Abstract
Fundo
crônica pelo vírus da hepatite C (HCV) epitelial-mesenquimal e cirrose hepática associada representam um importante fator de risco para o carcinoma hepatocelular desenvolvimento (HCC). TGF-β é um importante motor de fibrogênese hepática e câncer; no entanto, o seu impacto real na progressão do cancro humano é ainda pouco conhecida. O objetivo deste estudo foi investigar o papel das variantes naturais HCC-derivado do núcleo do VHC na progressão do câncer através do seu impacto sobre a sinalização TGF-β.
principais conclusões
Nós fornecemos evidências de que HCC- a expressão da proteína do núcleo derivado no hepatócito humano ou do rato primária alivia respostas TGF-beta em termos ou inibição do crescimento ou apoptose. Em vez disso, nestes hepatócitos TGF-β ainda foi capaz de induzir uma epitelial para mesenquimal (EMT), um processo que contribui para a promoção da invasão celular e metástase. Além disso, demonstra-se que diferentes limiares de activação Smad3 ditar as respostas de TGF-β em células hepáticas e que a proteína do core do VHC, diminuindo a activação Smad3, pode mudar os efeitos inibidores do crescimento de TGF-β para promover respostas de tumor.
Conclusão /Significado
os dados ilustram a capacidade dos hepatócitos para desenvolver EMT e plasticidade sob TGF-β, enfatizam o papel da proteína do núcleo de HCV na dinâmica destes efeitos e fornecer evidência para um paradigma segundo o qual uma proteína viral implicada na oncogénese é capaz de mudar as respostas de TGF-β de efeitos citostáticos ao EMT desenvolvimento
citação:. Battaglia S, Benzoubir N, Nobilet S, P Charneau, Samuel D, Zignego aL, et al. (2009) O cancro do fígado Derivado de vírus da hepatite C Núcleo Proteínas Mudança Respostas TGF-beta de supressão do tumor para a transição epitelial-mesenquimal. PLoS ONE 4 (2): e4355. doi: 10.1371 /journal.pone.0004355
editor: Mauricio Rojas, da Universidade Emory, Estados Unidos da América
Recebido: 22 de julho de 2008; Aceite: 18 de dezembro de 2008; Publicação: 03 de fevereiro de 2009
Direitos de autor: © 2009 Battaglia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por INSERM, Association pour la Recherche sur le Câncer (ARC), Agence Nationale de Recherche sur le SIDA (ANRS) e da Comunidade Europeia (VIRGIL). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
epitelial para mesenquimal (EMT) é definida como um processo em que as células epiteliais perdem sua fenotípica característica e adquirem características de células mesenquimais. Enquanto EMT está envolvido no contexto do desenvolvimento embrionário que também desempenha um papel na génese de fibroblastos durante a fibrose de órgão em tecidos adultos e pode contribuir para o desenvolvimento de carcinoma metastático [1]. Com efeito, EMT está a ser cada vez mais reconhecido como um passo crucial que promove a migração celular, invasão tumoral e metástase [2], e também tem sido implicada recentemente no surgimento de células estaminais do cancro [3]. No fígado, as células estreladas hepáticas (HC) são consideradas como as principais células precursoras fibróticas que transdiferenciam a, miofibroblastos matriz extracelular produzir fibrogênicas em tecido hepático inflamatória mediante a sinalização de TGF-β, enquanto hepatócitos sofrem apoptose após a sinalização por esta citocina. No entanto, a identificação de diferentes populações fibrogênicas além de células estreladas residentes [4], bem como os resultados convergentes de estudos recentes têm desafiado o paradigma da HSC como a fonte essencial de miofibroblastos fígado e inferir um papel proeminente para hepatócitos em fibrogênese hepática. Na verdade, tem sido relatado recentemente que os hepatócitos de rato ou murganho respondem ambos
In vitro
e
in vivo para TGF-
β não só em termos de inibição do crescimento celular e apoptose, mas também em termos de indução de EMT [5] – [7]. Por conseguinte, tem sido mostrado que o TGF-β e laminina 5 transformar células de carcinoma hepatocelular não invasivos em células invasivas através da indução de uma completa [8] EMT. No entanto, embora os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento EMT têm sido estudados extensivamente, poucas evidências disponíveis sobre suas funções fisiológicas e relevância em patologias humanas.
Um dos mecanismos pelo qual as células se submetem à transformação neoplásica e escapar do normal controle de crescimento envolve uma resposta alterada aos efeitos citostáticos de TGF-β [9], [10]. Além disso, durante as fases posteriores da tumorigénese, TGF-β pode estimular a invasão principalmente através da indução de EMT. é agora geralmente aceite que o TGF-β tem um papel duplo na oncogénese e podem actuar como um supressor de tumor ou factor promotor do tumor dependendo do contexto celular [11], [12], mas os mecanismos envolvidos na mudança de respostas de TGF-p para malignidade não são completamente compreendidos.
In vivo
, foi demonstrado que a perda de TGF-β sinalização diminuiu significativamente a latência do tumor e aumentou a taxa de metástase em vários modelos de rato [13].
TGF-β inicia respostas por contactando dois tipos de serina trans-membrana /treonina quinases chamados receptores de tipo I e tipo II, promovendo a activação do tipo I pela cinase de tipo II. O receptor tipo I, em seguida, activado o sinal se propaga ao núcleo por fosforilação de Smad2 e Smad3. Uma vez fosforilada, Smad2 e Smad3 associado com o parceiro partilhada Smad4 e os complexos de acumular-se no núcleo onde regulam a expressão de genes alvo TGF-β através de interacções cooperativas com parceiros de transcrição [14], [15], [16]. A interrupção da sinalização de TGF-β, quer através de inactivação mutacional de componentes da via de sinalização, ou através da modulação da sua expressão ou função, é agora conhecido por desempenhar um papel importante na progressão do tumor. Apesar de todas essas evidências, a implicação clínica do TGF-β na progressão de metástase ainda não está claro.
A hepatite crônica pelo vírus C (HCV) e cirrose hepática associada representam um importante fator de risco para o carcinoma hepatocelular desenvolvimento (HCC), e apesar de evidências epidemiológicas que liga infecção pelo HCV para HCC, o impacto clínico deste vírus na hepatocarcinogênese ainda é incerto [17]. Porque HCV RNA apresenta alta variabilidade genética, crônicas resultados infecção pelo HCV em uma população complexa de diferentes, mas estreitamente relacionados variantes virais vulgarmente designado como quasispécies [18], [19]. Foi observada a distribuição não aleatória da quasiespie HCV entre fígado tumoral e não tumoral, sugerindo a possibilidade de uma selecção de quasiespie com propriedades funcionais modificados, que podem contribuir para o desenvolvimento de fibrose, bem como processo de tumorigénese [20].
O componente estrutural do HCV, a proteína do core do VHC tem atraído uma atenção particular após a sua caracterização e vários relatórios sugeriram o seu potencial papel na patogénese por VHC. Com efeito, para além do seu papel no empacotamento do ARN virai, proteína do núcleo de HCV tem sido relatado para interagir com várias proteínas celulares, tais como TNFR [21], PKR [22], Stat3 pRB ou p53 [23], que conduz a modulação da transcrição de genes dependentes estas cascatas e, consequentemente, para a modulação de um número de funções celulares reguladoras. De facto, numerosos dados sugeriram um possível envolvimento da proteína do núcleo de HCV na modulação da proliferação celular e apoptose embora alguns resultados têm sido controversa dado que a proteína de núcleo tem sido referido como exibindo efeitos pro ou anti-apoptóticos, dependendo do sistema experimental utilizado [24] , [25]. Além disso, estes estudos foram realizados principalmente por meio de agentes apoptóticos da família TNF e não com TGF-β. Esta discrepância pode também ser devido a heterogeneidade genética de diferentes genótipos de HCV.
Nós e outros autores demonstraram previamente uma interacção entre a proteína e Smad3 core do VHC [26], [27]. Curiosamente, também observamos que o núcleo naturais diferentes variantes isoladas a partir de tumores ou nódulos não tumorais poderia diferente ligam Smad3, e consequentemente inibir o TGF-β induzida actividade de transcrição Smad3 sugerindo que a proteína do core do VHC podem modular a sinalização de TGF-β e as suas respostas biológicas a jusante [ ,,,0],27]. Nós hypothetised que a heterogeneidade molecular de HCV observada em pacientes infectados pode estar envolvido no curso clínico de desenvolvimento de cancro.
A sobre-expressão de TGF-β e concomitante diminuição da inibição de crescimento de hepatócitos é frequentemente observada em HCC apoiando a noção de que TGF-β poderia desempenhar um papel na promoção de tumores do cancro do fígado [28]. No entanto, as implicações funcionais de TGF-β na tumorigénese fígado, bem como a implicação de EMT no desenvolvimento de HCC não está ainda elucidada. Da mesma forma, os efeitos de oncogénica da hepatite B virai ou de proteínas C no desenvolvimento de EMT não têm sido estudados no decurso de processo de hepatocarcinoma. Demonstrando interacção entre a infecção pelo HCV e TGF-β EMT mediada pode fornecer um novo modelo para obter insights nos mecanismos da carcinogênese hepática.
Neste estudo, fizemos uso do núcleo de HCV naturais variantes isolado do HCC relacionado com o HCV tecidos para analisar o seu impacto sobre a dupla função de TGF-β numa condição pathophysiogically relevantes. Assim, investigou-se os efeitos da proteína de núcleo de variantes isoladas a partir de tanto do tumor ou áreas não tumoral cirróticos em hepatócitos humanos primários; Com efeito, a cirrose é uma condição pré-neoplásica bem conhecido, associado a pelo menos 90% de casos de HCC. Usando estas variantes que fornecem evidências para um paradigma em que uma proteína viral é capaz de mudar respostas TGF-beta a partir efeitos citostáticos para EMT desenvolvimento.
Materiais e Métodos
Materiais
recombinante de TGF-β1 e TRAIL recombinante /Apo2L foram adquiridos a Abcys, o inibidor químico de TGF-β sinalização SB-431542 que actua por interferir especificamente com o receptor de tipo I [29], a partir de Calbiochem, o corante fluorescente DIOC
6 (iodeto 3,3’dihexylocarbocyanine) era da Molecular Probes.
Vectors
sequências centrais comprimento completo HCV foram amplificados a partir de HCV-RNA extraído a partir de tumor (T) ou nódulos cirróticos (NT) de um doente (doente B) infectadas com o genótipo de HCV 1b como descrito anteriormente [22]. Os produtos de PCR foram directamente sequenciado e inserido no vector pcDNA3.1. A sequência destas duas variantes foi previamente descrito [27]. A sequência T difere do NT por 2 mudanças no aa 118 (N → D) e aa 189 (A → V).
(CAGA)
9-Luc foi gentilmente cedido pelo Dr. JM Gauthier . Os vectores de expressão para HA-TβRI.act, e bandeira-TβRImL45.act foram uma oferta do Dr. Y.E. Zhang [30]. O plasmídeo pRetroSuper-puro contendo antisense curto RNA grampos contra Smad3 foi gentilmente cedido pelo Dr. J. Massagué [31]. Um plasmídeo pRetroSuper-puro contendo disputa grampos curtos RNA foi utilizada como controle. pIRES-GFP foi obtido a partir de Stratagene, pCMV-Luc foi Renilla-da Promega. Myc-Smad3 vector de expressão foi previamente descrito [32].
ratinhos transgénicos
Para se obter murganhos transgénicos, os ADNc do núcleo de HCV isoladas a partir de tumor (T) ou nódulos cirróticos (NT) foram clonados a jusante de elementos reguladores de vírus da hepatite B e introduzido em embriões de ratinhos C57BL /6 (Institut de la Clinique rato, Estrasburgo, França). Os ratinhos transgénicos foram identificados por sujeição de 1 ug de ADN da cauda para amplificação por PCR.
cultura celular
A linha de células de hepatoma humano Huh7 [33] foi mantida em meio modificado de Dulbecco contendo 10% de vitelo fetal soro de vitelo (FCS). As células foram transfectadas com os diferentes vectores utilizando o método de LipofectAMINE (Invitrogen) e os transfectantes estáveis foram seleccionadas por incubação das células com o antibiótico correspondente ao gene de selecção.
Isolamento e cultura de hepatócitos primários
Os hepatócitos primários de rato foram isolados por perfusão do fígado com uma mistura de colagenase tal como descrito anteriormente [34]. Após isolamento, os hepatócitos foram ressuspensos em meio de Williams suplementado com soro de vitelo fetal a 10%, 100 ug /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina, 250 ng fungizona /ml ( “plaqueamento médio”) e plaqueadas a uma densidade de 3 x 10
4 células /cm
2. Após 4 horas, o meio contendo soro foi removido e as células foram cultivadas em meio de Williams suplementado com 1 mg /ml de albumina de soro bovino, 100 ug /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina, 250 ng fungizona /ml, e tratadas com TGF- β 2 ng /mL ou SB431542 1 uM.
hepatócitos humanos primários foram isolados a partir de tecido de fígado saudável de amostras de biopsia de fígado cirúrgicos recolhidos após consentimento informado obtido a partir de pacientes submetidos a hepatectomia parcial terapêutico para a metástase do fígado e tumor hepático benigno. A colagenase (Sigma Aldrich) de perfusão (500 ug /ml, 2,4 mg /ml de CaCl
2 em tampão de HEPES, pH 7,4) foi precedida de uma lavagem exaustiva do tecido hepático com tampão HEPES /EDTA (pH 7,4) usando um cateter inserido para os vasos na superfície de corte do fragmento ressecado. As células foram então lavadas duas vezes e os hepatócitos foram separados das células nonparenchymatous por Percoll fraccionamento (solução de Percoll isotónico 30%, centrifugado a 450 g durante 4 min) e imediatamente infectadas a 37 ° C durante 2 h com vectores lentivirais, lavadas e plaqueadas em meio de Williams suplementado conforme já descrito [35]. Doze horas depois, eles foram tratados ou não com TGF-β ou SB431542 para vários períodos de tempo.
lentivirais
TRIP-ΔU3-CMV-T, TRIP-ΔU3-CMV-NT e vectores TRIP-ΔU3-CMV-NVIQ foram obtidas por substituição da GFP em TRIP-ΔU3-CMV-GFP com ADNc que codifica para as sequências do núcleo de HCV. Uma sequência invertida núcleo TRIP-ΔU3-CMV-NVIQ foi utilizada como um controlo.
partículas de vector foram produzidos por co-transfecção do fosfato de cálcio transiente de células 293T como anteriormente descrito [36]. concentrações de vector foram normalizados de acordo com o teor dos sobrenadantes p24 (HIV-1 da proteína da cápside).
Western blotting
As células foram lavadas duas vezes com PBS e lisadas em tampão RIPA contendo 0,5% de SDS e Benzon nuclease. As proteínas foram quantificados com o ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, França) e 30 ug de extractos foram separados em gel de SDS-poliacrilamida, transferidas sobre membrana de nitrocelulose e colocados a hibridar utilizando diferentes anticorpos primários dirigidos contra proteína do core do VHC, E-caderina, fibronectina (Cruz Biotechnology de Santa), Vimentin (Chemicon), fosfo-Smad3 (sinalização celular), Smad3 (Abcam), Bandeira, Myc e tags de HA (Sigma). As membranas foram reveladas utilizando um kit de detecção chemioluminescence (ECL Além disso, GE Healthcare).
coloração celular
Os hepatócitos primários de rato foram cultivadas durante 48 h com ou sem TGF-β (2 ng /ml) e mancha de rotina com hematoxilina e eosina foi executada após a fixação das células com EtOH a 70% a 4 ° C durante 15 min.
imunofluorescência coloração
As células foram lavadas com PBS e fixadas com PFA a 4% solução a 4 ° C durante 20 minutos, seguido de permeabilização de metanol durante 5 minutos a -20 ° C. As células foram então incubadas com um primário do rato anti-vimentina, de coelho anti-αSMA, ou anticorpo de coelho anti-E-caderina e, em seguida, com um anticorpo anti-ratinho conjugado com Alexa Fluor 488 e um anticorpo anti-coelho Alexa Fluor 594 cabra conjugado (Molecular sondas). Eles foram então corados com Hoechst e examinadas por microscopia de fluorescência.
proliferação celular e apoptose ensaios
A proliferação celular foi avaliada pela incorporação de BrdU (Roche), a viabilidade celular e a actividade da caspase 3 foram estimadas usando um CellTiter-Glo ensaio de viabilidade celular luminescente ou o ensaio CaspaseGlo 3/7 respectivamente (Promega) de acordo com as instruções do fabricante.
mitocondrial transmembranar potencial (ΔΨm) foi avaliada pelas células coradas (10
6) com o corante fluorescente DIOC
6, a uma concentração final de 40 nM durante 15 min a 37 ° C. As células foram imediatamente dissociado por tripsina e sua fluorescência estimada pela análise com um citómetro de fluxo FACScan (Becton-Dickinson) utilizando o canal FL1 [37].
celular triagem
análise de citometria
Flow e ordenar era realizada utilizando um citómetro de fluxo FacsDiva (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Scatter para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) foram coletadas através de um filtro. O sinal de GFP foi coletado no canal FL1. Um portão claro foi desenhado no SSC contra FSC para excluir células mortas /detritos. As células do portão foram exibidos em um histograma biparameter (FS contra FL1) e as definições de propagação final determinado para recolher as células marcadas. Células positivas para GFP foram classificados em 5000 células /seg.
análise transcricional
As células foram co-transfectadas com vectores que codificam para o gene de interesse, juntamente com o plasmídeo repórter CAGA-Luc e o plasmídeo de luciferase de Renilla para normalizar os resultados. Eles foram incubados 24 h mais tarde, na ausência ou na presença de TGF-β durante mais 18 h. A actividade da luciferase foi medida com o sistema de ensaio de repórter duplo de Luciferase (Promega) de acordo com as instruções do fabricante.
A análise estatística
O significado entre as diferentes condições e o seu controlo foi determinada por pareado de
t
teste utilizando o software GraphPad Prism. A p-value≤0.05 foi considerado significativo.
Resultados
núcleo HCV variantes aliviar respostas citostáticos TGF-β e aumentar EMT mediada por TGF-β no mouse ou hepatócitos primários humanos
Temos anteriormente demonstrado que, quando expresso transitoriamente em células hepáticas, proteínas do núcleo do VHC isolados a partir de tumores ou nódulos cirróticos Smad3 ligar de maneira diferente e que esta interacção inibe a actividade de transcrição Smad3-dependente [27]. Para determinar a relevância fisiológica desta observação, primeiro investigado o impacto de tal ligação em respostas biológicas TGF-β em hepatócitos isolados a partir de ratinhos transgénicos que expressam estas tumor VHC (T) ou cirrose (NT) variantes de núcleo sob o controlo do promotor HBx e que é principalmente expresso no fígado. Os hepatócitos foram isolados a partir de fígados de ratos de 2 meses de idade e tratada ou não com TGF-β durante 48 horas. Observou-se que o TGF-β foi menos potente em inibir a proliferação celular em hepatócitos isolados a partir de ratinhos transgénicos que expressam as proteínas do núcleo de HCV do que em hepatócitos isolados de um ratinho de controlo (Fig. 1A). Consequentemente, a viabilidade celular foi menos reduzida por TGF-β em células que expressam as proteínas do núcleo, em comparação com as células de tipo selvagem (Fig. 1B). Nós também descobrimos que a expressão das proteínas do núcleo do VHC inibiram a apoptose mediada por TGF-β como mostrado pela activação da caspase 3, que representa uma característica bem definida de apoptose (Fig. 1C). Curiosamente, a expressão de núcleo t Redução da apoptose ou inibição da viabilidade celular mediada por TGF-β para uma extensão maior do que o núcleo NT mostrando um significado funcional da interacção aumentada desta variante núcleo com Smad3 [27]. A fim de verificar se esse HCV redução induzida-core de apoptose, observado após o tratamento TGF-β foi específico, usamos outro indutor de apoptose, TRAIL. hepatócitos de rato que expressam ou não as proteínas do núcleo de HCV responder aos TRAIL de uma forma semelhante em termos da activação da caspase 3, sugerindo que o processo de apoptose total não foi modificado pela expressão núcleo (Fig. 1D). Este resultado está de acordo com um relatório anterior, indicando que o núcleo HCV leva à apoptose induzida por TRAIL através da ativação da via de sinalização mitocondrial [38].
(A, B, C) hepatócitos do rato obtido a partir de fígados de ratinhos transgénicos que expressam ou não proteínas do núcleo do VHC isolados a partir de tumor (T) ou tecidos cirróticos (NT) foram tratados com TGF-β durante 48 horas antes da determinação da proliferação celular, estimada por incorporação de BrdU (a), a viabilidade celular (B) ou caspase 3 atividade (C). (D) As células foram tratadas com TRAIL (20 ng /ml) durante 18 horas antes da determinação da actividade caspase3. Os resultados representam a média +/- desvio padrão de triplicados de uma experiência representativa. * P ≤ 0,05, ** p≤0.005, *** p≤0.0005.
Diversas linhas de evidência apoiam a noção de que as células cancerosas epiteliais perdem a sua capacidade de resposta aos efeitos citostáticos TGF-β, mas em alguns casos, manter a sua capacidade de responder a outras funções mediadas por TGF-β tais como EMT. A observação de que as proteínas do núcleo de HCV interferir com a capacidade de TGF-β para executar a inibição do crescimento celular e a morte celular levaram-nos a considerar a possibilidade de que estas proteínas podem influenciar o TGF-β EMT mediada. Uma vez que estudos recentes têm demonstrado que o TGF-β poderia induzir um EMT em hepatócitos de rato maduros
in vitro
[6], [7], nós investigamos se as proteínas do núcleo de HCV pode modular a capacidade de TGF-β para promover EMT nas mesmas hepatócitos primários. Observação por microscopia de contraste revelou que após o tratamento durante 30 horas com o TGF-p algumas hepatócitos adquiridos uma morfologia de fibroblastos, sugestivos de EMT e que este efeito era mais pronunciado quando estes hepatócitos expressar a proteína do núcleo que mostra que a plasticidade celular pode ser aumentada em hepatócitos de rato expressando core do VHC proteína T (Fig. 2A). Esta observação foi reforçada pela observação videomicroscopia (dados não mostrados). Para confirmar se essas mudanças fenotípicas observadas eram reflexo de um EMT, realizamos análises de imunofluorescência em hepatócitos isolados de controlo ou de ratinhos transgénicos. Em linha com os resultados anteriores, o tratamento de TGF-β de hepatócitos de rato de controlo foi acompanhada por um aumento muito acentuado na polimerização do mesenquimais marcador alfa actina de músculo liso (αSMA) consistente com um fenótipo de EMT (Fig. 2B). Curiosamente, proteínas do núcleo do HCV e em particular a um T poderia aumentar as fibras αSMA na ausência de TGF-exogenamente adicionado β. Para avaliar se a libertação autócrina do TGF-β poderia estar envolvido na formação de fibras de stress em αSMA core do VHC células que expressam, utilizou-se um inibidor específico TGFβR1, SB431542. Quando estas células que expressam foram tratados com este inibidor, fibras αSMA desaparecido completamente, o que sugere que o efeito da proteína do núcleo em desenvolvimento EMT é mediada por uma produção endógena de TGF-β (Fig. 2B). Em conformidade, Western blots também análises mostraram que a expressão de E-caderina, um marcador conhecido epitelial para ser perdido em células mesenquimais, foi grandemente diminuído por TGF-β e completamente restaurada por adição de SB431542 (Fig. 2C).
(A) alterações na morfologia dos hepatócitos de rato que expressam ou não da proteína do núcleo de HCV T observada após 48 h de cultura, com ou sem TGF-β (2 ng /ml). (B) Os hepatócitos isolados a partir de ratinhos transgénicos que expressam proteínas do core do VHC foram tratados com TGF-β (2 ng /ml) ou SB431542 (1 uM) durante 48 h e expressão de αSMA foi examinado por imunof luorescência utilizando um anticorpo αSMA. Os dados são representativos de três experiências independentes. (C) Os hepatócitos isolados a partir de ratinhos transgénicos que expressam proteínas do core do VHC foram tratados com TGF-β ou SB431542 durante 48 h e expressão de E-caderina foi determinada por Western blotting. Anti-p38 transferência de Western foi utilizada como controlo de carregamento. Os dados são representativos de três experiências independentes.
Para se obter mais provas de que as proteínas do núcleo de HCV pode modular a magnitude dos efeitos reguladores negativos de crescimento de TGF-p também realizadas experiências em hepatócitos primários humanos. Hepatócitos isolados de fresco foram infectadas com lentivírus que codificam para as variantes do núcleo T ou NT ou uma sequência núcleo invertido como controle. As análises Western blot confirmou a expressão das proteínas do núcleo (Fig. 3a). As células foram então tratadas ou não com TGF-β durante 96 h antes da análise da viabilidade celular ou da caspase 3 activação. Tanto a diminuição mediada por TGF-β-na viabilidade celular (Fig. 3B) e as respostas apoptóticas (Fig. 3C) foram aliviadas pela expressão do core do VHC confirmando os resultados obtidos em hepatócitos de rato.
células isoladas de fresco foram infectadas com lentivírus que codifica as variantes de HCV do núcleo de proteína ou uma sequência núcleo invertido como controle (CTL) (a) Níveis de expressão de núcleo foram estimadas por análise de mancha de pontos de tempo diferentes após a transdução ocidentais lentivírus. (B, C) Determinação da viabilidade das células (B) ou a actividade da caspase 3 (C) foi realizada após 96 h de tratamento com TGF-β (5 ng /ml). Os resultados representam a média +/- desvio padrão de triplicados de uma experiência representativa. * P £ 0,05, *** p≤0.0005.
Embora o TGF-β EMT mediada tenha sido descrita em ratinho ou rato hepatócitos primários, bem como em células cancerosas humanas, nenhum estudo foi ainda investigadas em hepatócitos humanos primários in vitro. Curiosamente, observou-se que os hepatócitos humanos podem expressar fibras de stress como picos localizados principalmente nas saliências de membrana em tratamento de TGF-β (Fig. 4A). Expressão de proteínas de HCV do núcleo aumentou este efeito de TGF-β. Aqui, novamente, a expressão das proteínas de HCV do núcleo aumentou αSMA polimerização, mesmo na ausência de TGF-exogenamente adicionado β. Este efeito pode envolver endógena TGF-β desde que foi completamente abolida na presença do inibidor do receptor de FTC. Para corroborar esse resultado, estudamos a expressão de outro mesenquimais marcador, vimentina. De acordo com os dados obtidos com αSMA, observou-se que em hepatócitos de controlo da expressão de vimentina aumentou marcadamente após o tratamento de TGF-β e que este aumento era maior quando os hepatócitos expressava a proteína de núcleo de NT e ainda maior quando T núcleo foi expresso (Fig. 4A ). Do mesmo modo, as proteínas do núcleo induzidas expressão de vimentina e a polimerização na ausência de TGF-exogenamente adicionado β. Esta expressão foi completamente revertido pelo TGFbRI inibidor sugerindo novamente que produzido endogenamente TGF-β poderia ser responsável por este efeito.
(A) Expressão de αSMA ou vimentina foi estimada por análise de imunofluorescência após tratamento com TGF-β ( 5 ng /ml) ou SB431542 (1 uM). (B) Expressão de fibronectina ou E-caderina foi estimada por análise de Western blot, nas mesmas condições experimentais. Os dados são representativos de três experiências independentes.
Western blots análises evidenciaram uma menor expressão de E-caderina após o tratamento de TGF-β que foi totalmente recuperado na presença do inibidor TbRI. Pelo contrário, a expressão do marcador de fibronectina mesenquimais foi grandemente aumentada por TGF-β (Fig. 4B).
Tomados em conjunto estes dados sugerem fortemente que o núcleo de HCV interferir com as respostas de TGF-β em termos de inibição do crescimento de células e apoptose em hepatócitos isolados a partir de ratinhos transgénicos, bem como hepatócitos primários humanos. Notavelmente, as respostas de TGF-p, em termos de EMT são aumentados de expressão de variantes de proteína núcleo T NT ou em ambos rato e hepatócitos humanos. Isto pode reflectir tanto os efeitos directos de núcleo sobre EMT-TGF-β induzida e a redução de TGF-β apoptose induzida pela proteína do núcleo, permitindo que mais células se submeter EMT, em comparação com células de controlo.
núcleo HCV modula TGF -p respostas em células Huh7
para dissecar os mecanismos moleculares activados pela proteína do core do VHC, estabelecemos linhas celulares que expressam estavelmente o Huh7 proteína do núcleo T (Fig. 5A). proteína do núcleo inibiu a TGF-β mediada por actividade de transcrição medido pela expressão Smad3 nestas células de um plasmídeo repórter, que contém elementos CagA anteriormente mostrado para ser transactivado por TGF-β através proteínas Smad (não mostrado). Consistente com os resultados observados em hepatócitos primários, verificou-se que a proteína do core do VHC foi capaz de diminuir o efeito inibidor de TGF-β sobre a viabilidade celular (Fig. 5B). Do mesmo modo, a apoptose mediada por TGF-β foi reduzida nas células que expressam núcleo de HCV como demonstrado por activação caspase3 (Fig. 5C) ou perda de potencial de membrana mitocondrial, o que representa um outro marcador precoce de apoptose (Fig. 5D).
(A) Expressão da proteína do núcleo de HCV determinado por análise de Western blot. (B, C) As células foram tratadas com TGF-β (5 ng /ml) durante 48 horas antes da determinação da viabilidade das células (B) ou a actividade caspase3 (C). Os resultados representam a média +/- desvio padrão de triplicados de uma experiência representativa. *** P≤0.0005 (D) potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) foi estimada por análise FACS em células tratadas com TGF-β durante 48 h. Após a coloração com DIOC
6 (3), com as células de baixa intensidade de fluorescência correspondente à baixa (ΔΨm) foram fechado e o seu número expresso como uma percentagem do total da população. Um experimento representativo é mostrado. (E) As células foram tratadas com TGF-β durante 48 h e E-caderina ou expressão αSMA foi avaliada por análise de imunofluorescência. Os dados são representativos de três experiências independentes. (F) Expressão comparativa de proteínas do núcleo de HCV. Extractos de células de cultura que expressam a proteína do núcleo (Huh7, hepatócitos primários de rato ou humanos) ou a partir de fígados de doentes com HCC relacionados com HCV foram analisados por Western blot. Anti-p38 western blot foi usada como o carregamento de controle.
Em seguida, determinado processo EMT em linhas de células Huh7 que expressam esta proteína núcleo. os estudos de imunofluorescência mostrou que αSMA foi altamente polimerizado após tratamento com TGF-β associada a uma forte diminuição da caderina-E a partir das membranas celulares (Fig. 5E). αSMA polimerização foi aumentada em células que expressam núcleo. Curiosamente, na presença de proteína do núcleo, fibras αSMA apareceram, mesmo na ausência de TGF-exogenamente adicionado β. A expressão de αSMA foi acompanhada com crescimento independente de ancoragem, o que foi observado na ausência de adicionado exogenamente TGF-β em proteína do core do VHC células que expressam (dados não mostrados).
Tudo em conjunto, estes dados indicam que os efeitos proteínas do núcleo de HCV em respostas de TGF-β observadas em hepatócitos primários foram reproduzidos em uma linha celular de hepatoma humano, que possam, portanto, constituem uma ferramenta útil para dissecar os mecanismos que estão envolvidos na modulação de respostas de TGF-p.
também comparamos expressão essencial de proteínas em nossos modelos de celulares diferentes e em extractos de fígado de pacientes /HCC HCV. A expressão mais forte obteve-se nos hepatócitos humanos, o que é consistente com uma transdução eficiente de lentivírus. A expressão da proteína do VHC núcleo pode também ser detectada em diferentes extractos de fígado, embora em níveis diferentes. Curiosamente, a expressão do núcleo nestes extractos foi comparável à observada em hepatócitos de rato (Fig. 5F).
limiares diferenciais de Smad3 interruptor de activação respostas de TGF-β de supressão do tumor para promoção de tumor
para analisar com mais detalhe a contribuição da activação de Smad nos efeitos do core do VHC em respostas de TGF-β, que feito uso de um mutante do receptor de FTC-β I, TβRImL45Act que retém um domínio cinase constitutivamente activa, mas é incapaz de induzir Smad fosforilação. células Huh7 foram transfectadas com este mutante ou com a forma activada do tipo selvagem de TβRI, juntamente com um plasmídeo que codifica para o núcleo de HCV e GFP para identificar as células transfectadas. Análise por imunofluorescência foi realizada 48 horas mais tarde. .