diferenciais picos m /z subtipos entre as amostras (NL, CA, SC e LC). Os espectros foram processados ​​da seguinte forma:

Normalização de todos os espectros à sua total Ion Contagem,

A recalibração dos espectros de uns sobre os outros usando os picos m /z mais proeminentes,

Linha de Base subtracção e detecção de pico m /z.

Uma vez padronizado e ajustado, CPT seleciona faixas de massa que foram consideradas como m /z picos e calcula áreas de pico para cada espectro [17]. Spectra foram divididos em dois grupos (grupo 1 e do Conjunto 2), que incluem uma medição de ponto diferente por amostra. Cada conjunto foi dividido em quatro grupos de espectros em função das combinações entre matriz MALDI e IMAC de metal (MX-Mt) utilizado para obtê-los (DHB-Fe, DHB-Ga, Fe e CHCA-CHCA-Ga). Cada um destes grupos espectros foram subsequentemente dividido em subgrupos histológicos (NL, CA, SC e LC) e analisadas separadamente por CPT. configurações CPT foram S /N 3 e Savitzky-Golay suavização (1 ciclo, m /z gama = 5) [18]. A combinação dessas listas dá uma lista de pico m /z combinado Mx-Mt. Então, nós incluímos todos os espectros de uma combinação Mx-Mt em CPT para medir todos os picos m /z no correspondente combinada Mx-Mt lista pico m /z. Picos com Kruskal-Wallis p-valor 0,1 foram rejeitados. Foram selecionados comum m /z picos entre dois conjuntos. Finalmente, o teste de Pearson entre os valores de cada pico de m /z alcançado no Conjunto 1 Conjunto 2 e para todas as amostras da área foram realizadas e m /z picos com R 0,4 foram excluídos. Assim, obteve-se quatro listas Mx-MT finais de m /z picos: DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe e lista CHCA-Ga. Selecionados m /z picos foram considerados picos consistentes.

Análise Discriminante e geração do modelo

Análise discriminante de cada finais listas de pico m /z Mx-MT foi realizada em SPSS 9.0. m /z picos incluídos em cada modelo discriminante foram incluídos em um segundo passo a passo Análise Discriminante, o que permitiu a criação de um modelo de discriminação global, incluindo m /z picos de todas as combinações Mx-MT.

agrupamento hierárquico Supervisionado

Resumidamente, um vector é atribuído a cada item de pseudo-, e este vector é utilizado para calcular as distâncias entre esta pseudo-produto e todos os itens restantes ou pseudo-itens utilizando o mesmo métrica de similaridade que foi usada para calcular a matriz de similaridade inicial. As análises foram realizadas no BRB-ArrayTools v3.6.1 desenvolvido pelo Dr. Richard Simon e Amy Peng Lang.

algoritmo conjunto Decisão-árvore

Com o objectivo de seleccionar os picos que podem diferenciar entre subtipos histológicos de amostras de cancro do pulmão, foi construído um classificador multi-pico usando AdaBoost decisão baseada em árvore classificador conjunto [19], [20]. Foram realizadas três análises independentes: AC vs. (SC + LC), LC vs. (AC + SC) e SC vs. (AC + LC) utilizando a lista de pico m /z última DHB-Ga. m /z valores de intensidade de pico normalizada de set1 foram usados ​​como conjunto de treinamento. m /z valores de intensidade de pico normalizada de set2 foram usados ​​como conjunto de teste. 200 iterações foram realizados em todos os casos. A área sob a curva ROC (Receiving Operating Characteristic) curva (AUC) é igual à probabilidade de classificar correctamente um par de amostras, cada um para uma classe separada, e é usada como uma medida do desempenho do classificador (20). As análises estatísticas foram realizadas em R versão 2.4 com o pacote de software impulso versão 1,0-0 e SPSS 9.0.

Análise estatística para picos identificados

Após a identificação de proteínas por MS /MS, ANOVA (quando possível ) e de Kruskall-Wallis análises foram realizadas para avaliar diferenças na expressão de tais proteínas em diferentes subtipos histológicos. U de Mann-Whitney foi utilizado para se estudar as diferenças entre dois sub-grupos, após análises de Kruskall-Wallis. As análises estatísticas foram realizadas no SPSS 9.0.

Imunohistoquímica

formalina-fixo, blocos de tecido embebidos em parafina, representante do diagnóstico NSCLC, foram recuperados na sequência da avaliação histopatológica de rotina. As secções foram processadas utilizando um sistema de coloração universal Dako Autostainer (Dako, Glostrup, Dinamarca). Para este estudo, seções 3,5 mícrons foram imunocoradas com CK8 anticorpo monoclonal (1:100 diluição; Novacastra, Newcastle upon Tyne, UK). Foram avaliadas duas fatias de tecido de cada amostra.

Resultados

O objetivo principal do presente estudo foi testar se os perfis de peptídeos trípticos, obtidos a partir de amostras de pulmão normais e tumorais humanas utilizando PIMAC e MALDI- técnicas TOF MS, poderia discriminar normal Lung (NL) de câncer de pulmão, bem como entre os subtipos histológicos de câncer de pulmão mais comum: adenocarcinoma (AC), carcinoma de grandes células (LC) e carcinoma de células escamosas (SC). Apenas 49 de 59 amostras foram selecionadas para a análise a seguir, porque amostras sem um teor mínimo de células tumorais 50% foram descartados. Assim, NL 15, 14 AC, 9 LC e 11 SC amostras foram subsequentemente analisados. O espectro de massa gerados para cada amostra tipicamente continha várias centenas de picos com S /N 3. [5]

intensidades de sinal de massa dos péptidos trípticos obtidos a partir de misturas complexas de proteínas são mediados por diversos factores, nomeadamente a concentração de proteína relativa , variando a eficiência da digestão enzimática, e eficiências de dessorção /ionização dependentes da sequência. Realizou-se um procedimento de processamento de espectros altamente reprodutível para se obter perfis de pico com um elevado grau de concordância em série de amostras. Consistentes picos m /z foram selecionados seguindo estes critérios: picos de massa tinham de estar presentes em ambos os pontos de amostra e de correlação de Pearson entre as intensidades de cada pico alcançado no Conjunto 1 e do Conjunto 2 para todas as amostras tinham que ser 0,4. coeficiente de correlação médio de Pearson foi de 0,8 para os picos DHB e 0,65 para os picos CHCA. Um requisito adicional (Kruskal-Wallis p-valor 0,1) foi aplicado a fim de incluir picos com poder discriminatório entre os subtipos de amostra. Estes critérios fornecida uma metodologia consistente e reprodutível, como mostrado pelo coeficiente de correlação de Pearson média dos picos de massa selecionados.

Nós investigamos a sobreposição entre picos seleccionados por cada uma das combinações Mx-MT (Figura S1). No geral, 97 picos de massa consistentes foram identificados através das quatro combinações Mx-MT. Em relação matrizes MALDI, 81 picos foram medidos em DHB e 41 em CHCA analisa. Em contraste, 80 picos foram medidos em IMAC baseada-Ga e 42 no iMac baseado em Fe analisa. Em ambos os casos, 25 picos sobrepostos foram encontrados. Apenas quatro picos foram consistentemente presentes em todas as combinações Mx-MT.

Uma vez que os picos consistentes tinha sido selecionado, a análise discriminante foi realizada em cada lista final de pico Mx-Mt. Portanto, quatro modelos discriminantes foram construídos e os sinais de massa envolvidos em cada modelo estão listadas na Tabela S1. Todos estes modelos discriminantes foram capazes de classificar as amostras em quatro grupos, correspondendo a NL, CA, SC e LC. Percentagens de amostras corretamente classificados por cada modelo e leave-one-out percentagens de validação cruzada de amostras corretamente classificados são apresentados na Tabela S1. Um segundo passo a passo análise discriminante foi realizada com picos incluídas nos quatro modelos Mx-Mt discriminantes (22 picos) para evitar incluindo sinais de massa ruidosos na análise. O modelo global incluiu 9 m /z picos e classificados corretamente 98,0% das amostras (48 de 49) na LOOCV.

Foi realizada uma Supervisionado hierárquica Centróide Linkage Clustering usando os 9 picos incluídos no modelo global. Como mostrado na Figura 1, existem dois conjuntos principais, separando amostras de pulmão normal da maioria das amostras de tumor. No entanto, não existe separação perfeita entre subtipos histológicos. Com o objectivo de seleccionar os sinais de massa que possam caracterizar amostras a partir de um subtipo histológica quando comparados com os outros subtipos de amostras de NSCLC, foi realizada conjunto classificador baseado em árvore AdaBoost decisão. Três análises independentes foram realizadas: AC vs. (SC + LC), LC vs. (AC + SC) e SC vs. (AC + LC), utilizando dados em Set 1, como conjunto de treinamento e dados no Conjunto 2 como teste definir a partir de a lista final de pico DHB-Ga. A área sob a curva (AUC) a partir de ROC foi calculada para cada comparação no treinamento e conjunto de teste. Obteve-se a influência relativa de cada pico de geração do modelo. A área sob a curva ROC e melhores picos para cada comparação são mostrados na Tabela 1.

Mapa de calor do supervisionadas hierárquica Centróide Linkage Clustering de áreas normalizadas dos picos m /z, em duas dimensões, para as amostras 49 e os 9 m /z picos incluída no modelo discriminante global.

identificação MS /MS de alguns picos m /z selecionados pelo discriminante e AdaBoost análises foi realizada por MALDI-TOF /TOF ( tabela S2). De modo a avaliar as diferenças de sinais peptídicos identificados entre subtipos histológicos, ANOVA e teste de Kruskal-Wallis, foram realizadas análises. B-globina sinais de massa revelou uma diminuição significativa da intensidade em amostras de tumor quando comparados com os normais do pulmão, ao passo que picos GAPDH e? -actina mostraram um aumento da intensidade em amostras de tumor. CK8 pico de intensidade diminuiu em carcinomas de grandes células, quando comparado com adenocarcinoma e amostras de carcinoma de células escamosas.

Foi analisado o padrão de expressão por imuno-histoquímica (IHQ) de alguns destes marcadores. A proteína de humano de ‘Atlas (https://www.proteinatlas.org/) [21] mostra a expressão e localização de proteínas em uma grande variedade de tecidos normais e de cancro humano, bem como linhas de células com o auxílio de IHC. perfis de expressão de IHQ para β-actina e GAPDH foram avaliadas nesta base de dados útil. Há um aumento na expressão de β-actina em algumas amostras de cancro do pulmão, quando comparados com os normais. No entanto, a expressão GAPDH no cancro do pulmão é altamente variável. Além disso, foi realizada a análise IHC de expressão CK8 em cinco amostras AC, LC e SC. As células positivas para CK8 imunocoloração foram encontrados em todas as amostras LC e AC. Em contrapartida, apenas três de cinco amostras de SC apresentou coloração positiva. Positivamente amostras manchadas mostrou, em média, 20-70% de células coradas (Figura 2).

CK8 imunocoloração (Ampliação × 40). As setas apontam para células tumorais. (A) carcinoma de células escamosas do pulmão mostrando células tumorais coradas negativos. Pulmão epitélio mostra coloração positiva. (B) O carcinoma epidermóide do pulmão corado positivamente. (C, D) o carcinoma de células grandes do pulmão, mostrando diferentes graus de coloração positiva. (E, F) Adenocarcinoma do pulmão mostrando diferentes graus de coloração positiva.

Discussão

perfis de expressão genética global tem melhorado nossa compreensão da heterogeneidade histológica de não-pequenas células câncer de pulmão e identificou potenciais biomarcadores e assinaturas genéticas de classificação de pacientes com significativamente diferentes resultados de sobrevivência [22]. Uma compreensão abrangente dos mecanismos por trás carcinogênese, a progressão do tumor, e metástases vai exigir uma análise em profundidade de não apenas o genoma, mas também o proteoma [23]. As análises ao nível do gene não pode detectar as subtilezas biológicos introduzidos por meio de modificações pós-tradução de proteínas e, assim, requer uma abordagem proteómica [5], [24].

A reprodutibilidade foi mostrado para comprometer perfis proteína em todas as fases, a partir de métodos de isolamento do péptido a amostra de aquisição e processamento de espectros [5], [11], [25], [26]. Neste estudo, aplicamos técnicas cromatográficas de enriquecimento fosfopeptídeo para reduzir a complexidade das amostras de câncer de pulmão humano e analisados ​​isolado peptídeos por MALDI-TOF MS. Nós descrevemos um método de selecção pico de massa que produz um perfil peptídico reprodutíveis a partir de experimentos MALDI MS usando ClinProTools. Groseclose et ai. descrita uma limitação do uso de CPT é que os picos que podem ser significativos entre um pequeno subconjunto de espectros em um grupo, pode tornar-se insignificante, quando a média com o outro em que os espectros de grupo [5]. A fim de avaliar como muitos picos quanto possível, foi realizada uma etapa anterior na seleção de pico usando CPT. Em cada análise Mx-Mt, todos os espectros de um único subtipo amostra foram introduzidos no CPT, a obtenção de um subtipo lista pico característico. Uma vez que todas as listas de subtipo foram obtidos, uma nova lista foi gerada pela combinação, incluindo todos os picos presentes nestas listas subtipo. Em seguida, a partir de espectros de todos os subtipos de amostra foram incluídos em CPT, e todos os picos nesta lista combinados foram medidos. Nós confirmou que alguns picos discriminantes foram excluídos quando espectros de todos os subtipos de amostra são incluídos diretamente no CPT e análise padrão é realizada.

É de salientar que, ao usar DHB como uma matriz MALDI proporcionou um maior número de picos de massa como em comparação com CHCA. Do mesmo modo, a abordagem com base IMAC-Ga produz mais sinais de massa, em comparação com o ensaio à base de Fe. Além disso, as listas de pico de espectros derivados DHB mostrou uma correlação média mais elevada entre os conjuntos de dados. Estes resultados sugerem que a MALDI análises usando IMAC baseada-Ga e DHB como MALDI matriz são mais reprodutível e fornecer um maior número de sinais em massa. Os picos identificados derivados de proteínas altamente expressos e os péptidos que discriminam restantes não puderam ser identificadas por MALDI MS. estratégias de identificação alternativos devem ser testados, a fim de aumentar a identificação de sinais de baixa intensidade em estudos MALDI MS.

discriminante análises permitiu-nos para separar amostras de pulmão e NSCLC normais e identificar os péptidos que melhor discriminaram entre normal e doente tecidos, como mostrado por análise de agrupamento (Figura 1). No entanto, esta tarefa não é normalmente problemática devido às diferenças importantes entre tecidos normais e cancerosas. O que prova mais complicado é encontrar diferenças entre subtipos histológicos distintos. Como mostrado na Figura 1, existem dois principais conjuntos de amostras de câncer de pulmão, incluindo adenocarcinomas e carcinomas de grandes células separadamente, mas amostras de carcinoma de células escamosas são dividos entre estes clusters.

Tem sido descrito que os classificadores do ensemble superar única decisão árvores classificador por ter maior precisão e erros de previsão menores quando aplicado a conjuntos de dados de proteômica [27]. Então, nós testamos se AdaBoost analisa poderia classificar as diferentes amostras de NSCLC corretamente. Os nossos resultados sugerem que AdaBoost pode discriminar amostras de um cancro do pulmão subtipo histológico das outras duas. O uso de repetições técnicas como conjunto de teste nos permitiu avaliar a robustez da metodologia empregada.

Nossos dados sugerem que tanto GAPDH e β-actina tem uma expressão significativamente aumentada em amostras de câncer de pulmão. Superexpressão de GAPDH em cancros do pulmão humanos foi descrito anteriormente por Tokunaga et al [28] e há muitas publicações que mostram aumento da expressão de GAPDH na mama [29], pancreático [30] e cervical [31], [32] cancros humanos. Por outro lado, vários estudos indicaram que β-actina foi expresso diferencialmente no cancro humano (revisto em 28). Ambas as proteínas apresentaram níveis aumentados de hepatoma de rato [33]. Além disso, perfis de expressão IHC para β-actina e GAPDH, avaliada em proteína humana Atlas, foram muito variáveis ​​em amostras de câncer de pulmão. Estes resultados questionar a utilização destas proteínas como produtos de limpeza em análises de amostras de cancro proteomic.

citoqueratina 8 (CK8) é uma proteína de filamento intermediário II tipo que é persistentemente expresso na maioria dos tumores malignos epiteliais [34], incluindo todos subtipos de NSCLC [35]. Aumento dos níveis de CK8 no soro têm sido associados com a progressão do tumor e diminuiu a sobrevivência em pacientes com NSCLC [36]. Em contraste com estes relatórios, não observamos aumento da expressão de CK8 em amostras de tumor por análises MALDI-MS. No entanto, descobrimos que os níveis CK8 são reduzidos em amostras de carcinoma de grandes células, quando comparado com o pulmão normal.

Para avaliar a utilidade de expressão CK8 como biomarcador de carcinomas de grandes células, foi realizada a análise IHC de expressão CK8 em 15 amostras de câncer de pulmão (cinco AC, cinco LC e cinco SC). Em nossa opinião, nenhuma conclusão pode ser feita sobre a relação entre IHC e expressão de péptidos de perfis de nossos dados. Essa diferença entre as técnicas poderia ser devido ao enriquecimento fosfopeptídeo antes da amostra de análise ou poderia implicar que as abordagens MS são mais sensíveis do que IHC. O péptido identificado por MALDI MS /MS (DVDEAYMNKVELES) contém um sítio de fosforilação potencial em Tyr204, relacionada com a fosforilação por quinases oncogénicas [37]. estudos anteriores que avaliam a utilidade de CK8 como um biomarcador no cancro do pulmão não incluir qualquer carcinoma de grandes células [35], [36].

O estudo tem algumas limitações. Assim, existe uma capacidade limitada para identificar os picos de massa pequenos com base na análise por MS /MS de misturas de péptidos relativamente complexas. No entanto, MALDI MS tem algumas vantagens para a descoberta de biomarcadores: a expressão da proteína e dados quantificação relativa pode ser gerado para múltiplas amostras de tecido do doente em uma única experiência. Por outro lado, a comparação de IHC e peptídeo perfil de expressão valoriza relacionamento deve ser feito com cuidado, pois parece que o enriquecimento de afinidade antes de amostras poderia introduzir algum viés.

No entanto, nosso estudo não enfatizar o grande potencial da proteômica na caracterização molecular do câncer. Identificação de proteínas diferencialmente expressas por PIMAC e MALDI-TOF /TOF MS foi realizada em digestões com tripsina fraccionadas derivadas de pequenas quantidades de tecidos obtidos a partir de amostras de pulmão normal e NSCLC. Usando um método de preparação de amostra otimizada e uma estratégia cuidadosa aquisição de dados, que superou o grande desafio de reprodutibilidade dos perfis peptídeo baseado no MS MALDI. Independentemente da natureza dos péptidos identificados por MS /MS, a combinação apropriada de valores de expressão de péptido é capaz de discriminar pulmão normal a partir de amostras de NSCLC e entre os diferentes subtipos histológicos NSCLC. Futuros estudos são destinadas a estabelecer perfis de peptídeo como uma ferramenta útil na descoberta de novos biomarcadores com potencial relevância diagnóstico ou theragnostic.

Informações de Apoio

Figura S1.

Venn diagramas mostrando m /z picos sobrepostos entre listas finais m /z de pico a partir de:. (A) quatro diferentes combinações Mx-MT, (B) resinas iMac, e (c) as matrizes MALDI

doi: 10.1371 /journal.pone.0007731.s001

(0.04 MB PPT)

Tabela S1.

percentagens de amostras classificadas corretamente, deixar-um em percentagens de validação cruzada de amostras corretamente classificados e m /z picos incluídos em cada modelo de combinação discriminante Mx-Mt. Peaks em negrito também estão incluídos na z picos /modelo de discriminação global de 9 m

doi:. 10.1371 /journal.pone.0007731.s002

(0,03 MB DOC)

Tabela S2.

diferencialmente expressos massas peptídicas a partir dos espectros CHCA-MALDI identificado por MALDI-TOF /TOF e motor de busca MASCOTE. MASCOTE indivíduo íons pontuações são significativos (p 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0007731.s003

(0,03 MB DOC)