Abstract

A capacidade de tetra

O

metil do ácido nordihidroguaiarético (M

4 N) para induzir a morte celular rápida em combinação com etoposídeo, rapamicina, ou UCN-01 foi examinado em células LNCaP, tanto em cultura de células e experimentos em animais. Ratos tratados com M

combinações de medicamentos 4N tanto com etoposídeo ou rapamicina mostrou nenhuma evidência de tumor e tinha uma taxa de sobrevivência de 100% 100 dias após a implantação do tumor. Em comparação todos os outros veículos ou ratos tratados única droga não conseguiu sobreviver por mais de 30 dias após a implantação. Esta melhoria sinérgica de efeito anti-cancro também foi confirmada em mais de 20 linhas celulares de cancro. Em células LNCaP, H

4N foi encontrada para reduzir o teor de ATP celular e suprimem a expressão NDUFS1 enquanto induz hiperpolarização do potencial da membrana mitocondrial. M

células tratadas com 4N faltava autofagia com expressão reduzida de BNIP3 e Atg5. Para entender os mecanismos desta atividade anticancerígena de M

4 N, o efeito desta droga em três linhas celulares de cancro (LNCaP, ASPC-1, e L428 células) Foi ainda analisada através de transcriptoma e metabolômica analisa. resultados metabolômica mostrou que houve redução de 26 metabólitos essenciais para a geração e /ou produção de componentes celulares de energia em comum com estas três linhas celulares seguintes 8 horas de M

tratamento 4N. análise de sequenciação de ARN profunda demonstraram que havia dezasseis genes cuja expressão foi encontrado para ser modulada após 6 horas de H

4N tratamento semelhante nestas três linhas de células. Seis desses 16 genes eram funcionalmente relacionados aos 26 metabólitos acima descritos. Um desses genes regulados positivamente codifica para CHAC1, uma enzima chave que afecta as vias de stress através da sua degradação de glutationa. Na verdade M

4 N foi encontrado para suprimir o conteúdo glutationa e induzir a produção de espécies reativas de oxigênio. Os dados global indicam que M

4 N tem profundas repercussões negativas específicas sobre uma ampla gama de metabolismos de câncer de apoio à utilização de M

combinação 4N para tratamentos de câncer

Citation:. Kimura K, Huang RCC ( 2016) tetra

O

Metil ácido Nordihydroguaiaretic Amplamente Suprime o cancro do metabolismo e sinergicamente Induz Strong Anticancer Atividade em combinação com etoposídeo, rapamicina e UCN-01. PLoS ONE 11 (2): e0148685. doi: 10.1371 /journal.pone.0148685

editor: Han-Chung Wu, Academia Sinica, TAIWAN

Recebido: 22 Outubro, 2015; Aceito: 20 de janeiro de 2016; Publicação: 17 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Kimura, Huang. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. Os estudos foram apresentados ao banco de dados NCBI bioamostra e foram atribuídos os seguintes bioamostra Adesões: SAMN04407347 (LNCaP-M4N-RNA), SAMNO4407348 (LNCaP-Ctrl-RNA), SAMN04407349 (AsPC-1-M4N-RNA), SAMN04407350 (AsPC- 1-Ctrl-RNA), SAMN04407351 (L42 8 M4N-RNA) e SAMNO 4407 3 52 (L428-Ctrl-RNA)

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde ( R01DE12165), Biocuremedical, LLC, ea Dorothy Yen Trust (P 690-C25-2407) para RCH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Ru Chih C. Huang é um inventor principal e Kotohiko Kimura é um inventor de um pedido de patente “Termeprocol com 7-Hydroxystaurosporine” (PCT WO 2011/103586 A2 – patente permitido 01 de abril de 2015). Dr. Huang também é um principal inventor de várias patentes JHU no M4N. JHU arrendou a droga (M4N, Terameprocol) relacionados com patentes, mas não este PCT WO 2011/103586 A2 para Erimos Pharmaceuticals até 2017. Isso não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Temos relatado anteriormente que tetra-

O

metil do ácido nordihidroguaiarético (M

4 N), também conhecido como EM1421 e terameprocol, possuía actividades anti-câncer antiviral e [ ,,,0],1-4] e que H

4N poderia ser potencialmente útil como um fármaco anti-cancro. Também mostrou que uma das principais actividades farmacológicas do H

4N foi para inibir a actividade do factor de transcrição de ligação SP1 para regiões ricas em GC (sequências de consenso SP1) de promotores de genes de forma competitiva com SP1 [4]. Verificou-se também que a M

4N, devido a esta actividade, foi capaz de suprimir

expressão regulada CDK1

-SP1 e para causar a paragem do ciclo celular na fase G2 do ciclo celular [4], que parcialmente fornecida uma explicação para

4N induzida actividade anticancerígena H, como o crescimento não regulado é considerada uma das principais características de cancro. Além disso Wang et al. mostrou que a sobre-expressão de desenvolvimento SP1 facilitada e progressão do cancro gástrico [5], o que sugere ainda que a supressão da transcrição regulada-SP1 poderia induzir actividades anticancro. À excepção destes estudos sobre a inibição de transcrição, houve apenas alguns estudos relacionados às atividades farmacológicas de M

4 N. Mais notavelmente Pardini et al. mostrou que o ácido nordihidroguaiarético (NDGA, um composto precursor de M

4 N) inibiu o sistema de transporte de elétrons mitocondrial e suprimiu a fosforilação oxidativa [6-7]. NDGA era um agente anti-cancro candidato, no entanto, acabou por ser provado ser clinicamente inapropriada devido ao seu efeito colateral significativo. Devido à semelhança em termos de estrutura molecular entre H

4N e NDGA (Figura 1A), estes dados relativos NDGA são relevantes para os nossos estudos sobre M

4N. No geral, estes resultados anteriores do M

4 N parecem indicar que M

4 N pode ter várias atividades farmacológicas.

A. Estruturas moleculares de ácido nordihidroguaiarético (NDGA) e tetra-O-metílico do ácido nordihidroguaiarético (H

4N). B: indução da morte celular sinérgica em células de cultura de tecidos de LNCaP. C: controle, E: Etoposide (20 mM), Ra: A rapamicina (20 mM), U: UCN-01 (2 M), M: M

4 N (80 mM), ME: M

4 N + etoposide, MR: M

4 N + A rapamicina, MU: M

4 N + UCN-01. A morte celular foi medida pelo ensaio de TUNEL e ensaio de exclusão de azul de tripano às 24 h após o tratamento. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão em triplicado. C: Um lote de Chou-Talalay para a morte celular de TUNEL positivo induzida por tratamentos de combinação em células LNCaP. índice de combinação (Cl) 1, 1, e 1 indicam sinergismo, efeito aditivo e antagonismo. D: Efeito de tratamentos combinados de H

4N com etoposido ou rapamicina sobre a sobrevivência de ratinhos nus (nu /nu) orthotropically implantados com tumores LNCaP. A percentagem de ratos que sobreviveram até a data após a inoculação do tumor foi mostrado para cada grupo.

M

4 N está atualmente na Fase I /II de ensaios clínicos em doentes com vários câncer avançado [8 , 9]. Os resultados destes ensaios clínicos até agora indicam que M

4N tem um certo grau de actividade anti-cancro, mas foi incapaz de induzir a remissão em qualquer destes doentes com cancros avançados. Uma das mais frequentes tentativa de estratégia para aumentar a eficácia anticancerígena de medicamentos de quimioterapia é o tratamento combinado com um ou mais medicamentos escolhidos de forma adequada [10]. Um achado importante dos ensaios clínicos com M

4 N é que a toxicidade do fármaco foi muito baixo [8, 9]. Os pacientes foram capazes de tolerar doses elevadas de M

4 N com o mínimo de efeitos colaterais, o que torna esta droga muito adequado para ser uso em tratamentos multidroga (por exemplo, o LD

50 de M

4 N para os ratos é maior do que 1000mg /kg enquanto que a de NDGA é de apenas 75 mg /kg [11, 12]). A otimização dos tratamentos multidroga requer profundo conhecimento sobre os mecanismos farmacológicos de ações anticancerígenos dos fármacos a serem utilizados em combinação. No entanto, o mecanismo exacto da actividade anti-cancro de H

4N ainda é em grande parte desconhecida. A dificuldade na compreensão da farmacologia do M

4 N está enraizada no fato de que esta droga pode ser esperado para influenciar várias actividades bioquímicas desde a sua fator alvo farmacológico, transcrição SP1, controla um grande número de genes de manutenção da casa [13]. Por uma questão de fato, uma pesquisa de 22,633 genes conhecidos no banco de dados Ensemble Genoma Humano (https://www.ensembl.org/index.html) indicou que pouco mais de metade (52,5%) continham o motivo de ligação em sua imediato SP1 regiões a montante (500pb).

neste estudo, nós primeira exercido os nossos melhores esforços para encontrar certas combinações de drogas com M

4 N que alcançou eficácia anticancerígena promissora em cultura de tecidos e as experiências do rato de xenotransplante. Através destes esforços, descobrimos com sucesso que M

tratamentos combinados 4N com Etoposide e Rapamicina foram capazes de erradicar completamente os tumores derivados LNCaP ortotopicamente implantado e metástase em ratos nus. O M

ratinhos tratados combinação 4N tinha uma taxa de sobrevivência de 100% 100 dias após a implantação do tumor. Em comparação todos os outros veículos ou ratos tratados única droga não conseguiu sobreviver por mais de 30 dias após a implantação. Isto ilustrou a capacidade potencial extraordinário de M

4 N para melhorar a eficácia anticancerígena por tratamentos combinados. Para compreender os mecanismos farmacológicos envolvidos, foram examinados os efeitos bioquímicos e fisiológicos de H

tratamento 4N em células cancerosas com o auxílio de métodos de rastreio de alta produtividade, tais como (espectroscopia de cromatografia de massa de cromatografia gasosa /líquido) CG /EM-CL ensaio metabólito baseado e seqüenciamento RNA profundo. Uma vez que, as moléculas-alvo de M

4 N poderia ser numerosos, devido à natureza da sua actividade farmacológica como um inibidor SP1, o rastreio de alto rendimento com o seu poder de recolher informações sobre o estado de um grande número de metabolitos e mRNA em uma vez foi muito útil para decifrar a natureza complexa da

atividade 4N M. O nosso estudo até agora demonstrou que houve uma redução substancial de metabolitos essenciais para o crescimento do tumor em todas as linhas celulares três cancerosas estudados após um curto período de H

tratamento 4N, e que a indução sinérgica de clivagem de caspase e da produção de espécies de oxigénio reactivo rápido ocorreu quando M

4 N foi utilizado com segundas drogas anticâncer em combinação.

resultados

indução sinérgica de efeito anticancerígeno por M

tratamentos combinados baseados em 4N

Foram avaliados o uso de M

4 N em vários tratamentos de combinação de drogas usando experimentos de cultura de células e estudos do rato de xenotransplante nus. Nesses estudos, foi utilizada a linha celular de cancro da próstata humano LNCaP como um material experimental principais, uma vez que tem sido utilizado em modelos animais de cancro da próstata metastático [14]. Além disso, tem sido mostrado que mutações genéticas do cancro frequentemente ocorreu na linha celular LNCaP [15], sugerindo que esta linha celular se comporta de modo semelhante aos cancros em contextos clínicos que muitas vezes sofrem várias mutações do gene durante a sua progressão [16]. Como uma experiência piloto para determinar os medicamentos mais adequados para ser usados ​​em combinação com M

4N para aplicações clínicas, foram selecionados três drogas anti-cancro, ou seja, Etoposide [17], rapamicina [18], e UCN-01 [19] e eficácia anticancerígena avaliada de tratamentos de combinação com estes medicamentos em células LNCaP utilizando tanto o ensaio de TUNEL e ensaio de exclusão de azul de tripano. Os resultados (Fig 1B) indicaram que o M

4N induzida morte celular sinergicamente com todas as três drogas anti-cancro examinadas. A trama Chou-Talalay [20] confirmou que todos os tratamentos combinados eram muito sinérgica (Fig 1B). Além disso, a quantidade de morte celular detectada por ensaio de exclusão de azul de tripano ultrapassou que detectado pelo ensaio de TUNEL (Figura 1A), indicando que a morte celular de TUNEL-negativo desempenhou um papel importante na morte celular sinérgica, especialmente em M

4N tratamento de combinação com rapamicina. Os tratamentos combinados foram eficazes em um painel de linhas celulares de cancro que foram escolhidas pela sua diversidade genética (Fig S1). morte sinérgica, no entanto, não foi observado em células HL-1, uma linha de células de músculo cardíaco de rato normal (os nossos dados não publicados). índice de redução da dose (DRI) para células LNCaP foi mostrado em S2 Fig. O benefício dos tratamentos de combinação também foi avaliada utilizando ratinhos com tumores de xenoenxerto de LNCaP. A curva de taxa de sobrevivência (Fig 1D) indicaram que todos os ratinhos portadores de tumores de LNCaP que receberam uma combinação de H

4N com etoposido ou rapamicina sobreviveram além de 100 dias após implantação do tumor, enquanto que nenhum dos pacientes tratados com uma única droga sobreviveram além de 34 dias devido a metástases múltiplas [21]. Além disso vários outros experimentos ratos de xenotransplante confirmou que M

tratamentos combinados baseados em 4N foram eficazes em muitas outras do que as células LNCaP [22] linhas celulares de cancro. Os dados mostraram, em geral uma superioridade dos tratamentos de combinação em comparação com tratamentos com drogas individuais e também mostrou que M

4 N pareceu funcionar bem com vários medicamentos cujos mecanismos da sua actividade anticancerígena farmacológico eram muito diferentes uns dos outros.

o tratamento combinado com M

4 N induz caspase-7 clivagem

Para explorar possível envolvimento de caspases em mecanismos de morte celular de M

combinação 4N tratamentos [23], examinamos o perfil de clivagem caspase em células LNCaP seguintes single-drogas (M

4 N, Etoposide, rapamicina, ou UCN-01) e M

combinação 4N (M

4 N /Etoposide, M

4 N /A rapamicina, e M

4N tratamentos por análise de Western blot /UCN-01). Após os tratamentos de droga única, UCN-01, mas não etoposídeo ou rapamicina caspases-9, -3 e -7 (Fig 2Aa e 2AB) activado fortemente. Por outro lado, foi detectada apenas uma pequena quantidade de caspase-9 e a actividade -3 sequência de um dos M

tratamentos de combinação 4N (Fig 2aa). Aparentemente, H

4N interferiu com a capacidade da UCN-01 para activar caspase-9 e -3. Pelo contrário, a análise de Western blot de caspase-7 (Fig 2Aa) demonstraram que M

4N não impedir a clivagem de caspase esta por UCN-01. Além disso, a clivagem de caspase-7 também ocorreu na sequência H

4N /tratamento de etoposido e, em menor extensão seguinte H

4N /tratamento de Rapamicina (fig 2Aa e 2AB). O ensaio colorimétrico para a actividade da caspase-7 (Fig 2B) confirmou os resultados da análise de Western blot (Fig 2aa e 2AB). Estes dados indicaram geral que a caspase-7 tratamentos combinados activado muito mais do que qualquer tratamento medicamentoso único. Curiosamente, quer a UCN-01, ou qualquer tratamento do H

4N tratamentos de combinação produziu dois diferentes fragmentos de caspase-7, um grande (P30) e um fragmento pequeno (p17) (Fig 2Aa e 2AB). Boucher

et al

. mostraram que uma das principais funções da caspase-7 foi de clivar e inactivar a polimerase poli-ADP ribose (PARP) [24]. Por esta razão, nós examinamos a clivagem de PARP nas células tratadas com M

tratamentos combinados baseados em 4N. Os dados (Fig 2AA) mostrou que, em geral significativamente maior clivagem PARP foi observado para as células tratadas com tratamentos de combinação do que tratamentos com drogas individuais. Além disso os dados também mostraram que o tratamento de combinação de H

4N com etoposido ou UCN-01 produziram uma quantidade maior de ambos os fragmentos de p89 e p24 do que com rapamicina. Estes dados concordaram com os dados para a caspase-7-(Fig 2A e 2B), indicando que a actividade da caspase-7 foi maior com o tratamento de combinação contendo etoposido ou UCN-01 do que com rapamicina

AB:. Análise de caspase mecanismos de morte celular dependentes induzidos por tratamentos de combinação de H

4N com etoposido, rapamicina, ou UCN-01. Aa AB: A clivagem de caspase-3, -4, -7, -9 e juntamente com poli-ADP ribose polimerase (PARP) em células de LNCaP tratadas com os tratamentos de combinação durante 17 h. p-actina foi utilizado como um controlo. B: A caspase-7 a actividade enzimática em células LNCaP tratadas com os tratamentos de combinação durante 13 h. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão em triplicado. A B: C: controlo, E: O etoposido (10 uM), Ra: Rapamicina (10 uM), Ra30μM: Rapamicina (30 uM), L: a UCN-01 (2 mM), M4N: H

4N (80 uM ), e Casp: Caspase. C: Efeito de tratamentos combinados no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ

m). As células LNCaP foram tratados com M

4N (80 uM) em combinação com etoposido (10 uM), Rapamicina (10 uM), ou UCN-01 (2 mM) durante 4 h. O ΔΨ

m foi medida utilizando JC-1 de corante. A imagem mostra as relações obtidas dividindo a intensidade a 568 nm-excitação de luz (J-agregados) por que a 488 nm de luz-excitação (J-agregados + monômero). A barra de cores é mostrada no lado direito da figura (H: alto, L: baixo ratio).

A ativação do mecanismo de morte celular /3 dependente de 9 caspase associada à mitocôndria é geralmente associada com a despolarização do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ

m) [25]. Por esta razão, ao lado conduziram experimentos usando JC-1 corante para medir a ΔΨ

m (Fig 2C). As experiências de JC-1 de corante mostrou que a UCN-01, mas não o tratamento ou etoposido Rapamicina tratamento induziu a despolarização da ΔΨ

m de um curto período de tempo. Mais importante que também mostrou que M

4 N hiperpolarização induzida do ΔΨ

m e impediu despolarização da ΔΨ

m induzida por UCN-01.

M

tratamento 4N sub-regula autofagia

autophagy é um processo que degrada os componentes celulares danificados ou desnecessárias para a finalidade de reciclá-los como recursos, e é activado pelas condições de privação de nutrientes como uma parte dos mecanismos de defesa celular [26]. expressão LC3B-II é amplamente conhecido correlacionar-se bem com a actividade autophagic e utilizado como um indicador para autofagia [27] Os dados .western blot (Fig 3A) mostraram que M

4N suprimida a formação de líquido LC3B-II quase completamente, o que indica que M

4 N inibida autofagia. Em seguida examinámos o efeito de H

4N em expressão de BNIP3 por Northern e a transferência de Western. BNIP3 é uma proteína somente de BH3 e é conhecido por estar envolvido em ambos apoptose e autofagia [28-30]. Porque BNIP3 é induzível por hipóxia, sua expressão foi analisada tanto em condições de normóxia e hipóxia. O tratamento com H

4N durante 6 h eficazmente reduzidas tanto de ARNm e a expressão da proteína de BNIP3 (Fig 3B e 3C), indicando que H

4N suprimida

expressão BNIP3

ao nível da transcrição. Os dados também mostraram que M

4N foi capaz de suprimir a basal, bem como a expressão induzida por hipoxia de

BNIP3

a quase nula (Fig 3C). Além disso, a transferência de Western (Fig 3C) indicaram que o M

4N não alterou a expressão de BNIP3L, uma proteína relacionada com BNIP3 [28]. O efeito de H

4N sobre a expressão de Atg5, um componente chave para máquinas autofagia [31], foi então examinada e análise de mancha de Western (Fig 3D) indicaram que o M

4N suprimiu significativamente a expressão Atg5 em menos de 18 h . Os dados assim demonstrado que M

4 N suprimida autofagia modulando vários componentes celulares cruciais para mecanismos de autofagia como Atg5 e BNIP3

A:. Efeito do M

4 N em autofagia em células LNCaP. A expressão de LC3B-I e II foi examinada pela transferência de Western em células LNCaP tratadas com tratamentos de combinação de H

4N com etoposido, rapamicina, ou UCN-01 durante 18 h na presença de bafilomicina

1 ( 100 nM), um inibidor da degradação autophagosome. Bafilomicina A

1 foi adicionado para medir a atividade líquida de autofagia. As concentrações de H

4N, etoposido, rapamicina, e a UCN-01 foi de 80, 20, 20, e 5 uM, respectivamente. C: Controle, E: etoposídeo, Ra: rapamicina, U: UCN-01. B: A expressão de mRNA de

BNIP3

gene, examinado por transferência Northern, em células LNCaP tratados com M

4 N (80? M) sob normóxica ou condição hipóxica para 2 ou 6 h. Hyp: condição hipóxica. C: A expressão de BNIP3 e BNIP3L, examinado pelo western blot, em células LNCaP tratados com M

4 N (80? M) sob normóxica ou condição hipóxica para 6 ou 18 h. D: A expressão de Atg5, analisada pelo Western blotting, em células LNCaP tratadas com M

4N (80 uM) durante 18 h. β-actina foi usado como um controle.

M

4 N amplamente modula vias metabólicas

Para entender o mecanismo de sinergia no efeito anticancerígeno (Fig 1, S1 Fig) , conteúdo celular dos metabolitos bioquímicos e perfis para mRNA foram examinados em busca de possíveis alterações fisiológicas seguintes M

tratamento 4N em câncer de próstata humano LNCaP, ASPC-1 câncer pancreático humano e L428 células de linfoma Hodgkin humanos. Em primeiro lugar, examinou o efeito do H

4N em teores de metabolito nestas células (realizada por Metabolon, Co. Ltd) [32]. O ensaio de metabolito (S1 Tabela) mostrou grandes influências de H

4N em várias vias metabólicas. Uma vez que a escassez de metabolitos específicos tem impactos mais substanciais sobre a fisiologia celular do que a abundância de-los, foram selecionados os metabolitos cujo conteúdo celular foram consistentemente reduzido por M

4 N em pelo menos duas das três linhas celulares e unchange ou indeterminados na terceiro (Fig 4).

LNCaP, AsPC-1 e L428 células foram tratadas com M

4N (80μM) durante 8 h e o metabolito conteúdo das amostras foram medidos por LC /espectroscopia de massa GC por metabolon (Tabela S1). Entre os metabolitos examinados, apenas os metabolitos cujos conteúdos foram significativamente (p £ 0,05) suprimiu por M

4N em, pelo menos, duas das três linhas celulares foram seleccionadas e aqui sob a condição adicional de que o efeito do H

4N sobre o conteúdo de metabolitos na terceira linha de células era de uma supressão, nenhuma mudança significativa, ou não examinada. ‘H /C »indica a proporção de teores de metabolito para as amostras tratadas com M

4N vs. controlo. N.A. indica “dados não disponíveis”. As excepções para estas regras foram ADP e UDP-glucose (cujos conteúdos foram ambos suprimida por M

4N em duas das três linhas celulares, mas a diferença foi estatisticamente significativa apenas em uma das duas linhas de células. Na terceira linha celular os dados não estavam disponíveis). Os números para a relação sombreada em verde indicam que o conteúdo de metabólitos foram estatisticamente menor nas amostras tratadas do que o controle enquanto que aqueles sem máscaras indicam que não houve diferença estatística entre o controle e as amostras tratadas.

metabolitos relacionados com o ciclo de TCA (Muitos citrato, succinato, fumarato, malato e) foram esgotadas por M

4N tratamento (Figura 4). Apenas o conteúdo de α-cetoglutarato foi aumentado ligeiramente por M

4 N entre os metabólitos relacionados-TCA-ciclo (S1 tabela). O efeito de H

4N em glicólise metabolitos relacionados /-gluconeogénese foi variável, dependendo da linha celular (S1 Tabela), embora o teor de glicose-6-fosfato e glucose-1-fosfato foi consistentemente reduzida em H

4N tratamento (Figura 4). A glicose-1-fosfato é convertido em UDP-glucose pelas reacções glucosiltransferase com UTP. O teor de UDP-glicose e UTP foi reduzido por M

4N, bem como (Fig 4), indicando que os metabolismos relacionadas com glucose-6-fosfato /glucose-1-fosfato /UDP-glucose foram global suprimida por M

4 N. O teor de 3-fosfoglicerato, um metabolito chave na via glicólise /gluconeogénese, foi significativamente aumentada por M

4N em células LNCaP, mas não em AsPC-1 ou L428 células, enquanto que o teor de piruvato, o que também é uma tecla metabolito glicólise, foi significativamente aumentada por M

4N em células AsPC-1 e L428, mas não em células LNCaP (S1 tabela). Isto indicou que, embora o efeito do H

4N em metabolitos relacionados com a glicólise foi variável dependendo linhas celulares, H

4N glicólise parado em todas as três linhas celulares examinadas e acumulado alguns metabolitos relacionados com a glicólise, tais como 3-fosfoglicerato e piruvato. Enquanto isso, o teor de lactato foi consistentemente reduzida em H

4N tratamento (Figura 4), o que indica que a conversão de piruvato em lactato foi suprimida por M

4N. Em conclusão, os dados relacionados ao metabolismo de carboidratos (Fig 5A) global mostrou que M

4 N reduziu o teor de metabólitos no domínio do ciclo do TCA, enquanto acumulando certos metabólitos relacionados com a glicólise, e assim induzida cataplerosis (cataplerosis é definida aqui como um metabólica condição que ocorre sob a escassez de metabólitos no domínio do ciclo do TCA) [33]

a:. Um esquema para glycolysis-, TCA-cycle- e transporte de elétrons via metabólica relacionada com o sistema mitocondrial. Os dados brutos do ensaio de metabolito é mostrado na Tabela S1. A selecção de S1 Tabela pode ser encontrado na figura 4. As setas para cima indicam que o conteúdo dos metabolitos associados com essas setas foram significativamente (p £ 0,05) induzida por H

4N em, pelo menos, duas das três linhas de células (LNCaP, AsPC-1, e L428 células), sob a condição adicional de que o efeito do M

4 N sobre o conteúdo destes metabolitos na terceira linha celular foi uma indução, sem diferença estatisticamente significativa, nenhuma mudança significativa, ou não examinou . Enquanto isso, as setas que apontam para baixo, indicam que o conteúdo dos metabolitos associados com essas setas foram significativamente (p £ 0,05) suprimida por M

4N em, pelo menos, dois de três linhas de células (LNCaP, AsPC-1, e células L428) sob a condição adicional de que o efeito do H

4N sobre o conteúdo destes metabolitos na terceira linha de células era de uma supressão sem diferença estatística significativa, sem alteração significativa, ou não examinada. As exceções para estas regras são glicose-6-fosfato (cujo conteúdo foi suprimida por M

4 N em todas as três linhas celulares, mas a diferença foi estatisticamente significativa apenas na L428 células), 3-fosfoglicerato (cujo conteúdo foi significativamente induzida por M

4N em LNCaP, mas não em células AsPC-1 e L428) e piruvato (cujo conteúdo foi significativamente induzida por H

4N em células AsPC-1 e L428 mas significativamente suprimida em células LNCaP). 3-fosfoglicerato e piruvato são marcadas com setas para cima associados porque os dados (S1 tabela) indicou que M

4 N acumulado destes metabolitos e glicólise parado, embora como M

4 N afetados destes metabolitos foi variável dependendo da linha celular (veja o texto). O efeito de H

4N em teor de ATP em células intactas é mostrado na Figura 6A. O efeito de H

4N em expressão NDUFS1 é mostrado na Fig 6C. O resultado que indica o aumento na expressão do mRNA da fosfoenolpiruvato carboxicinase 2 (PCK2) e asparagina sintetase (ADN) por tratamento H

4N (80