Abstract

O tratamento de câncer não pequenas células (CPNPC) e cancro colorectal (CRC) ter sensivelmente alterado nos últimos anos com a introdução do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) inibidores na prática clínica. A compreensão dos mecanismos que regulam as células sensibilidade a estas drogas é necessária para a sua utilização optimizada.

Um modelo in vitro de resistência adquirida a dois inibidores da tirosina quinase (TKI) visando o EGFR, erlotinib e gefitinib, e um TKI de EGFR e VEGFR segmentação, vandetanibe, foi desenvolvido por tratar continuamente a linha celular humana NSCLC Calu-3 e a linha de células HCT116 de CRC humano com doses crescentes de cada uma das drogas. MTT, Western Blot análise, a migração, invasão e ensaios de formação de colónias independentes de ancoragem foram realizados in vitro e experiências com xenoenxertos estabelecidos em ratinhos nus atímicos foram realizadas in vivo em sensível, do tipo selvagem (WT) e resistentes a TKI Calu-3 e HCT116 linhas celulares.

em comparação com WT Calu-3 e células de cancro humano HCT-116, linhas de células resistentes a TKI mostrou um aumento significativo nos níveis de activado, AKT fosforilado, MAPK, e de survivina. Considerando o papel de RAS e RAF como sinais a jusante de ambos o EGFR e vias de VEGFR, que trataram células resistentes com sorafenib, um inibidor de C-RAF, B-RAF, c-KIT, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-β e. Sorafenib reduziu a activação de MEK e MAPK e causou uma inibição da proliferação celular, invasão, migração, crescimento independente de ancoragem in vitro e do crescimento do tumor in vivo de todas as linhas de Calu-3 e células HCT116 resistentes-TKI.

Estes dados sugerem que a resistência aos inibidores de EGFR é predominantemente dirigido pelo /RAF via de Ras /MAPK, e pode ser superado pelo tratamento com sorafenib

citação:. Morgillo F, e Martinelli, Troiani t, Orditura M, de Vita F, Ciardiello F (2011) antitumoral Atividade de sorafenib em linhas celulares de cancro humano com resistência adquirida à EGFR e VEGFR tirosina quinase inibidores. PLoS ONE 6 (12): e28841. doi: 10.1371 /journal.pone.0028841

editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Itália |

Recebido: 25 de maio de 2011; Aceito: 16 de novembro de 2011; Publicação: 09 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Morgillo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Milão, Itália. Floriana Morgillo é o destinatário de uma Sociedade Europeia de Oncologia Médica (ESMO) bolsa de pesquisa translacional. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), é um regulador central da proliferação de células de cancro e progressão de vários tipos de cancro humano. A eficácia clínica de inibidores de EGFR (cetuximab, panitumumab, erlotinib, gefitinib e Vandetanib) introduzidas na prática clínica para o tratamento de cancros metastáticos está limitada a um subgrupo de pacientes com a maioria dos doentes com cancro que mostra quer resistência intrínseca ou adquirida a estes fármacos [1].

os avanços recentes no conhecimento dos mecanismos de biologia do cancro e de resistência a drogas identificaram, entre as vias de sinalização intracelular, que atuam como a jusante do EGFR, a AKT e RAS /RAF /proteína quinase activada por mitogénio (MAPK) vias como principal responsável pelo desenvolvimento de resistência de células de cancro para os inibidores de EGFR [2] -. [4]

no entanto, foi demonstrado recentemente que, no nosso in vitro de células não pequenas cancro do pulmão modelo (NSCLC) da resistência adquirida a gefitinib e erlotinib, o tratamento com vários agentes conhecidos para alvejar directamente ou indirectamente a AKT via de sinalização, tal anúncio LY294002, deguelin e everolimus, não foi eficaz na inibição da erlotinib- (ERL-) e gefitinib – (GEF) proliferação de células de cancro resistente a [5]

por outro lado, as mutações do gene K-ras tem sido descrita tanto em NSCLC e cancro colo-rectal (CRC) pacientes como responsável por um mau prognóstico. e má resposta aos inibidores de EGFR [6]. Estas mutações fazem com que as proteínas KRAS a acumular-se na, forma activa ligada a GTP conduz a, factor de crescimento-receptor de activação independente constitutiva de sinalização a jusante KRAS em células tumorais [7]. O desenvolvimento de estratégias terapêuticas para pacientes com mutações KRAS é, portanto, um objectivo clínico importante. RAF quinases de serina-treonina são os principais efectores da RAS na via de MAPK sinalização e, por conseguinte, é um alvo potencial para a terapia do cancro. Até à data, o mais bem sucedido clínica inibidor da actividade RAF é sorafenib (Nexavar, BAY 43-9006) [8] – [10], um inibidor de cinase de multi-alvo oralmente disponíveis, que bloqueia a activação de proteína C-RAF, B-RAF (tanto o tipo selvagem e o mutante V600E activado), c-KIT, FLT-3, RET, vascular receptor do factor de crescimento endotelial 2 (VEGFR-2), VEGFR-3, e β do receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR- β) [8] – [10], atualmente aprovado para o tratamento de carcinoma de células renais metastático (RCC) e para o carcinoma hepatocelular avançado (HCC), e sob investigação em outras malignidades. Sorafenib afecta o crescimento do tumor por inibição directa da proliferação de células tumorais e promovendo a apoptose numa variedade de tipos de tumores, bem como através da inibição da neoangiogénese induzida por tumor.

O nosso laboratório forneceu recentemente evidência de uma interacção sinérgica entre sorafenib e erlotinib ou entre sorafenib e cetuximab, um anticorpo monoclonal alvo o domínio extracelular do receptor EGF, em um painel de NSCLC e linhas celulares de cancro colorectal (CRC),

in vitro

e

in vivo

, que é acompanhada por uma inibição acentuada e prolongada do MAPK- e sinais intracelulares dependente de AKT [11].

Colocámos a hipótese de que o tratamento com sorafenib poderia superar o TKI de EGFR-resistência induzida pela sua capacidade para bloquear vários factor de crescimento sinais impulsionado por receptores. Além disso, como blocos de sorafenib B-RAF, e que poderia ser eficaz em linhas celulares de cancro que expressam mutações ativadoras K-RAS.

No presente estudo, relatamos no desenvolvimento e na caracterização das NSCLC humana e CRC linhas de células com resistência adquirida a dois inibidores da tirosina cinase (TKI) do EGFR de segmentação, erlotinib e gefitinib, e um TKI de EGFR segmentação, VEGFR e RET, vandetanibe, e sobre os efeitos antitumorais do sorafenib nestas linhas celulares de cancro resistentes.

Resultados

Desenvolvimento e caracterização de células Calu-3 e câncer HCT116-resistentes TKI

a linha de células humanas NSCLC Calu-3 e a linha de células CRC HCT116 humano abrigar o tipo EGFR selvagem e um gene de mutação do gene K-ras activação (KRASp.G13D). Em contraste com as outras mutações K-ras, esta mutação tem sido descrito como não influenciando a sensibilidade ao tratamento anti-EGFR, em particular cetuximab [11]. Estas linhas celulares de cancro tem sido caracterizada anteriormente pelo nosso grupo para a expressão dos quatro receptores de factor de crescimento relacionado com a EGF (EGFR, erbB2, erbB3 e erbB4) e dos três receptores de VEGF (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 ), bem como para a expressão de três ligandos de EGFR (anfirregulina, EGF e TGFa) e de três ligandos de VEGFR (VEGF-a, VEGF-B, VEGF-C), usando RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) [12]. Todos os ligandos de ARNm testadas foram expressas em Calu-3 e células HCT116 linhas. células Calu-3 também expressou ARNm de EGFR, enquanto que níveis baixos de ErbB2 e ErbB3 mRNAs foram mensuráveis. O VEGFR-2 e VEGFR-3 a expressão de ARNm foi detectada na linha de células Calu-3. A expressão do EGFR e dos seus ligandos específicos sugere que nestas linhas celulares de cancro humano, uma via autócrina impulsionado-EGFR é relevante para a proliferação de células de cancro. Na verdade, Calu-3 e as células HCT-116 são, por tratamento com TKI EGFR selectiva, tais como gefitinib ou erlotinib [13] inibiu o crescimento. Além disso, estas células de cancro expressam ambos os ligandos VEGF e VEGFR e são o crescimento inibido por tratamento com TKI anti-angiogénico [13].

Portanto, as células Calu-3 e HCT-116 foram seleccionadas como um modelo para explorar a resistência adquirida mecanismos para o tratamento com o erlotinib e gefitinib EGFR TKI, ou com a dupla EGFR /VEGFR tirosina-quinase vandetanib inibidor.

o gefitinib- (GEF-R), erlotinib- (ERL-R) e vadetanib- (VAN -R) linhas celulares resistentes foram obtidos por cultura de células continuamente Calu-3 e HCT-116 na presença de doses crescentes de cada droga durante 12 meses. Após o estabelecimento de três linhas de células Calu-3 HCT116 diferentes resistentes-TKI Calu-3 e três diferentes TKI-resistentes, que caracteriza o seu fenótipo resistente, fazendo ensaios de proliferação de células na presença de cada um destes inibidores. Tal como ilustrado na Tabela 1, um aumento de aproximadamente 10 vezes na IC

50 para cada linha celular resistente a TKI, em comparação com as células parentais foi observada. ERL-R, GEF-R e VAN-R Calu-3 e linhas celulares de cancro humano HCT116 apresentaram uma resistência cruzada a qualquer gefitinib, erlotinib ou tratamento vandetanib. A seguir, confirmou o estabelecimento de células Calu-3 e de cancro resistentes HCT116-TKI estáveis ​​num meio de cultura livre de drogas. Na verdade, todas as seis linhas celulares resistentes a TKI pode crescer na ausência de cada droga por longos períodos de tempo (três a seis meses) e manter o seu fenótipo resistente TKI (dados não mostrados).

Para caracterizar ainda mais os Calu-3 e células HCT116 TKI linhas resistentes, examinámos a expressão diferencial de proteínas entre tipo selvagem, seus derivados TKI resistente sensível Calu-3 e células HCT116 e.

a activação dos condutores de EGFR para um complexo de sinalizao intracelular que inclui a activação da via de pro-sobrevivência PI3K /AKT e o mitogénica da via Ras /RAF /MEK /MAPK [13], [14]. Nós, portanto, investigado por immunoblotting análise destas vias moleculares. Tal como ilustrado na Figura 1, a activação estimulada por EGF do EGFR foi bloqueada de forma eficiente em células WT e ERL-R, GEF-R e Van-R, tal como demonstrado pela inibição do EGFR auto-fosforilação (P-EGFR).

A análise Western blot de EGFR e de down-stream vias em Calu-3 e HCT116 células humanas parentais (WT) e em seus derivados TKI-resistente (ERL-R, GEF-R, VAN-R) de sinalização. β-actina foi incluída como um controlo de carga.

Uma vez que as formas activadas, fosforiladas de AKT e MAPK são importantes mediadores intracelulares de sobrevivência de células activadas por factor de crescimento e sinais de proliferação [13], [14] investigar o estado de activação destas vias moleculares pode ser de interesse na compreensão dos mecanismos de resistência. A activação de MAPK e AKT com um aumento das suas formas fosforiladas (P-MAPK e P-AKT), bem como um aumento nos níveis de proteína de survivina foram observadas em todas as três linhas de células Calu-3-resistentes TKI e em todos resistente a TKI três linhas celulares HCT116, em comparação com o seu homólogo parental (Figura 1).

Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que neste modelo de células de cancro da resistência adquirida a três diferentes TKI, a activação de MAPK e AKT–driven sinais intracelulares podem ser responsáveis ​​pelo crescimento de células de cancro, na presença de anticorpos anti-EGFR TKI selectiva, tais como gefitinib ou erlotinib, ou na presença de um amplo espectro de TKI, tais como vandetanibe.

Efeitos de sorafenib na TKI-resistentes Calu-3 e o crescimento de células de cancro HCT116

à luz do papel de RAF e RAS como mediadores a jusante de ambos os sinais de VEGFR e EGFR a partir da superfície celular, testou-se o efeito anti-proliferativo de sorafenib, uma multi- alvo inibidor de quinase, bloqueando a activação do C-RAF, B-RAF, c-KIT, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3, e PDGFR-β [8], o WT e resistente a TKI CALU parental células cancerosas -3 e HCT116. Observou-se uma inibição significativa do crescimento de células em ambas as células Calu-3 WT e células HCT116 WT e os seus correspondentes derivados de três-resistentes TKI após o tratamento sorafenib, com um IC

50 variando de 0. 1-0,5 uM, (Figura 2 ) .que caracterizada ainda mais os efeitos do tratamento sorafenib na sinalização intracelular através de Western blotting. Tal como ilustrado na Figura 3, o tratamento de ERL-R, GEF-R e Van-R Calu-3 e HCT116 células com sorafenib durante 48 horas não afectou os níveis de proteína total da MEK e MAPK, enquanto que provocou uma diminuição acentuada da fosforilada, formas activadas de MEK (MEK-P) e de MAPK (P-MAPK). Além disso, foi investigado o estado de activação de todos os alvos moleculares de sorafenib por estudar os níveis de C-RAF, B-RAF, c-Kit, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3 e PDGFRβ, e expressão de proteínas a sua estado phosphoryation por análise de transferência de western. Entre todos os alvos de actividade sorafenib, somente C-RAF e B-RAF resultou activado em linhas de células resistentes Calu-3 e de cancro HCT116, e, portanto, fortemente inibida pelo tratamento com sorafenib (Figura 3).

proliferação celular MTT Os ensaios foram realizados em adenocarcinoma do pulmão Calu-3 parentais e células HCT116 do cancro colo-rectal. (WT) e de seus derivados TKI-resistente (ERL-R, GEF-R, VAN-R), tratadas durante três dias com as concentrações indicadas de sorafenib. Os resultados representam a média (± DP) de três experiências separadas, cada uma realizada em quadruplicado.

análise de transferência de Western de C-RAF, B-RAF, MEK e MAPK de activação após o tratamento com a concentração indicada de sorafenib de derivados resistentes-TKI adenocarcinoma do pulmão Calu-3 e células de cancro colorrectal HCT-116 (ERL-R, GEF-R, VAN-R). β-actina foi incluída como um controle de carga.

Efeitos do tratamento com sorafenib sobre a invasão, migração e crescimento independente de ancoragem de resistente TKI células Calu-3 e câncer HCT116

tem sido sugerido que as células de cancro submetidos resistentes a drogas anti-EGFR poderia ter um fenótipo mais agressivo e metastático com o aumento da capacidade de invasão, migração e a formar colónias em meio semi-sólido [15]. Portanto, avaliamos essas propriedades em células WT Calu-3 e HCT116 câncer TKI-sensíveis e em seus derivados TKI-resistente. Tal como ilustrado na Figura 4, WT Calu-3 e as células HCT-116 demonstrou pouca ou nenhuma capacidade de invasão e migração. Pelo contrário, todos os Calu-3 e linhas de células HCT116 TKI resistente exibiram capacidades invasivas e migratórias significativas. Além disso, o seu crescimento independente de ancoragem de colónias foi aumentada de aproximadamente 3 vezes em comparação com células WT (Figura 4). Colectivamente, estes resultados sugerem que as linhas celulares de cancro com resistência adquirida ao erlotinib, gefitinib e vandetanibe adquiriram um potencialmente, mais comportamento metastático mais invasiva e,.

de crescimento de Anchorage-independente (A), a migração (B) e invasão (C), foram avaliados em resistente TKI Calu-3 e derivados HCT116 (ERL-R, GEF-R, R-VAN) após o tratamento com as concentrações indicadas de sorafenib. Os resultados são a média ± SD de três experiências independentes, cada uma realizada em triplicado. imagens representativas são mostradas para as capacidades de migração e invasão de Calu-3 WT e linhas de células resistentes.

A seguir, avaliou os efeitos de sorafenib sobre as capacidades invasivas e migratórias da Calu-3-resistant TKI e linhas de células HCT116. Nós não testado o efeito do tratamento sorafenib em linhas celulares de cancro WT sensível ao TKI em consideração a ausência de capacidade migratória e invasiva. Observou-se uma inibição dependente da dose significativo de invasão e migração em todas as linhas celulares TKI resistente após o tratamento com sorafenib (Figura 4).

Efeitos de sorafenib na resistentes TKI Calu-3 e xenoenxertos tumorais HCT116

Nós finalmente investigou a atividade antitumoral in vivo de sorafenib em ratinhos nus portadores de WT Calu-3 e de células HCT116 ou TKI resistente Calu-3 e HCT116 linhas que foram cultivadas por via subcutânea, xenotransplantes. Em WT Calu-3 e tumorais HCT116 xenoenxertos, o tratamento com sorafenib causou uma redução significativa no tamanho do tumor, em comparação com ratinhos de controlo não tratados. Por exemplo, no dia 35 a partir do início do tratamento, o volume do tumor em ratinhos portadores de xenoenxertos de tumores WT significa e tratou-se com sorafenib foi, respectivamente, 38% e 31% em Calu-3 e HCT 116, em comparação com ratinhos de controlo não tratadas (Figura 5, 6 ). Além disso em ratinhos portadores de ERL-R, GEF-R ou R-VAN Calu-3 e tumorais HCT116 xenoenxertos, o tratamento com sorafenib induziu uma redução significativa no crescimento do tumor (Figura 5, 6). A este respeito, no dia 35 a partir do início do tratamento, a média de volume do tumor nos ratos tratados com sorafenib variou entre 27% e 40%, em comparação com ratinhos de controlo não tratados.

A, parental (WT) células cancerosas Calu-3; B, GEF-R células cancerosas Calu-3; C, as células Calu-3cancer VAN-R; D, Calu-3 células cancerosas ERL-R. ratinhos nus atímicos foram injectados subcutaneamente no flanco dorsal com 10

7 células cancerosas. Após 7 a 10 dias (tamanho médio do tumor, 75 mm

3), os ratinhos foram tratados como indicado em Materiais e Métodos, durante 5 semanas. Cada grupo de tratamento consistiu em 8 ratos. Os dados representam a média (± SD).

t

teste de Student foi utilizado para comparar tamanhos de tumor entre os diferentes grupos de tratamento no dia 35 após o início do tratamento. A, Calu-3 WT: sorafenib versus controlo (two-sided p 0,001); B, Calu-3 GEF-R: sorafenib versus controle (p dois lados 0,001). C, Calu-3 VAN-R: sorafenib versus controle (p dois lados 0,001); D, Calu-3 ERL-R:. Sorafenib versus controle (p dois lados 0,001)

A, (WT) células cancerosas dos Pais HCT116; B, as células cancerosas HCT116 GEF-R; C, as células cancerosas HCT116 VAN-R; D, as células cancerosas HCT116. ratinhos nus atímicos foram injectados subcutaneamente no flanco dorsal com 10

7 células cancerosas. Após 7 a 10 dias (tamanho médio do tumor, 75 mm

3), os ratinhos foram tratados como indicado em Materiais e Métodos, durante 5 semanas. Cada grupo de tratamento consistiu em 8 ratos. Os dados representam a média (± SD).

t

teste de Student foi utilizado para comparar tamanhos de tumor entre os diferentes grupos de tratamento no dia 35 após o início do tratamento. A, HCT116 WT: sorafenib versus controlo (frente e verso p 0,001); B, HCT116: sorafenib versus controle (p dois lados 0,001). C, HCT116 VAN-R: sorafenib versus controle (p dois lados 0,001); D, HCT116 ERL-R:. Sorafenib versus controle (p dois lados 0,001)

Discussão

A ativação do EGFR e as vias de VEGFR desempenham um papel fundamental no desenvolvimento e progressão da maioria dos cancros epiteliais, incluindo NSCLC e CRC. No entanto, apenas um subgrupo de pacientes benefícios de tratamentos com drogas que visam a EGFR ou os caminhos VEGFR [16]. Na verdade, mesmo em inicialmente responderam ao tratamento secundário ou resistência adquirida ocorre causando a progressão do câncer e falência de tratamento. Vários mecanismos moleculares têm sido sugeridos para explicar a aquisição de resistência de células de cancro a drogas anti-cancro orientadas molecularmente [16].

a resistência das células do cancro de antagonistas de EGFR poderia ser devido a várias razões. Hospedar mecanismos relacionados, tais como a actividade do sistema imunitário deficiente, metabolismo rápido ou má absorção, são responsáveis ​​pela resistência intrínseca ou primária. Além disso, a instabilidade genética destas células gera clones celulares de cancro com uma resistência adquirida seguintes exposição prolongada a inibidores de EGFR. Uma vez que os antagonistas de EGFR interferir com a activação de várias vias intracelulares que controlam a proliferação celular, sobrevivência, a apoptose, a capacidade metastática, invasão e angiogénese induzida por tumores, é evidente que várias alterações moleculares diferentes poderia ser responsável pelo desenvolvimento de resistência a esses inibidores [ ,,,0],16].

no presente estudo, verificou-se que as células cancerígenas que se desenvolvem resistência aos inibidores da tirosina-cinase EGFR após o tratamento de longo tempo (resistência adquirida) exibem activado RAS /RAF /MAPK e vias AKT. A activação independente de EGFR destas vias a jusante faz com que as células cancerosas insensíveis à inibição de EGFR e representa uma das mais comuns causas de relatado resistência à terapia alvo EGFR em tumores sólidos.

A actividade constitutiva de, pelo menos, uma destas duas vias tem sido demonstrada ser capaz de define um fenótipo resistente afectada pelo tratamento com gefitinib e cetuximab [2], [17].

fosforilação persistente do RAS /RAF /MAPK, e /ou AKT vias pode ser explicado com a activação de receptores da superfície celular que não o EGFR, tais como um factor receptor de crescimento semelhante à insulina (IGF-1R) e MET [18] – [21], que se sabe ser iperexpressed ou activado na presença da inibição persistente do EGFR.

Além disso, uma atividade independente do receptor de aumento da RAS /RAF /MAPK e /ou vias AKT poderia resultados de amplificação do gene direta, ativando /inativação de mutações ou perda de regulador molecular [ ,,,0],22], [23].

no entanto, enquanto que a inibição da via do AKT não interfere com a proliferação de células resistentes, a inibição da via /MAPK RAF /MEK, por tratamento sorafenib reduz fortemente o crescimento e sobrevivência celular . De fato, entre todos os alvos moleculares de sorafenib, somente C-RAF e B-RAF resultou ativado em linhas de células resistentes, provavelmente por receptores a montante ainda não testadas neste trabalho; No entanto, esta informação sugere que a activação de sinais intracelulares RAF-dependentes pode ser um mecanismo importante para a aquisição de resistência à terapia anti-EGFR.

A via de sinalização /RAF /MAPK RAS é um alvo terapêutico promissor dada a sua papel central na regulação da proliferação de células de mamíferos, retransmissão de sinais extracelulares de receptores tirosina-quinase ligada ao ligando na superfície da célula para o núcleo através de uma cascata de acontecimentos de fosforilação específicos. O estado mutacional dos genes Ras e Raf-B tem sido demonstrada para afectar a sensibilidade de linhas de células de tumor para inibidores de EGFR [24]. No entanto, a segmentação terapêutico da via de ras tem sido até agora sem êxito. RAF quinases serina-treonina são os principais intervenientes de RAS e são considerados um alvo importante para a terapia do cancro. Agentes como sorafenib que ignoram RAS e inibem moléculas efetoras a jusante da GTPase mutante (por exemplo RAF) estão sendo avaliados. dados pré-clínicos sugerem que o sorafenib inibe o crescimento celular através da indução de paragem em G1 em linhas celulares de NSCLC independente do genótipo KRAS [8].

Um outro mecanismo possível de resistência à inibição de EGFR pode ser um aumento do potencial angiogénico através da célula endotelial melhorada proliferação e permeabilização. Com base dessa informação, vários estudos pré-clínicos têm sido realizados com a intenção de descobrir os efeitos de uma segmentação combinada do erb B e vias de VEGF, utilizando diferentes abordagens [25] – [29]. Além da possibilidade de utilização de terapias anti-EGFR em combinação com drogas anti-VEGF, uma série de quinases de tirosina que bloqueiam ambos o EGFR e o receptor de VEGF TK foram desenvolvidos, tais como vandetanibe, que demonstrou actividade significativa como agente único e em combinação com quimioterápicos tradicionais em vários tipos de tumores humanos [27] – [29]

Muitas vezes, inibidor EGFR resistentes linhas celulares de cancro humano para exposições, como característica comum, VEGFR superexpressão, aumento da secreção de VEGF e de crescimento placentário. fator, e capacidades de migração aumentada. Sorafenib inibe várias RTKs que participam na neovascularização, incluindo o receptor do factor de crescimento endotelial vascular (VEGFR) -2 e VEGFR-3 [30]. A inibição da angiogénese pode ser, assim, espera-se que contribuem para a inibição do crescimento do tumor por esta droga, em adição aos seus efeitos sobre a sinalização RAF. Embora sorafenib foi mostrado anteriormente para inibir o crescimento de uma variedade de xenoenxertos de tumores humanos em ratinhos [8], que tem sido difícil de medir as contribuições relativas de a sua actividade anti-angiogénico e a sua actividade antitumoral directa mediadas pela inibição da RAF. Além disso, no nosso trabalho, o desenvolvimento de células cancerosas humanas resistentes à vandetanibe, excluir a possibilidade de que sorafenib’efficacy pode depender da inibição de VEGFR.

Evidência de uma interacção positiva entre sorafenib e anti-EGFR drogas recentemente, foram fornecidas pelo nosso grupo [12]. evidências pré-clínicas apoiado um forte efeito anti-proliferativa e anti-migratórios em linhas celulares de cancro NSCLC e CRC após a combinação com sorafenib além de medicamentos ant-EGFR [12]. Além disso, um estudo clínico de fase II recente suportado a combinação de erlotinib e sorafenib em pacientes idosos com CPNPC avançado, tendo em conta a taxa de sobrevivência de 1 ano superior [30].

Evidências

No presente estudo, nós fornecemos que sorafenib está activo na inibição do crescimento de células tumorais

in vitro

e

in vivo

de células cancerosas humanas resistentes a inibidor do EGFR e /ou VEGFR. A atividade de sorafenib está estritamente ligada à sua capacidade de bloquear RAF sinalização através da via /MAPK RAS /RAF /MEK.

Métodos

As linhas celulares, drogas e produtos químicos

o linhas celulares de CRC HCT116 humanas humano NSCLC Calu-3 e foram fornecidas pela American Type Culture Collection (Manassas, VA) e mantidas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Life Technologies, Gaithersburg, MD) numa atmosfera húmida com 5% de CO

2. Gefitinib e vandetanib foram fornecidos pela AstraZeneca, Macclesfield, Reino Unido; erlotinib foi fornecido pela Roche, Basileia, Suíça; sorafenib foi fornecido pela Bayer Schering Pharma, Leverkusen, Alemanha. Os anticorpos primários contra a P-EGFR (Tyr1173), EGFR, P-MAPK44 /42 (Thr202 /Tyr204), MAPK44 /42, P-AKT (Ser473), AKT, P-MEK (Ser217 /221), MEK, PB-RAF (Ser 445), P-C-RAF (Ser 338), survivina foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA. kits de invasão de células e ensaio de migração foram obtidos por Chemicon, Millipore, CA, EUA. Todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma Aldrich, MO, EUA.

Estabelecimento de Calu-3 e câncer HCT116 linhas de células com resistência adquirida a diferentes TKI

Durante um período de 12 meses, CALU humana -3 células de adenocarcinoma do pulmão e células de carcinoma colorrectal humano HCT116 foram continuamente expostas a concentrações crescentes de qualquer gefitinib, erlotinib ou vandetanibe, como previamente descrito (12). A dose de partida foi a dose que provoca a inibição de 50% do crescimento das células do cancro (IC

50) para cada inibidor de EGFR (i.e .: erlotinib, 3 uM; gefitinib, 6 uM; vandetanibe, 1 uM). A dose de droga foi progressivamente aumentada para 15 uM em cerca de dois meses, a 20 uM, após outros dois meses, a 25 uM, após dois meses adicionais, e, finalmente, a 30? M para um total de 12 meses. As linhas celulares de cancro resistente estabelecidos foram então mantidas em cultura contínua com a dose maximamente conseguido de cada TKI que permitia a proliferação celular (30 uM para cada droga).

proliferação celular ensaio

As células cancerígenas eram semeadas em placas de 96 poços e foram tratadas com diferentes medicamentos, tais como erlotinib, gefitinib, vandetanibe ou sorafenib durante 72 horas. A proliferação celular foi medida com o ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT). A IC

50 foram determinados por interpolação a partir das curvas de dose-resposta. Os resultados representam a média de três experiências separadas realizadas em quadruplicado cada

análise de transferência de Western

Após o tratamento, as células cancerosas foram lisadas com tampão de lise Tween-20 (50 mmol /L de HEPES, pH 7,4. , 150 mmol /L de NaCl, 0,1% de Tween-20, 10% de glicerol, 2,5 mmol /L de EGTA, 1 mmole /L de EDTA, 1 mmol /l de DTT, 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, e 10 ug /mL de leupeptina e aprotinina ) e sonicado. Quantidades iguais de proteína foram analisadas por SDS-PAGE. Em seguida, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e analisadas por anticorpos primários específicos, tal como indicado no experimento. As proteínas foram detectadas por meio de incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e detecção de quimioluminescência ECL sistema.

ensaio de invasão

A capacidade invasiva in vitro foi medida por meio de câmaras Transwell, de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas sobre a membrana da câmara superior do Transwell a uma concentração de 2 x 10

5 /ml em 500 ul de meio RPMI e foram deixados sem tratamento, ou tratados com as doses indicadas de sorafenib durante 24 horas. O meio na câmara superior foi isento de soro. O meio na câmara inferior continha FBS a 10% como fonte de quimio-atractores. As células que passou através da membrana revestida de Matrigel foram coradas com Cell Stain Solution contendo cristal violeta fornecido no ensaio de invasão Transwell (Chemicon, Millipore, CA) e fotografadas após 20 horas de incubação. A absorvância foi medida a 562 nm por um leitor de ELISA após dissolução das células coradas com ácido acético a 10%. Os ensaios foram realizados em triplicado.

ensaio de migração

A migração celular foi avaliada utilizando um ensaio de quimiotaxia disponíveis comercialmente. Resumidamente, as células foram incubadas em meio isento de soro RPMI durante 24 mão foram deixadas não tratadas ou tratadas com as doses indicadas de sorafenib, após o que foram destacadas dos frascos, suspensas em meio de extinção (meio isento de soro contendo 5% de albumina de soro de bovino) e EDTA, e semeados em Boyden insertos de câmara de migração colocados numa placa de 24 poços. As pastilhas contêm uma membrana microporosa, com um tamanho de poro de 8 um. Inserções foram colocados sobre os poços contendo meio isento de soro, mais quimio-atractor (10% de FBS). Depois de um período de tratamento de 48 h, células /meios foram descartados a partir do lado de topo do inserto câmara de migração e a câmara foi colocada nos poços de uma nova placa de 24 poços contendo a solução de separação celular. A seguir à incubação durante 30 min a 37 ° C, a inserção foi descartado, e uma solução de tampão de lise e corante CyQUANT GR foi adicionado a cada poço. CyQUANT é um corante fluorescente verde, que exibe uma forte aumento da fluorescência quando ligados a ácidos nucleicos celulares libertados por o tampão de lise, permitindo a avaliação do número relativo de células que migraram. A fluorescência foi determinada com um fluorímetro a 480/520 nm. Os ensaios foram realizados em triplicado.

Crescimento em agar mole

As células (10

4 células /cavidade) foram suspensos em 0,5 mL de 0,3% de agar Noble Difco (Difco, Detroit, MI) suplementado com meio de cultura completo. Esta suspensão foi colocado em camadas sobre 0,5 ml de camada de base de agar médio de 0,8% em 24 pratos de clusters de poços múltiplos (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) e tratado com diferentes concentrações de sorafenib. Após 14 dias, as células foram coradas com azul nitro de tetrazólio (Sigma, St. Louis, MO) e as colónias maiores do que 0,05 mm foram contados.