Abstract

Câncer e tratamentos podem induzir alterações cognitivas em pacientes com câncer, eo nexo de causalidade entre quimioterapia e cognitivas disfunções foi recentemente validado em modelos animais. Novos de câncer de terapias direcionadas tornaram-se amplamente utilizada, e seu impacto sobre as funções cerebrais e qualidade de vida precisa ser explorado. Avaliou-se o impacto do everolimus, um agente anticancerígeno de segmentação da via mTOR, em funções cognitivas, metabolismo cerebral, e proliferação de células do hipocampo /densidade vascular em ratinhos. ratos adultos receberam everolimus por dia durante 2 semanas, e os testes de comportamento foram realizadas a partir de 1 semana após o último tratamento. ratinhos tratados com everolimus exibida uma acentuada redução no ganho de peso após o último dia do período de tratamento.

Ex vivo

análise mostrou alterado atividade citocromo-oxidase em regiões cerebrais seletivos envolvidos no balanço energético, ingestão de alimentos, recompensa, aprendizado e modulação da memória, a regulação do ciclo sono /vigília e excitação. Como a quimioterapia, everolimus não alterou performances reactividade, aprendizagem e memória emocional, mas em contraste com quimioterapia, não afetou a flexibilidade comportamental ou reatividade a novidade.

In vivo

proliferação de células neurais do hipocampo e densidade vascular também não foram alteradas após os tratamentos everolimus. Em conclusão, o tratamento everolimus duas semanas diariamente na dose clínica não provocou alteração dos desempenhos cognitivos avaliadas em tarefas hippocampal- pré-frontal e dependente do córtex que persistem em uma a quatro semanas após o final da conclusão do tratamento. No entanto, o tratamento everolimus aguda causada modificações CO seletivos sem alterar a quinase mTOR efetoras p70S6 em regiões cerebrais envolvidas no comportamento de alimentação e /ou o ciclo sono /vigília, pelo menos em parte sob o controle do núcleo solitário e região parasubthalamic do hipotálamo. Assim, esta área pode representar um alvo chave para modificações periféricas-mediar everolimus, que foi previamente associados com sintomas como perda de peso e fadiga

Citation:. Dubois M, Le Joncour V, Tonon MC, Anouar Y , Proust F, F Morin, et ai. (2014) Avaliação do Impacto do Cancer Therapy Everolimus sobre o sistema nervoso central em ratos. PLoS ONE 9 (12): e113533. doi: 10.1371 /journal.pone.0113533

Autor: David L. McCormick, Instituto de Pesquisa IIT, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Abril, 2014; Aceito: 24 de outubro de 2014; Publicação: 01 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Dubois et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Roue, Inserm e do centro da Baclesse receber um subsídio pela Novartis (Novartis) 071160-001141-05. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e ter o seguinte conflito: a subvenção ao baclesse centro de Caen, na França, pela Novartis (Novartis- 071160-31 001141-05) foi uma concessão educacional geral e foi usado para apoiar um pós-doc que conduz a pesquisa sobre everolimus. Além disso, os autores receberam everolimus e a microemulsão através de um MTA com a Novartis. Pr Florence Joly é um membro de um conselho científico consulta da Novartis. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Embora o surgimento de agentes anticancerígenos potentes melhorou a sobrevida do paciente, há cada vez mais evidências de que o câncer e seus tratamentos podem induzir disfunções cognitivas que afetam a qualidade de vida diária. Os pacientes que receberam a atenção relatório de quimioterapia e alterações de concentração, déficit de memória visual e verbal, e o retardamento do processamento psicomotor (referido como “chemofog” ou “chemobrain”), que podem persistir por vários anos após o término do tratamento [1]. Nos últimos anos, os agentes alvejados foram cada vez mais utilizados no tratamento do cancro, e relatórios anteriores sugerem que alguns deles podem permear a barreira sangue-cérebro e actuam directamente no cérebro, que afecta a angiogénese cerebral e em funcionamento [2]. Consistente com esta hipótese, a administração de bevacizumab em pacientes com câncer colorretal metastático e sunitinib em pacientes com câncer renal metastático resultou em vários casos de leucoencefalopatia posterior relatado [3], [4]. Além disso, uma fadiga inexplicável ou astenia, associado a tratamentos de câncer específicas, que não pode ser contrariado pelo descanso ou sono pode afetar gravemente as funções cognitivas e qualidade de vida [5].

A fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K ) /AKT /target da rapamicina em mamíferos (mTOR) cascata de sinalização é um alvo molecular chave para o tratamento do câncer [6]. componentes de sinalização mTOR são expressos em níveis elevados em várias áreas do cérebro [7], [8], e a via mTOR é conhecido por estar envolvido em vários processos neurobiological, incluindo o crescimento de neurites [9], axónio regeneração [10], a mielinização [11], e o metabolismo celular [12]. Em particular, a mTOR tem sido mostrado para ser um regulador central do crescimento celular e é controlado por um grande número de sinais incluindo nutrientes tais como glucose e aminoácidos, e factores de crescimento tais como insulina e IGF-1. activação de mTOR também estimula a síntese de proteínas e hipertrofia celular em várias células e órgãos. Além disso, a activação mTOR está envolvida na plasticidade sináptica do hipocampo e de aprendizagem e memória

via síntese de proteínas [13]. Por exemplo, a inibição da actividade da mTOR por rapamicina foi mostrado para bloquear evitação inibidora da memória a longo prazo [14] e de prejudicar auditivo [15], o medo [16], [17], e a consolidação da memória espacial [18]. Além disso, defeitos genéticos em Ras /Erk /PI3K /vias de sinalização mTOR pode ser causalmente associada a várias doenças genéticas humanas classificadas como síndromes neuro-cardio-facial-cutâneas e hamartoma, e, portanto, pode ser responsável por alterações cognitivas [19]. Assim, ele pode ser proposto que a administração a longo prazo de inibidores de mTOR ocorrendo no tratamento do câncer pode afetar as funções cerebrais envolvidos na cognição e /ou metabolismo.

Everolimus (Afinitor, Novartis, Basel, Suíça), um administrado por via oral derivado de rapamicina, directamente bloqueia a actividade de quinase do complexo de rapina /mTOR (mTORC1)

através de ligação a FKBP-12 e formando assim um complexo inibidor de mTOR com [20]. Este tipo de inibidor de mTOR está bem caracterizado para propriedades anti-neoplásicas,

ou seja

induzir diminuição do crescimento das células do tumor, proliferação e angiogênese

in vitro

e

in vivo

[ ,,,0],21] – [23]. No entanto, os efeitos secundários em geral, incluindo fadiga, edema, astenia, pirexia, inflamação da mucosa, a anorexia, perda de peso e dor foram relatados [24] – [27]. Mais especificamente, no sistema nervoso central (SNC) os efeitos secundários, incluindo dor de cabeça /enxaqueca ou disgeusia, também têm sido descritos [26].

O objectivo do estudo foi avaliar o potencial de funcionamento cognitivo-incapacitação susceptível de ser induzido por terapias específicas, tais como everolimus usando um modelo comportamental do rato validado [28]. Nós particularmente ganhou atenção na dose utilizada, a fim de ser tanto quanto possível nas condições de tratamento do paciente de cancro. De facto, com base em estudos farmacocinéticos /dinâmicos [29] – [31], o mais adaptado e indicado dose na hormona avançado positivo ao receptor, cancro HER2-negativos da mama, tumores neuroendócrinos avançados de origem pancreática, carcinoma das células renais, Angiomiolipomas renais com complexo esclerose tuberosa (TSC) é de 10 mg /dia, mas, em caso de toxicidade, a dose sugerida é de 5 mg /dia. Além disso, um número de estudos foram realizados em modelos animais com este 5 mg /administração diariamente [22], [32], [33] e os estudos demonstraram que esta dose everolimus é activo por via oral em ratos e que o estado estacionário alcançado dentro de duas semanas com a dosagem diária [22]. Este 5 mg /kg /d programação parece ser a concentração mínima para a dose máxima eficaz, sem toxicidade aparente.

Os potenciais efeitos de longa duração de tratamento everolimus em ratos cognição e processos neurobiological foram avaliados usando hippocampal- e frontal tarefas comportamentais e sobre a proliferação de células do hipocampo, ou nicho densidade vascular, respectivamente, dependentes de córtex. O seu impacto agudo sobre a atividade das células neurais foi investigada

ex vivo via

avaliação da actividade do citocromo-oxidase cerebral regional.

Material e Métodos

Animais e declarações éticas

ratinhos machos C57BL /6J Rj (Janvier, Le Genest St Isle, França) de 7 semanas de idade foram alojados sob condições ambientais controladas padrão: 22 ± 1 ° C; 5 animais por gaiola; 12 horas /12 horas ciclo claro /escuro (luz acesa 00:00); água e alimentos disponíveis

ad libitum

. Durante o período de 2 semanas de adaptação, os animais foram tratados diariamente para o monitoramento de peso. administração O tratamento começou quando os ratos foram 9 semanas de idade. Os ratinhos foram pesados ​​diariamente a partir do dia da primeira ingestão de tratamento até ao dia 36 após a última administração. O peso dos animais antes da primeira injecção (D0) foi utilizada como o valor de base para calcular o ganho de peso ao longo da experiência. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Comissão de Ética francês, bem como as orientações da directiva do Parlamento Europeu 2010/63 /UE e do Conselho para a Protecção dos Animais utilizados para fins científicos. Este projeto foi aprovado pela CENOMEXA “Comité d’Ethique Normandie em Matéria de Experimentação Animal” no âmbito da Comissão Nacional de Experimentação Animal, e recebeu o seguinte número N /12-11-12 /35 /11-17. manipulações animais foram realizados sob a supervisão de um investigador autorizado (H. Castel;. autorização sem 76.98 do Ministère de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche)

A administração do medicamento

.

Uma microemulsão de everolimus formulado a 2% (w /v), fornecida por Novartis (Rueil-Malmaison, França), foi dissolvido em NaCl a 0,9% e administradas diariamente por sonda esofágica oral (5 mL /kg)

através

uma agulha de alimentação (Ferramentas ciência Fine, Heidelberg, Alemanha), 5 mg /kg durante 14 dias consecutivos [34].

atividade citocromo-oxidase e metabolismo cerebral

Os ratos que receberam veículo (

N

= 8) ou everolimus (

N

= 9) durante 2 semanas foram sacrificados imediatamente após o último dia de tratamento para estudar a actividade da oxidase do citocromo em diferentes regiões cerebrais. Os ratinhos foram anestesiados utilizando isofluorano, decapitados, e os seus cérebros rapidamente removidos 24 horas após o último dia de tratamento, congelados em 2-metilbutano (Sigma-Aldrich, San Quentin Fallavier-, França) a -30 ° C e armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. secções de criostato, cada 30 um de espessura, foram cortados a partir da bregma +3.20 mm a -6,48 mm e armazenado a -20 ° C até processamento. Para cada animal, 8 lotes de 41 fatias consecutivos foram tomadas, tais como em uma corrediça 2 secções foram separados por 240 um.

todas as fatias de cérebro de um lote por animal foram processados ​​simultaneamente sob as mesmas condições. O protocolo foi adaptado a partir de publicações anteriores [35], [36]. As secções foram incubadas no escuro (37 ° C, 50 minutos) em solução salina 0,1 M tamponada com fosfato (PBS) contendo 120 mg de cavalo-coração citocromo C, 24 g de sacarose, 300 mg de DAB-4-HCl, e 108 mg de catalase ( Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, França) por 540 ml. As fatias foram lavadas (5 min) com tampão frio (10% de sacarose em PBS), durante 30 minutos, imersas em solução de formalina /tampão de 10%, e lavou-se duas vezes (5 minutos) em tampão antes da desidratação. Os cortes foram em seguida, cubra-escorregou com Eukitt (VWR International, Estrasburgo, França) e microscopicamente examinado.

O produto da reação histoquímica (DAB oxidada) era visível por microscopia óptica. Em cada zona de interesse, a sua intensidade de coloração foi medida por análise densitométrica por meio de uma estação de trabalho de análise de imagem assistida por computador (SAMBA Technologies, Meylan, França) [37]. Para cada área de estudo, foram utilizados um mínimo de 2 fatias por animal, dependendo do comprimento anteroposterior da região, com as medidas feitas bilateralmente, quando possível. O fundo foi subtraída para cada slide. As regiões cerebrais diferentes foram identificados por meio dos Franklin e Paxinos [38] atlas do cérebro do rato.

teste comportamental

No total, 14 ratos receberam tratamento everolimus e 12 ratos receberam apenas solvente (veículo grupo) durante 2 semanas. teste comportamental começaram 7 dias após a última administração de tratamento e durou 23 dias (Fig. S3A). Todas as experiências foram conduzidas 13:00-18:00, durante o início da fase activa dos animais.

funções cognitivas foram avaliadas usando o labirinto de água de Morris, em que ratinhos são necessários para escapar de uma bacia de água por encontrar uma plataforma colocada na piscina [39]. Um tanque cilíndrico (diâmetro 93 cm, altura 45 cm) foi preenchida com água (mantido a 23 ± 1 ° C) para uma altura de 40 cm, tornado opaco com emulsão branca, inerte, aquoso acrílico (Accusol OP 301, Ponto de Vista, França ). O tanque foi colocado num quarto iluminado (50 lux na superfície central da piscina) com pistas extra-labirinto nas paredes. O labirinto de água foi dividida em quatro quadrantes virtuais: Noroeste (NW), Nordeste, Sudeste e Sudoeste, e animais comportamentos foram rastreados de vídeo. No dia 1, os animais estavam familiarizados com a piscina e as suas capacidades de motivação e visuo-motoras avaliadas. Uma plataforma de escape (diâmetro 9,7 cm) foi colocado no centro do tanque, emergindo a 1 cm acima da superfície da água e com uma pequena bola preta fixado nele, a fim de facilitar a sua visualização por parte dos animais. Os ratinhos foram colocados na plataforma durante 20 segundos. Imediatamente a seguir, 1 sessão compreendendo quatro ensaios de 60 segundos (o intervalo inter-julgamento: 30 minutos) ter sido realizada. Os animais foram colocados, de frente para a parede, em 1 de 4 locais de começo (norte, sul, leste ou oeste) e autorizados a nadar para a plataforma visível para um máximo de 60 segundos. Ratos não encontrar a plataforma foram colocados manualmente em cima dele por 20 segundos. Nos dias 2-5, capacidades de aprendizagem espaciais foram avaliadas em uma fase de treinamento de 4 ensaios diários, no máximo, 60 segundos cada, em que a plataforma de fuga foi colocado no quadrante NW, imerso 1 cm abaixo da superfície da água. 2 horas após o ensaio final do último dia do período de formação, uma sonda de teste foi realizado através da remoção da plataforma e permitindo que os animais a nadar, durante 60 segundos, com o tempo gasto no quadrante correcto anteriormente (NW) medido. habilidades memória espacial foram avaliados em uma fase de recuperação no dia 10, utilizando uma única sessão de 4 ensaios sob as mesmas condições que a fase de formação. Aprender plasticidade foi avaliada em uma fase de transferência durante 4 dias sucessivos (4 ensaios /dia, no máximo de 60 segundos cada) por diária mudando a localização plataforma escondida. Distância cruzados e escapar de latência foram medidos.

proliferação de células do hipocampo, densidade vascular e fosforilada p70S6 quinase imunomarcação

5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) células marcado com dentro e fora da zona de subgranular do hipocampo (SGZ) foram contadas. Para rotular células geradas por adultos no giro denteado do hipocampo, 6 injecções intraperitoneais (50 mg /kg) de BrdU (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, França) foram administradas durante os últimos dias do período de tratamento em não ratos submetidos a avaliação comportamental (Fig. S3C). No dia seguinte ao da última administração por sonda, e 3 horas após a injecção de pós-BrdU, os ratinhos foram anestesiados utilizando isofluorano, decapitados, e os seus cérebros rapidamente removidos, congelados em 2-metilbutano (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, França) a -30 ° C e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Os cérebros foram cortadas com um crióstato em secções coronais em série (espessura 20 um) a partir da parte anterior do hipocampo dorsal (anteroposterior, 1,20 mm a partir da bregma -1,44 mm). Cada secção 12, cada um separado por 240 um, foi montadas em lâminas revestidas com alúmen de gelatina-cromo e armazenados a -20 ° C até processamento.

Seis secções do hipocampo a partir de cada um dos 4 animais por grupo foram corados simultaneamente para visualização BrdU. (2N HCl fatias de cérebro foram fixados (4% de paraformaldeído em PBS, lavadas 3 × 5 minutos, com PBS, pH 7,4, e incubou-se; 45 ° C; 45 minutos) para desnaturar o ADN As secções foram então lavadas (PBS, 3 × 5 minutos). , incubadas durante 1 hora em solução contendo 1:50 soro normal de burro, 1% de albumina de soro bovino e 0,3% de Triton X-100 (VWR International, Estrasburgo, França) em PBS, de bloqueio e incubadas durante a noite a 4 ° C com anti ovelhas -BrdU imunoglobulina G. (IgG; Abcam, Paris, França), 1:400 em solução de bloqueio Subsequentemente, as secções foram lavadas (PBS, 4 × 5 minutos) e incubadas (2 horas, temperatura ambiente) com Alexa 488-conjugado de burro anti -sheep IgG (Invitrogen, Boulogne-Billancourt, França), 1:400 em PBS. seções enxaguados foram tampa escorregou com Mowiol. As secções foram examinadas em um microscópio Nikon Eclipse E600 (Nikon Instrumento, Champigny-sur-Marne, França) interface com o software Mercator (ExploraNova, La Rochelle, França). Um método modificado estereologia imparcial foi usado para contar as células positivas para BrdU no SGZ do giro denteado e da área fora da SGZ [40], [41]. O número de células coradas em 6 secções foi contado bilateralmente, e, como cada secção 12 foi usado, este número foi multiplicado por 12. Todas as contagens foram feitas por um investigador cego para o grupo de tratamento.

Para a investigação de hipocampo nicho densidade vascular, secções do cérebro foram fixadas, lavadas, e incubadas como descrito acima. O anticorpo primário foi anti-coelho IQGAP1 (H-109) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Tebu-bio, Le-Perray-en-Yvelines, França) diluído em solução de bloqueio 1:400, e o anticorpo secundário era Alexa 488 -conjugated burro anti-IgG de coelho a 1:400 em PBS. As secções foram contra-coradas com DAPI marcador nuclear (1 ug /ml). Imunofluorescência foi observado sob um microscópio confocal e estruturas IQGAP1-rotulados na SGZ avaliada em 3 seções separadas por 240 mm (entre bregma -1,68 mm e -2,16 mm).

Para investigar as formas ativas (fosforilada) de p70S6 cinase (p-p70S6K), secções do cérebro de veículo e ratos tratados com everolimus foram fixadas, lavadas, e a expressão de p-p70S6K foi medida por meio do anticorpo primário-p-p70S6K anti (Abcam ab60948, Paris, França) diluído 1:200 em solução de bloqueio, e o anticorpo secundário era anti-IgG Alexa coelho de burro conjugado 488 em 1:400 em solução de bloqueio. estruturas P-p70S6K-marcadas foram avaliadas em 2 ou 3 secções separadas por 240 uM (entre bregma -0,98 mm e -1.70 mm de arco, Re, Rh, submed, VM; entre -1,22 e -1,94 mm mm para PE, etc. e PRH;. entre -2,06 mm e -2.54 mm para PSTh) com Nikon Eclipse E600 microscópio Nikon (Instrumento, Champigny-sur-Marne, França) interface com o software de imagem NIS-Elements

Cultura do tronco neurais células e células endoteliais

Para a cultura de células-tronco neurais (NSC), cérebro de ratos recém-nascidos C57BL /6J Rj foram lavadas em tripsina. A suspensão de células foi centrifugado a 100 g durante 4 minutos, e as células foram colocadas em meio fresco isento de soro. Este meio consistia de Neurobasal (100 mL, Gibco, Saint-Aubin, França) suplementado com 5 mM de tampão HEPES (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, França), 1 mL de B27 e um suplemento de crescimento mL N2 (Gibco), 20 uL factor de crescimento epidérmico (20 ng /mL; Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, França), 10 ul de factor de crescimento de fibroblastos básico (10 ng /mL; Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, França), e 7,32 mL de heparina (Sigma- Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, França) e adicionou-se com glucose 33 mM. As células foram colocadas em placas a uma densidade de 100 células viáveis ​​por microlitro neste meio e foram cultivadas em 25 cm

2 frascos a 37 ° C em 5% de CO

2-95% incubadora de ar humidificado. No dia 7, neuroesferas bem desenvolvidas foram recolhidas e digerida em tripsina durante 10 minutos a 37 ° C. neuroesferas secundárias (

1 P) e posteriores passagens foram gerados por dissociação mecânica e enzimática de neurospheres primários. As células foram em seguida incubadas na ausência ou na presença de veículo ou everolimus, durante 24 a 48 horas. Usando um objectivo de uma Nikon (Nikon Eclipse TS100, Kingston, Inglaterra) microscópio invertido 4 ×, medimos o diâmetro médio de 20 neuroesferas escolhidos aleatoriamente por poço ( 40 um de diâmetro) no campo visual em 4 diferentes áreas de três poços de placas de cultura de 24 cavidades.

Para a cultura de células endoteliais, foi utilizado o antigénio de tumor de tamanho médio vírus polioma (mT) A linha de células endoteliais capilares de cérebro de ratinho -transformed (bEnd.3, obtida a partir de Dr. D. Gorecki , Universidade de Portsmouth, Inglaterra). As células foram cultivadas em elevado teor de glucose (4,5 g /L) molecular contendo de Dulbecco modificado por meio Eagle suplementado com 1,5 g /L de bicarbonato de sódio, 100 U /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina, e 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C com 5% de CO

2. Para determinar a sobrevivência e proliferação das células, as células foram plaqueadas em triplicado em vários conjuntos de placas de cultura de 12 poços. A incubação ± veículo /everolimus por 24-48 horas estava em meio FBS-free. A proliferação celular foi quantificada pela contagem eletronicamente o número de células (Z2, Beckman Coulter, Villepinte, França).

A análise estatística

ganho de peso e de aprendizagem espacial performances foram analisados ​​por 3 maneiras ANOVA com repetidos medições seguidas por menor diferença significativa (LSD) post hoc análises quando eles eram necessários. Para o teste sonda do labirinto de água de Morris, o tempo despendido no quadrante onde a plataforma foi localizada foi comparada com a prevista por acaso, por meio de χ

2 testes. Outros dados comportamentais, imuno-histoquímica e dados de atividade do citocromo-oxidase foram analisados ​​com o estudante

t

testes. Estes dados foram analisados ​​com Statistica © 5.1. Dados da proliferação das células do hipocampo e dados dos estudos de cultura foram analisados ​​com o teste não paramétrico Mann-Whitney U-teste e análise de variância de Kruskal-Wallis seguido por testes de Dunn com GraphPad Prism 5. Para todos os testes estatísticos, o limiar de significância foi estabelecido em

p

≤.05.

resultados

Everolimus induzida por alterações de ganho de peso

o primeiro avaliou as consequências de uma inibição de mTOR crônica no peso corporal em ratos. A administração de everolimus (5 mg /kg) diariamente para jovens ratinhos por sonda durante 2 semanas produziu nenhuma morbidade e /ou mortalidade aparente. Considerando que o grupo de controle (emulsão) continuaram a ganhar peso ao longo do experimento, os ratos tratados com everolimus tinha reduzido peso (tratamento × interação dia: F

23.552 = 8,29,

p

. 001) a partir do dia 17rd após a introdução do inibidor de mTOR, e continuou a pesar menos durante todo o período experimental que se segue (post hoc LSD

P

0,01;. a Fig. 1)

o peso corporal dos murganhos com veículo e tratados com everolimus foi avaliada a longo prazo após o final do período de tratamento (barra cinza). Camundongos receberam veículo ou everolimus uma vez por dia durante 14 dias contínuos. As barras representam o erro padrão da média. ANOVA, interação Tratamento x Dia

p Art 0,001 seguido por LSD post hoc: **

p Art 0,01, ***

p

. 001.

impacto de curto prazo do everolimus sobre a atividade do citocromo-oxidase cerebral e p70S6 quinase phosphotylated forma

a fim de avaliar o impacto do inibidor de mTOR no metabolismo celular cerebral, a histoquímica análise revelar actividade de oxidase do citocromo foi realizada em fatias de cérebro de controlo e ratos tratados (Tabela 1). Em ratinhos tratados com everolimus, 4 dias após o final do período de tratamento, uma diminuição significativa (

P

0,05) da actividade do citocromo-oxidase estava presente na parte de invólucro do núcleo accumbens (t

13 = 2,52), o córtex prelimbic (t

15 = 2,20), a área pré-óptica lateral (t

14 = 2,33) e do núcleo do trigémeo do motor (T

13 = 2,38). Além disso, o tratamento everolimus resultou num aumento da actividade metabólica no córtex ectorhinal (t

14 = -2,61), o núcleo entopeduncular (t

13 = -2,27), o núcleo parasubthalamic do hipotálamo (t

14 = -2,91), o núcleo solitário (t

13 = -2,49), e nas reuniens talâmicos (t

14 = -2,48), rombóide (t

14 = -2,31), submedius (t

14 = -2,30), e ventromedial (t

14 = -2,56) núcleos (todas

P

0,05) (Fig 2A e Tabela 1).. De modo a investigar o potencial de inibição directa ou indirecta da mTOR nestas áreas do cérebro, a actividade de um efector a jusante da via mTOR foi avaliada por níveis imunologicamente revelada da fosfo-p70S6 cinase (p-p70S6K) em várias áreas do cérebro exibindo ou não CO alterações metabólicas. O tratamento não modificou de forma significativa rotulagem p70S6K-positiva no córtex ectorhinal, núcleo entopeduncular, reuniens, romboide, núcleos talâmicos ventromedial e submedial e o núcleo parasubthalamic exibindo actividades co modificados, bem como no córtex perirrinal e arqueada núcleo hipotalâmico não apresentando alterações em actividades de CO (Fig. 2B e C).

(a) a actividade de CO em zonas com veículo e tratados com everolimus selectivos cerebrais ratos. (B) Imagens representativas de Phospho-p70S6K (p-p70S6K) imunomarcação no córtex, o núcleo entopeduncular, tálamo e hipotálamo de veículo ou camundongos tratados com everolimus. (C) percentagem média de superfície P-p70S6K-rotulado (normalizados ao veículo) (± SEM) nas diferentes áreas do cérebro. Arc: núcleo arqueado; Ect: córtex ectorhinal; EP: núcleo entopeduncular; PRH: córtex perirhinal; PSTh: núcleo parasubthalamic; Re: reuniens núcleo talâmico; Rh: núcleo talâmico losango; Submed: núcleo talâmico submedial; VM:. Ventromedial nuleus tálamo

Nenhuma alteração emocional e cognitivo após o tratamento everolimus

comportamento emocional

Sete dias após o final do período de tratamento. , a percentagem de entradas de braço aberto do labirinto em cruz elevado (Veja material e Métodos S1) não foi significativamente diferente entre os 2 grupos de tratamento, sugerindo que everolimus não afetou o comportamento de ansiedade-like (t

24 = 1,66,

p Art 0,05; Fig. S1A). No teste de natação forçada, a duração de imobilidade não foi estatisticamente diferente entre os grupos, indicando que everolimus não modificar o comportamento depressivo-like (t

24 = 0,65,

p Art 0,05; Fig. S1B ).

aprendizagem espacial ea memória.

Durante a fase de familiarização do teste do labirinto aquático de Morris, velocidade de natação (t

24 = -0,69,

p

.05; não mostrado), a distância transversal (T

24 = 0,49,

P

0,05; não mostrado) e o tempo necessário para encontrar a plataforma emergiu (t

24 = 0,93 ,

p Art 0,05; A Fig. 3A) não foram significativamente modificados por tratamento, indicando que a motivação e visuo-motora capacidade não foram afectadas pela everolimus. Durante a fase de aquisição, everolimus não alterou o desempenho de aprendizagem espacial de 15 dias após o final do período de tratamento, como a latência de escape (F

1,24 = 0,94,

P

0,05; Fig . 3B) e distância cruzados (F

1,24 = 0,32,

p Art 0,05; A Fig. 3C) não foram significativamente diferentes entre os grupos. Performances melhorou significativamente como o teste foi repetido (escapar latência F

3,72 = 18,38,

p Art 0,001 e distância cruzou F

3,72 = 19,51,

p

0,001). Durante o teste sonda, todos os ratinhos gastou muito mais tempo no quadrante anteriormente correta do que o previsto por acaso (veículo: X

2

11 = 117,67,

p Art 0,001; everolimus: X

2

13 = 231,80,

p Art 0,001; A Fig. 3D). Durante a fase de recuperação, os ratos tratados com everolimus não apresentam comprometimento desempenho da memória espacial, como a latência de escape (t

24 = 0,49,

p Art 0,05; A Fig. 3B) e distância cruzados ( t

24 = 0,40,

p Art 0,05; A Fig. 3C) não diferiu significativamente dos ratinhos veículos

() Motivação e visuo-motoras habilidades A depois. veículo ou tratamento everolimus (Student

t

teste,

p Art 0,05). (B e C) Durante o treinamento e recuperação (R) fases, a latência (B) e distância cruzada (C) depois do veículo ou tratamento everolimus (efeito ANOVA, Dia ***

p Art 0,001) . (D) durante o teste sonda, tempo gasto pelos animais de ambos os grupos no quadrante onde a plataforma foi localizado durante a fase de formação (χ

2, ***

p Art 001

vs

acaso). Durante a fase de transferência, escapar latência (E), a distância atravessada (F) e velocidade de natação (G) em ratos com veículo ou tratados com everolimus (efeito ANOVA, Tratamento *

p Art 0,05, Julgamento efeito ***

p Art 0,001 seguido por LSD post hoc

##

p Art 0,01). (H) Durante o primeiro dia da fase de transferência, o tempo gasto no quadrante noroeste anteriormente correta depois veículo ou everolimus tratamento (Student

t

teste,

p Art 0,05). Os dados são médias + SEM

Durante a fase de transferência do teste do labirinto aquático de Morris, animais melhoraram suas performances em todos os ensaios (latência de escape:. F

3,72 = 9,76,

p Art 0,001; distância cruzou F

3,72 = 14,99,

p Art 0,001;. Figuras 3E e 3F). Aprender plasticidade, avaliada pela alteração diária da localização da plataforma, não foi afectada pelo tratamento; escapar de latência antes de encontrar a plataforma escondida foi semelhante entre os grupos (F

1,24 = 3,36,

p Art 0,05; Fig. 3E). No entanto, a distância atravessada por ratinhos tratados com everolimus foi significativamente aumentada em comparação com os ratos de veículo (F

1,24 = 6,08,

P

0,05; Fig. 3F). avaliação ANOVA revelou um tratamento significativo × interação julgamento em termos de velocidade de natação (F

3,72 = 3,69,

p Art 0,05). LSD post hoc análises indicaram que os ratos tratados com everolimus nadou mais rápido do que os ratos dos veículos durante o primeiro e terceiro ensaios (

p Art 0,01; Fig. 3G). Durante o dia 1 da fase de transferência, everolimus não alterou o tempo gasto no quadrante que foi correta durante a fase de treinamento (t

24 = -0,39,

p Art 0,05; Fig. 3H ), sugerindo a ausência de perseveração comportamental.

atividade espontânea e memória de reconhecimento.

Everolimus não modificou locomotora espontânea e atividades verticais. A distância cruzou eo número inclinando-se não foram significativamente diferentes entre os grupos de tratamento (t

24 = 0,63,

p Art 0,05 e t

24 = 0,39,

p

0,05, respectivamente;. As Figs S1C e S1D). No teste de reconhecimento de objetos, animais de ambos os grupos detectados novidade, com períodos mais longos de exploração da novela objeto

vs

os familiares (veículo: t

11 = -2,90,

p

0,05; everolimus: t

13 = -4,51,

p Art 0,001; Fig S1E).. Como mostrado na Fig. FIG.