Abstract

Fundo

No câncer de próstata, os genes que codificam regulada por androgénio, cromossomo Y antigénios codificado pelo, e específicos de tecidos podem todos ser sobre-expresso. No hospedeiro adulto macho, no entanto, a maioria das células T de elevada afinidade de segmentação destes potenciais antigénios de rejeição de tumor vai ser removida durante a selecção negativa. Em contraste, o repertório de células T fêmea madura deve conter precursores abundantes capazes de reconhecer essas classes de antígenos de câncer de próstata e mediando as respostas imunes anti-tumorais eficazes.

Metodologia /Principais Achados

Encontramos que as células de adenocarcinoma da próstata TRAMP-C2 sing�icos são espontaneamente rejeitado em hospedeiros do sexo feminino. A transferência adoptiva de linfócitos fêmeas virgens de hospedeiros machos irradiados rolamento células tumorais TRAMP-C2 pré-implantado retarda o crescimento do tumor e medeia a rejeição do tumor em alguns animais. O sucesso desta transferência adoptiva foi dependente da transferência das células T CD4 do sexo feminino e independente da presença de células T reguladoras que expressam CD25 nos linfócitos transferidos. Identificamos em células femininas CD4 T estimuladas com TRAMP-C2 uma resposta dominante MHC II restrita ao antígeno DBY cromossomo Y. Além disso, as respostas de células T CD8 em linfócitos do sexo feminino para as imunodominantes SPAS-1 antígeno MHC I-restrito aumentaram acentuadamente em comparação com camundongos machos. Finalmente, nós não encontramos nenhuma exacerbação de doença do enxerto-versus-hospedeiro em modelos de transferência, quer sing�icos ou menor antígeno-incompatíveis linfócitos alogénicos adotivos usando fêmea em macho contra macho em células masculinas.

Conclusões /Significado

Este estudo mostra que os linfócitos do sexo feminino adoptively transferidos, particularmente células T CD4, pode controlar o crescimento de células de adenocarcinoma da próstata pré-implantado. Esta abordagem não piorar significativamente as respostas de enxerto-versus-hospedeiro sugerindo que pode ser viável na prática clínica. Além disso, aumentando o repertório imunológico disponível com células T derivadas do sexo feminino pode proporcionar um excelente conjunto de células T reativas de câncer de próstata para posterior aumento pela combinação com estratégias de bloqueio reguladoras imunes vacinação ou

Citation:. Jenq RR, Curran MA, Goldberg GL, Liu C, Allison JP, van den Brink MRM (2012) Repertório Enhancement com adotivamente Transferido Feminino linfócitos controla o crescimento de pré-implante murino do cancro da próstata. PLoS ONE 7 (4): e35222. doi: 10.1371 /journal.pone.0035222

editor: Jonathan Powell, Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Janeiro, 2012; Aceito: 13 de março de 2012; Publicação: 06 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Jenq et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo National Institutes of números de atribuição de Saúde R01-HL069929 (MvdB), R01-CA107096 (MvdB), R01-AI080455 (MvdB). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. O suporte também foi recebido do Departamento de Estados Unidos da Defesa: USAMRAA Award W81XWH-09-1-0294 (MvdB), a Fundação Efeitos de Radiação Research (RERF-NIAID) (MvdB), The Experimental Therapeutics Centro do Memorial Sloan-Kettering Cancer Center financiada pelo Sr. William H. Goodwin e Sra Alice Goodwin, a Fundação linfoma, stand Alex Lemonade, The Cancer Research Center Geoffrey Beene no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, O Fundo Solomon Peter, Programa de Pesquisa e Terapêutica em Câncer de próstata. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar de melhorias na detecção e tratamento, o cancro da próstata (PAC) continua a ser a segunda principal causa de morte por câncer em homens nos Estados Unidos e o segundo câncer mais comum em homens em todo o mundo. Quando localizada, PAC é curável através de terapias de primeira linha, como a prostatectomia. existem poucas terapias curativas, no entanto, por recorrente ou CaP metastático. Recentemente, sipuleucel-T, uma vacina concebida para induzir uma resposta imunitária contra a fosfatase ácida prostática, foi mostrado para melhorar a sobrevivência mediana de pacientes com CaP metastático resistente à castração [1]. O bloqueio da molécula reguladora imunitária CTLA-4 também demonstrou promessa clínica para o cancro da próstata [2], [3]. Desenvolvimento de intervenções de imunoterapia que têm como alvo vários aspectos do sistema imunológico em Cap podem oferecer maior benefício clínico e respostas mais duráveis. Desenvolvimento de intervenções de imunoterapia que têm como alvo vários antígenos em Cap podem oferecer maior benefício clínico e respostas mais duráveis.

cancros da próstata provável expressar uma constelação de potenciais antígenos tumorais incluindo a auto-proteínas mutadas [4], andrógeno-responsive overexpressed e proteínas reguladas de androgénios [5], [6], e as proteínas ligadas Y-específicos de tecido e do sexo masculino diferencialmente expressos [7]. As células T em desenvolvimento em homens que reconhecem qualquer um destes antígenos relacionados andrógeno, ou do cromossomo Y com alta afinidade são provavelmente excluído durante a seleção negativa no timo. células de baixa afinidade T que escapam eliminação central são, por sua vez geralmente anergizadas através de mecanismos de tolerância periférica em cima posterior encontro antígeno. Em contraste, o repertório de células T fêmea madura deve conter uma ampla freqüência de precursores de células T capazes de reconhecer todas as classes acima de antígenos de câncer de próstata.

O transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (alo-transplante) é um meio de alterar repertório imunológico de um paciente e superar mecanismos reguladores imunológicos. programas de condicionamento quimioterapêuticos e /ou radiação rigorosos ablação sistema hematopoiético do hospedeiro, que é então reconstituído com medula óssea ou células estaminais mobilizadas a partir de um dador adequado. Estas células doadoras expandir-se no paciente dando origem a um novo sistema imunitário, o que pode reconhecer células malignas no paciente como no exterior de um processo denominado o efeito do enxerto contra o tumor (GVT) [8], [9]. GVT pode levar a remissão completa e duradoura em pacientes com cancros que não possa ser curado com quimioterapia ou radioterapia. Por esta razão, alo-transplante é amplamente utilizada no tratamento de uma variedade de doenças hematológicas.

Para além de mediar os efeitos desejáveis ​​GVT, células do sistema imunológico do doador pode também atacar os tecidos normais do hospedeiro, resultando em enxerto-versus-hospedeiro (GVHD). GVHD em ambas as formas aguda e crônica é uma importante fonte de morbidade e mortalidade em receptores de alo-transplante. Escolha de dador alogénico é conhecido para potencialmente impacto sobre o risco de desenvolvimento de DECH; destinatários do sexo masculino de enxertos do sexo feminino, por exemplo, têm um risco elevado de ambos GVHD aguda e crónica, particularmente aqueles com os doadores do sexo feminino que tenham sido submetidos a gravidezes múltiplas [10] – [12].

A transferência adoptiva de autólogo

ex vivo

expandido de células T específicas do tumor manipuladas tumor-infiltrantes ou tem potencial curativo mostrado tanto para melanoma metastático e leucemia linfóide crónica [13]. Estas abordagens, no entanto, requer uma considerável experiência e, muitas vezes semanas de cultura para expandir células T. Por transferência adoptiva de linfócitos fêmea singeneicos naive em ratos machos pré-implantados com tumores da próstata, procurou-se testar o potencial do repertório de células T a reconhecer e fêmea atacar PAC. Para melhorar a expansão dos adoptivamente células transferidas, bem como reduzir o risco de GVHD e potencialmente aumentar os efeitos GVT, tratámos ratinhos receptores com doses mieloablativo de radiação, dado relatórios anteriores que um estado quimérico misto pode promover respostas GVT, minimizando GVHD [14] , [15].

Resultados

Ratos fêmeas imunologicamente rejeitar TRAMP-C2 prostática adenocarcinoma Cells

na adenocarcinoma transgénico do rato modelo da próstata (TRAMP), tumores que se desenvolvem são inicialmente andrógeno-dependentes, mas mais tarde se tornaria independente de androgénios, recapitulando a progressão normal do câncer de próstata em seres humanos [16]. Para os nossos estudos, utilizou-se a linha de células TRAMP-C2 derivados de estes ratos. Estas células formam tumores transplantáveis ​​CaP quando implantadas em ratinhos C57BL6, são parcialmente andrógeno-sensível

In vitro

, e expressar uma versão mutante da proteína Termas-1, que é o alvo da resposta de células T CD8 dominante [ ,,,0],17].

Nós desafiamos camundongos fêmeas, ratos machos jovens e camundongos machos maduros com células TRAMP-C2 e mediu o crescimento de tumores ao longo do tempo (Figura 1A). Tumores cresceram de forma robusta em ratos machos adultos, mas cresceu mais lentamente em ratos machos jovens talvez devido ou a níveis de andrógenos mais baixos ou falta de tolerância imune a genes regulados por andrógenos. Em camundongos fêmeas, no entanto, os tumores TRAMP-C2 cresceu inicialmente e depois regrediu espontaneamente. A capacidade destes tumores a crescer inicialmente sugerido que o seu desaparecimento foi devido a rejeição imunológica em vez de uma dependência de elevados níveis de androgénios para um crescimento sustentado. Para confirmar esta hipótese, repetiu o desafio do tumor em quimeras de medula óssea em que transplantado de células T de medula óssea empobrecido feminino e masculino em hospedeiros do sexo feminino. tumores TRAMP-C2 foram completamente rejeitado em quimeras-feminino-para do sexo feminino, enquanto que em tumores quimeras TRAMP-C2-macho-fêmea em cresceram progressivamente (Figura 1B). Curiosamente, os ratinhos fêmea transplantados com uma mistura de medula óssea do sexo feminino e masculino, também não foram capazes de mediar a rejeição do tumor. Esta experiência demonstra que estas células cancerosas da próstata não exigem níveis de andrógenos sexo masculino para um crescimento sustentado

in vivo

, e que sua rejeição em ratos fêmea é mediada pelo sistema hematolinfóide. Além disso, a presença de células hematopoiéticas do sexo masculino parece ter um efeito supressor dominante sobre a capacidade das células hematopoiéticas do sexo feminino para rejeitar tumores TRAMP-C2, talvez devido à selecção negativa timo mediada pela expressão de antigénios do sexo masculino em células dendríticas do timo derivadas da medula óssea.

células tumorais a) TRAMP-C2 crescer progressivamente em ratos machos adultos, com uma penetração mais lenta cinética, mas completa em camundongos machos pré-púberes, e crescem rapidamente, mas, em seguida, são rejeitadas em camundongos fêmeas adultas. N = 5 ratinhos /grupo, uma das 2 experiências com resultados semelhantes. B) ratinhos fêmea adultos foram transplantados com fêmea, ou uma mistura de 01:01 de células T de medula óssea empobrecido do sexo masculino e do sexo feminino e 10 semanas após o transplante desafiados com tumores TRAMP-C2. N = 5 ratinhos /grupo, os resultados de uma única experiência. C) A prevenção início da puberdade em ratos machos podem mediar retardo de crescimento de tumores TRAMP-C2. ratos machos adultos castrados cirurgicamente antes do início da puberdade (4 semanas) mostram um crescimento retardado de TRAMP-C2, enquanto que a castração 1 semana antes da inoculação do tumor (7 semanas) não teve qualquer efeito no crescimento do tumor. N = 10 ratinhos /grupo, curva de crescimento do tumor e área sob a curva normalizada para o valor médio para o grupo 3 a partir de cada experiência. resultados combinados de 2 experimentos.

Os resultados dos ratos quimera-macho-fêmea em implicava também que o comprometimento do crescimento de células TRAMP-C2 em pré-púberes ratos idade de 5 semanas foi provavelmente devido a tolerância incompleta imune ao câncer de próstata adulta masculina, em vez de uma falta de níveis de andrógenos suficientes. Para avaliar mais diretamente para o potencial impacto de níveis de andrógenos, bem como outras diferenças induzida por idade, desafiamos ratos machos adultos da mesma idade (8 semanas) que foram castrados cirurgicamente ou no início (a 4 semanas de idade antes do início da puberdade ), ou mais tarde (uma semana antes da inoculação do tumor). Nós descobrimos que os ratos macho adulto que não haviam sido submetidos a puberdade devido à castração precoce exibida crescimento significativamente retardado de tumores TRAMP-C2 (Figura 1C). Enquanto as células TRAMP-C2 são rotineiramente cultivadas na presença de di-hidrotestosterona [16], os nossos resultados demonstram que TRAMP-C2 pode desenvolver tumores progressivos

in vivo

na ausência de androgénios testiculares-derivados, possivelmente devido à presença de andrógenos originários de outros órgãos endócrinos, tais como androstenediona produzido pelas glândulas supra-renais. De facto, o modelo de ratinho TRAMP, a partir do qual se origina TRAMP-C2, é conhecido para a produção de adenocarcinomas da próstata que podem progredir apesar da castração [18]. Nossos dados sugerem ainda que, enquanto algum potencial para o reconhecimento imunológico de antígenos próstata maduros existe no sexo masculino em idade precoce, a tolerância contra estes antigénios de próstata se desenvolve após a puberdade e conduz ao crescimento do tumor acelerado.

Transferência adoptiva de linfócitos Feminino em camundongos machos pré-implantados com células TRAMP-C2 retarda crescimento do tumor e medeia ocasionalmente Tumor rejeição

Tendo observado que a rejeição de células PAC em camundongos fêmeas foi mediada pelo sistema hematopoiético, perguntamos se a transferência de um sistema hematopoiético feminina em camundongos machos iria torná-los resistentes ao desafio do tumor TRAMP-C2. Geramos quimeras de medula óssea em que os hosts do sexo masculino foram transplantados com células T feminino de medula óssea esgotados. Apesar de ter um sistema hematopoiético de origem fêmea, tumores TRAMP-C2 cresceu prontamente nestes ratinhos quiméricos (Figura 2A). Isto sugere que as células T derivadas do sexo feminino são tornadas tolerantes a antigénios de próstata quando elas se desenvolvem em um hospedeiro do sexo masculino. Tolerância destas células pode ser tanto devido ao timo “educação” mediada por células epiteliais do timo radioresistentes do sexo masculino, e de mecanismos de tolerância periférica envolvidas quando essas células T femininos encontrar a próstata e outros tecidos masculinos.

A) macho adulto os ratinhos foram myeloablated através de irradiação e transplantados com células T de medula óssea empobrecido fêmea seguido por desafio com TRAMP-C2 tumores 10 semanas após o transplante. N = 5 ratinhos /grupo, os resultados de uma única experiência. B) ratos machos adultos foram subletal irradiado com 6 Gy e desafiados por via intradérmica com 1 × 10

6 TRAMP-C2. No dia seguinte, os ratos receberam uma infusão de linfócitos do doador (DLI) de 3 × 10

7 esplenócitos

i.v

. N = 10 ratinhos /grupo, uma de 3 experiências com resultados semelhantes. C) adotivamente-transferido células T reguladoras CD25 + não mediar um aumento do crescimento tumoral observada após DLI masculino. Os ratos foram irradiados e tumor-desafiado como em B, e recebeu esplenócitos que estavam usando esferas magnéticas onde indicado empobrecido-CD25. N = 10 ratinhos /grupo, os resultados de uma única experiência. D) células T CD4 Feminino mediar retardo de crescimento de tumores TRAMP-C2. Os ratos foram irradiados e tumor-desafiado como em B, e em seguida, recebeu 1,5 × 10

7 esplenócitos que foram

in vivo

depleção de células CD4, misturado com 1,5 × 10

7 esplenócitos que foram CD8- empobrecido, quer de origem macho ou fêmea. n = 10 ratos /grupo, um dos 2 experimentos com resultados semelhantes.

Para ignorar os mecanismos de tolerância central, o próximo avaliou o potencial de linfócitos fêmeas maduras para transferir a imunidade anti-PAC. Estas células foram sujeitas a selecção tímica no dador do sexo feminino, antes da transferência, e, por conseguinte, deve conter células T capazes de reconhecerem o cromossoma Y, androgénio-regulada, tecido específico da próstata, e antigénios mutacionais. Nós administrado a ratos machos uma dose mieloablativo de radiação para induzir linfopenia e criar espaço para as nossas células transferidos. Mais tarde, no mesmo dia, os ratinhos foram desafiados com células tumorais TRAMP-C2. Um dia mais tarde, esplenócitos, quer do sexo masculino ou do sexo feminino foram infundidas estes ratinhos desafiados com tumor. Descobrimos que, enquanto a infusão de esplenócitos macho teve nenhum efeito sobre o crescimento do tumor, os esplenócitos fêmea mediada um atraso significativo no crescimento do tumor e a sobrevivência melhorada livre de tumor, em alguns casos, levando à completa rejeição do tumor (Figura 2B).

através da transferência de esplenócitos totais, que são a transferência de células T reguladoras CD25 + CD4 + FoxP3 + (Treg) em adição às células T efectoras responsáveis ​​pelos efeitos GVT. É possível, em particular utilizando ratinhos dadores do sexo masculino, que estas células Tregs pode impedir a eficácia dos efectores transferidos. Para assegurar que as nossas observações não estavam a ser comprometida pela presença de células T reguladoras, que utilizado esferas magnéticas para esgotar Tregs dos linfócitos adoptivamente transferidos deixando menos do que 1% de células FoxP3 + restantes no enxerto (dados não mostrados). Depleção de células Treg não melhorou a eficácia tanto de linfócitos femininos ou masculinos adoptively transferidos (Figura 2C). Isto sugere que o principal determinante da eficácia GVT é a especificidade do antigénio das células efetoras transferidos, e que os doadores células Treg não tem um impacto significativo na GVT.

Para esclarecer as contribuições relativas de CD4 e células T CD8 na mediação de controle do crescimento do tumor por esplenócitos do sexo feminino, foi realizado um experimento mix-and-match usando doadores masculinos e femininos que foram perdidos

in vivo

com anticorpos contra ambos os CD4 ou CD8. Curiosamente, verificou-se que a transferência de células do sexo feminino T CD4 mediadas controlo tumoral semelhante, quando transferido com as células T CD8 + de qualquer origem macho ou fêmea, enquanto que as células T CD4 do sexo masculino foram incapazes de mediar o controlo do tumor, mesmo quando infundido em simultâneo com células T CD8 fêmea (Figura 2D). No seu conjunto, estes resultados sugerem que as células T ingénuas CD4 de ratinhos fêmea são essenciais para o controlo do crescimento de tumores TRAMP-C2 em ratos do sexo masculino, enquanto que as células T CD8 + do sexo feminino não são necessários.

células T CD4 + específicas fêmea DBY-Potenciar a resposta de células T CD8 contra TRAMP-C2 Tumor Antigens

para confirmar que as células T CD4 + desempenham um papel crucial no direccionamento respostas imunitárias do sexo feminino contra o cancro da próstata, foram realizados ensaios para identificar as respostas de células T contra epítopos específicos de antigénios expressa por TRAMP-C2. Anteriormente, foram identificados Termas-1, um antigénio no cromossoma 2 expressa por TRAMP-C2, com uma classe imunodominante I epítopo resultante de um ponto de mutação espontânea [17]. Por RT-PCR, que também identificada a expressão de classe I-restringida conhecida Y antigénios de cromossomas incluindo SMCY, UTY, e EIAFIAY, bem como a expressão de antigénio de classe II do cromossoma Y-restrito DBY (dados não mostrados). Tem sido relatado antigénios Y são frequentemente sobre-expressa selectivamente em linhas celulares de tumores humanos e CaP [7]. Da mesma forma, verificou-se que os genes para

smcy

,

uty

, e

DBY

parecia estar sobre-expressos seletivamente na linha de células TRAMP-C2 e espontaneamente decorrente de tumor de próstata a partir de ratinhos TRAMP comparação com B6 próstata normal (Figura S1).

para comparar as respostas imunitárias a antigénios TRAMP-C2 que surgem em ratos machos e fêmeas, que utilizou uma vacina celular composto por irradiado TRAMP- GM-CSF que sobre-expressam células C2 (TRAMP-GM-CSF) que tínhamos gerados e caracterizados anteriormente [19]. Nós ensaiadas macho vacinado e ratinhos fêmea para CD4 e CD8 de células T respostas contra conhecidos e previsíveis epítopos peptídicos derivados destes antígenos. Após re-estimulação com células dendríticas pulsadas com péptido, foi avaliada a produção de células T de IFN-γ. Descobrimos que a vacinação de fêmeas de camundongos com resultados TRAMP-GM-CSF em fortes respostas de células T CD4 contra DBY, enquanto que camundongos machos não desenvolvem respostas mensuráveis ​​contra DBY, embora as células T CD4 femininos e masculinos tiveram respostas semelhantes a estimulação com anti-CD3ε /contas anti-CD28, ou com acetato de forbol miristato (PMA) e ionomicina (Figura 3A). Provavelmente isso é devido à falta de tolerância central contra DBY em feminino versus ratinhos macho e a expressão elevada de DBY por células TRAMP-C2. Nós descobrimos que os ratos do sexo masculino fazem montar respostas de células T CD8 contra os SPAS-1 antígeno mutantes após a vacinação celular TRAMP-C2. células T CD8 do sexo feminino, no entanto, apresentam respostas mais fortes para SPAS-1 do que os homens (Figura 3A), um achado inesperado dado que a expressão de SPAS-1 não é nem restrição de gênero, nem regulado por hormônios. As respostas às ZPE-1 foi dominante sobre as respostas a outros antigénios, incluindo antigénios Y-chromosome SMCY, UTY, e EIAFIY, bem como as respostas ao antigénio epitelial seis transmembrana da próstata (STEAP), que tinha sido relatado devido a ser imunogénicos em murganhos machos e selectivamente sobre-expresso em tumores da próstata [20]. No seu conjunto, estes resultados sugerem que as células T CD4 + específicas DBY-fêmea é capaz de potenciar as respostas de células T CD8 + contra um antigénio tumoral imunodominante resultante de uma mutação espontânea.

A) A imunização de fêmeas com células TRAMP-GMCSF produz aumentada respostas CD4 contra respostas DBY e CD8 contra SPAS-1. Os ratinhos B6 masculinos e femininos foram injetados por via intradérmica com 1 × 10

6 irradiado TRAMP-GMCSF nos dias -9, -6 e -3 antes do sacrifício. CD4 + e CD8 + esplenócitos foram purificados com esferas magnéticas e re-estimuladas com CD11c + DC esplénicas fêmea pulsadas com o péptido indicado, ou alternativamente foram estimuladas com anti-CD3ε /contas anti-CD28, ou com acetato de forbol miristato (PMA) e ionomicina. As concentrações de sobrenadante de IFN-γ e outras citoquinas foram analisadas por citometria de BD matriz do grânulo. Os resultados de uma única experiência. B) a vacinação DNA com SPAS-1 produz respostas imunes em ratos machos adoptively transferidos com linfócitos do sexo feminino. Os ratinhos B6 machos receberam 6 Gy irradiação seguido por transferência adoptiva de linfócitos macho ou fêmea. Os ratinhos foram vacinados por pistola de genes com spas-1-plasmídeos de expressão de ADN nos dias 1, 7 e 13 após a transferência adoptiva. No dia 19, os esplenócitos foram incubados com ou sem o SAPS-1 e péptidos DBY, ea produção de IFN-γ por células T CD4 e CD8 foi avaliada por citometria de fluxo intracelular. Os resultados de um único experimento.

Para determinar se um fenómeno semelhante de “ajuda” DBY-específica CD4 células T estava ocorrendo no ambiente de terapia celular adotiva, nós transferidos quer esplenócitos sexo masculino ou feminino em masculino hosts e, em seguida, vacinados com um plasmídeo de DNA expressando SPAS-1 mutado. Descobrimos que os ratos do sexo masculino que receberam os esplenócitos fêmea desenvolveram espontaneamente respostas de células T CD4 + contra DBY, evidenciada pela produção intracelular de IFN-γ. Notavelmente, os machos que receberam os esplenócitos fêmea desenvolveram fortes respostas de células T CD8 às ZPE-1 de vacinação, enquanto que os machos que receberam os esplenócitos do sexo masculino tinha nenhuma resposta significativa para spas com uma vacinação (Figura 3B). Os resultados destas experiências de transferência adoptivos indicam que os mecanismos possíveis para um melhor controlo do crescimento do tumor em pacientes do sexo masculino de linfócitos femininos incluem tanto CD4 como o reconhecimento de células T CD8 de antigénios expressos por TRAMP-C2.

Transferência adoptiva de linfócitos fêmea em Hosts linfopênicos masculinos não resulta em significativa GVHD

em nossos modelos de transplante imunológico feminino-para-masculinos, temos monitorado ativamente por sinais clínicos de GVHD, que podem incluir perda de peso, bem como alterações na atividade, postura , pele e pêlo. Não vimos nenhuma evidência para GVHD nestas experiências. Na configuração de transplante de medula óssea, no entanto, seleccionando um dador do sexo feminino pode levar a um aumento do risco de GVHD [10] – [12]. A fim de investigar a segurança da terapia celular feminina adoptiva para pacientes com câncer de próstata, foi avaliada histologicamente para subclínica da GVHD em dois modelos, B6 em B6 (singênica) e LP em B6 (MHC-correspondido, menor alogênico incompatíveis-antígeno ), olhando para os órgãos alvo GVHD incluindo fígado, intestino delgado, e intestino grosso. Nós descobrimos que na configuração singeneicos, em dois pontos de tempo diferentes (dias 21 e 42 após a transferência de linfócitos) do sexo feminino não produzem significativamente mais do que os linfócitos GVHD machos (Figura 4). Na configuração mais clinicamente relevante de, um modelo combinado mal menor antígeno-MHC-correspondido, encontramos um grau semelhante de GVHD usando doadores do sexo feminino e masculino em ambos os pontos temporais precoces e tardias. No geral, GVHD patológica pontuações observadas nesses modelos de transferência de irradiação de linfócitos subletais foram leves em comparação com o transplante de medula óssea MHC-incompatíveis com ajuste de células T alogénicos (Figura 4), confirmando nossas observações que GVHD é leve nestes modelos, e que o uso de linfócitos do sexo feminino não parece aumentar a incidência ou gravidade da GVHD.

os ratinhos B6 machos foram dadas 6 Gy irradiação seguido por um

iv

infusão de 3 × 10

7 esplenócitos, macho ou fêmea, de doadores LP B6 ou alogénicos sing�icos. Para efeito de comparação, os ratos B6 do sexo feminino foram irradiados letalmente (11 Gy) e transplantadas com 5 × 10

6 células da medula de células T esgotados ósseas e 2 × 10

6 células T esplénicas purificadas de camundongos B10.BR MHC-incompatíveis (H2K em H2b). Os ratos foram avaliados no dia indicado para a evidência histológica de GVHD no fígado, intestino delgado, e intestino grosso. Os resultados de um único experimento.

Discussão

Aqui nós relatamos que adoptively transferidos linfócitos fêmeas virgens de retardar o crescimento do e, em alguns casos, rejeitar pré-implantado próstata adenocarcinoma TRAMP-C2 células em subletalmente irradiados ratinhos macho. Uma conclusão semelhante também foi recentemente relatado por Yi et. ai, que também utilizado células TRAMP-C2 [21]. Eles identificaram as células T como mediadores de respostas imunitárias anti-cancro da próstata em ratos fêmea e descobriram que a transferência adoptiva de linfócitos vacinados do sexo feminino pode conduzir a um controlo de crescimento de tumores TRAMP-C2 em hospedeiros machos. Nosso estudo apóia suas conclusões iniciais e se expande sobre eles consideravelmente através da identificação de mecanismos pelos quais o sistema imunológico feminino monta respostas superiores ao câncer de próstata. Nós demonstramos que as células T CD4 fêmeas são mediadores essenciais da presente efeito, particularmente aquelas específicas para o epítopo imunodominante do antigénio DBY macho. Enquanto Yi et. ai descobriram que os ratos fêmeas imunizados com TRAMP-C2 desenvolvido algumas respostas de células T contra o tecido de próstata normal, bem como a STEAP antigénio da próstata, os nossos dados demonstram que as respostas a STEAP são relativamente pequenos em comparação com as respostas ao antigénio tumoral imunodominante surgir espontaneamente mutado SPAS-1, que não foi ensaiado para no estudo anterior. Os nossos resultados indicam que as respostas das células T CD4 + contra DBY, que são únicas para repertórios imunitários femininos, pode acentuadamente aumentar as respostas de células T CD8 + contra um antigénio tumoral mutante surgir espontaneamente como spas-1. respostas de células T CD4 para DBY parecem ser particularmente robusto na definição de restrição I-Ab II do MHC; As células T derivadas de ratinhos portadores de um receptor de células T transgénico específico para o mesmo epitopo DBY foram previamente mostrado capaz de respostas de montagem contra tumores TRAMP-C2 em ratinhos knockout RAG [22]. Descobrimos que os linfócitos do sexo feminino em um host do sexo masculino também foram capazes de encontrar respostas superiores a vacinação contra a SPAS-1, no cenário de desenvolver simultaneamente respostas espontâneas para DBY.

É possível que as células T CD4 específicas para DBY pode fornecer ajuda para as células T CD8 + que medeiam a GVHD, bem como a GVT. No entanto, através da utilização de um modelo com irradiação subletal seguido por transferência de linfócitos sem co-transferência de células-tronco hematopoiéticas, fomos capazes de minimizar marcadamente enxerto-versus-hospedeiro efeitos da doença. camundongos machos tratados com doses elevadas de linfócitos do sexo feminino tiveram nenhuma evidência clínica de doença do enxerto-versus-hospedeiro e só existe evidência patológica muito suave. Ao mesmo tempo, no entanto, esta abordagem pode ter permitido o estabelecimento de tolerância para antigénios do sexo masculino e de próstata reconhecidos por células T derivadas do sexo feminino transferidos, o que pode limitar a eficácia desta estratégia e resultando em menos de rejeição de ratinhos completamente os seus tumores.

Muitos dos recentes avanços na imunoterapia tumor têm-se centrado em ambos estratégias de vacinação ou bloqueio dos mecanismos de regulação do sistema imunológico. Duas estratégias recentes imunes que obtiveram aprovação da FDA incluem vacinação contra sipuleucel-T para o tampão metastático [1], e bloqueio mediada por anticorpos da T-célula negativa da CTLA-4 receptor co-estimulador para o tratamento do melanoma metastático [23]. O objetivo das estratégias de vacinação estão a gerar novas respostas de células T anti-tumor, enquanto que as estratégias de bloqueio reguladora imunes procuram para libertar as respostas imunitárias anti-tumor endógenos que são gerados espontaneamente mas conteve ineficaz e [24]. Embora ambas as abordagens mostram a promessa, os dados clínicos mostram que a maioria dos pacientes eventualmente ainda sucumbir a progressão de seu câncer. Combinações de abordagens imunes pode ser a mais promissora. Neste estudo, identificar uma terceira abordagem, a saber, melhoria do repertório imunológico por transferência adoptiva de linfócitos incompatíveis sexo com uma melhor capacidade de reconhecer antigénios tumorais. aprimoramento repertório tem o potencial de sinergia dinamicamente tanto com a vacinação do tumor e estratégias de bloqueio de regulação do sistema imunológico.

Para o câncer de próstata metastático resistente à castração, uma doença que continua a ter um prognóstico pobre, mostramos que os linfócitos do sexo feminino, particularmente CD4 células T, adoptivamente transferidos para ratinhos macho desafiados com cancro da próstata pode mediar os efeitos anti-tumor substanciais. Em termos de segurança, esta abordagem parece clinicamente viável, não observamos GVHD substancial em qualquer singênica ou MHC-correspondido, menor do sexo feminino alogênico incompatíveis com as transferências de linfócitos do sexo masculino. Os dados aqui apresentados suporta uma avaliação mais aprofundada desta abordagem para imunoterapia de câncer de próstata e seu potencial para sinergia com outras abordagens de imunoterapia de apoio.

Materiais e Métodos

Ratos

Todos os procedimentos de mouse foram realizados de acordo com as orientações do protocolo institucionais no Memorial Sloan-Kettering Cancr Center (MSKCC). Os ratos foram mantidos de acordo com as diretrizes do NIH cuidados animais, ao abrigo de protocolos aprovados pelo Comité de Cuidados MSKCC Institucional animal que descrevem experimentos específicos para este estudo. murganhos C57BL /6 e LP foram obtidos do Jackson Laboratory.

Anticorpos

CD4 (GK1.5) e CD8 (2,43) anticorpos que destroem foram adquiridos de Bio-Xcell. A citometria de fluxo foi realizada utilizando anticorpos que reconhecem CD45 (30-F11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), IFN-γ (XMG1.2) comprados de BD Biosciences.

Peptídeos

Todos os péptidos utilizados foram adquiridos da Biossíntese, Inc. e usado a uma concentração final de 10 uM. peptídeos CD8 incluídos SPAS-1 (244-252), SMCY (738-746), uty (246-254), EIAFIY (63-71) e STEAP (262-270, 327-335). peptídeos CD4 incluídos DBY (608-622) e como controle, Pep25, o dominante MHC classe II-apresentado epitopo de M.

tuberculose

Ag85B [25].

Linhas Celulares

células tumorais TRAMP-C2 foram fornecidos pelo Dr. Norman Greenberg [26] e cultivadas como anteriormente descrito [16]. células TRAMP-GM-CSF também foram previamente descritos [19].

BMT

Todos os protocolos de transplante foram revistos e aprovados pelo Memorial Sloan-Kettering Cancer Center IACUC. protocolos de transplante ter sido previamente descrito [27].

foram anestesiados castração cirúrgica

Ratos e de uma pequena incisão escrotal feito para revelar os testículos. Estes foram suturados e removido juntamente com áreas de tecido adiposo.