Abstract

vias envolvidas na síntese do ácido gama-aminobutírico do neurotransmissor ( GABA) têm sido implicados na patogénese de alto grau (neuroendócrinos) NE neoplasias, bem como neoplasmas de uma linhagem não-NE. Usando o Cancer Genome Atlas, a sobre-expressão da enzima sintética GABA, glutamato descarboxilase 1 (

GAD1

), foi encontrado para ser associado com a diminuição da doença sobrevida livre de no adenocarcinoma de próstata e diminuição da sobrevida global na célula renal carcinoma de células claras . Além disso,

GAD1

foi encontrado para ser expresso em linhas celulares de cancro da próstata de castração-resistentes, mas não linhas celulares responsivos aos andrógenos. Usando um romance ensaio de microplaca enzimático acoplado a fluorescência para GABA mediada através da redução da resazurina em um carcinoma neuroendócrino de próstata (PNEC) linha celular, o estresse induzido por microambiente ácido aumentou os níveis de GABA, enquanto o estresse induzido por microambiente alcalina diminuiu GABA através da modulação da GAD1 e glutamina sintetase (GLUL) atividades. Além disso, a glutamina, mas não a privação de glicose diminuída GABA através da modulação da GLUL. Consistente com a evidência em organismos procariotas e eucariotas que a síntese de GABA mediada através GAD1 pode desempenhar um papel crucial em sobreviver o stress, o GABA pode ser um importante mediador da sobrevivência de stress em neoplasmas. Estes resultados identificam a síntese de GABA e metabolismo como um caminho potencialmente importante para regular a resposta ao estresse celular câncer, bem como um alvo potencial para estratégias terapêuticas

Citation:. Ippolito JE, Piwnica-Worms D (2014) A fluorescência-Coupled ensaio para ácido gama-aminobutírico (GABA) revela modulação induzida pelo estresse metabólico de conteúdo GABA em Câncer neuroendócrino. PLoS ONE 9 (2): e88667. doi: 10.1371 /journal.pone.0088667

editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Outubro, 2013; Aceito: 15 de janeiro de 2014; Publicação: 13 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ippolito, Piwnica-Worms. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado por doações da Sociedade Radiológica da América do Norte (RR1031; https://www.rsna.org) e os Institutos Nacionais de Saúde (P50 CA94056). O núcleo HTS é apoiado em parte por uma subvenção para o Siteman Cancer Center (P30 CA091842). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução sistema

o neuroendócrino (NE) é uma rede difusa de células distribuídas por vários tecidos e órgãos que podem produzir efeitos locais ou sistêmicos sobre a fisiologia através da secreção de hormônios ou neurotransmissores. Embora algumas células surgem a partir da crista neural, a maioria são derivados a partir de células progenitoras multipotenciais epiteliais [1]. Neuroendócrinos (NE) carcinomas, que se acredita surgir a partir do sistema de NE, ocorrem em praticamente todos os locais anatômicos e exibir um amplo espectro de comportamentos fenotípicas de benigno a metastático [2], [3]. Por exemplo, tumor carcinóide “clássicos” ou carcinomas NE de baixo grau são bem diferenciado, tem um baixo índice mitótico, e assemelham-se hiperplasia das células NE [2], [3], enquanto o carcinoma de pequenas células ou carcinomas NE alto grau são agressivos e fracamente diferenciado [4] – [9]. carcinomas NE alto grau caracteristicamente têm inúmeras áreas de necrose, um alto índice mitótico [2], [3], e um mau prognóstico. terapias convencionais não melhoram a sobrevida do paciente em pacientes com carcinoma de alto grau NE [10].

Os adenocarcinomas, que são muito mais comuns, surgem a partir de uma origem epitelial e exibir um padrão de crescimento glandular [11]. Curiosamente, os adenocarcinomas podem exibir características NE caracterizado molecularmente quanto a expressão de produtos de genes associados com a linhagem de células NE. Este fenómeno foi demonstrado em muitos tipos de adenocarcinomas, incluindo os de pulmão, próstata e cólon, e correlaciona-se com a agressividade do tumor, metástase, e sobrevivência encurtado [12] – [19]. Especificamente, no caso do cancro da próstata, a expressão de NE apresenta positivamente correlacionada com o crescimento do potencial metastático e resistente à castração [19] – [21]. Infelizmente, a biologia das células NE, bem como as suas contribuições para a homeostase órgão permanecem incompletamente definidos, em parte devido à escassez destas células em órgãos normais [22].

Anteriormente, foi utilizada uma combinação de expressão do gene perfilamento, espectrometria de massa, e espectroscopia de ressonância magnética nuclear, para elucidar uma série de redes metabólicas implicados em cancros NE agressivos utilizando um modelo de ratinho geneticamente modificadas de carcinoma NE próstata metastático, e uma linha celular derivada da próstata NE carcinoma (PNEC), em que o cryptdin 2 promotor conduza a expressão do antígeno oncogênico grande T (CR2-tAG) [13], [23] – [25]. Os resultados destas análises identificado a síntese e o metabolismo de ácido gama-aminobutírico (GABA) derivada a partir de ambos os ácidos (TCA) os intermediários e poliaminas ciclo tricarboxílicos (colectivamente referidos como o shunt GABA) como uma rede metabólica proeminentemente-se regulada em carcinomas NE agressivos [ ,,,0],13].

instrumentação especializada moderna utilizada para análises metabólica, tais como espectrometria de massa (eM) e de ressonância magnética nuclear (RMN) são caros, requerem formação significativa de operar, e pode não ser facilmente disponível para muitos laboratórios académicos . Classical baseada enzimática quantificação metabólito, por outro lado, fornece um meio acessível, sensível custo-benefício para análise quantitativa de metabolitos [26]. Embora incapaz de fornecer informações simultâneas sobre as quantidades de vários metabólitos, quantificação enzimática oferece a capacidade de quantificar simultaneamente um determinado metabólito em muitas amostras em uma plataforma de alto rendimento [27] – [29].

A piridina nucleotide- ensaios enzimáticos base que par a produção de NADH ou NADPH (colectivamente referidos como o NAD (P) H) a uma reacção bioquímica são atraentes, uma vez que estes nucleótidos reduzidos fluorescência e pode, portanto, ser utilizado para a leitura quantitativa dos níveis de actividade de enzimas ou metabolitos. No entanto, o fundo de fluorescência em tecidos biológicos pode limitar a sensibilidade de detecção de NAD (P) H [26].

Várias estratégias para melhorar a saída fotónica e melhorar a sensibilidade das reacções enzimáticas têm sido desenvolvidos [26], [ ,,,0],30] – [32]. Uma estratégia envolve o acoplamento de NAD síntese H (P) para mitocondrial lipoyl desidrogenase (diaforase) que activa substratos químicos para ensaios cromogénicos ou fluorescentes. Resazurina é um desses compostos que podem ser utilizados para ensaios de viabilidade celular enzimaticamente acoplados e [27], [33], [34]. Aqui, nós relatamos um ensaio enzimático romance para a quantificação de GABA e usar com sucesso este ensaio para caracterizar mudanças na GABA celular em células PNEC sob estresse metabólico.

Materiais e Métodos

Reagentes

Todos os reagentes químicos e enzimáticos foram adquiridos da Sigma.

Cultura de células

mycoplasma

Todas as linhas celulares que são rotineiramente testados negativo. Todas as linhas celulares foram cultivadas a baixa passagem sob condições convencionais de acordo com protocolos ATCC em um 95% de O

2/5% de CO

2 incubadora a 37 ° C. Um subclone de auto-fixação da linha de células do cancro da próstata neuroendócrinos (PNEC) [35] foi cultivada como anteriormente descrito [36]. Resumidamente, meio DMEM /F12 (Invitrogen) foi suplementado com calor a 10% de FBS inactivado (Gibco), aminoácidos não essenciais a 1% (NEAA, Gibco), suplemento de soro B27 (Invitrogen), 5 ng /ml de EGF (BDBiosciences), 5 ng /ml de bFGF (Sigma), e ácido 4- -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) tampão de (2-hidroxietil) 15 mM (Gibco). Todas as células foram cultivadas até um máximo de 75% de confluência. As células foram tripsinizadas, neutralizou-se com meio de crescimento e passadas. Os sedimentos de células para ARN ou ensaios bioquímicos foram centrifugadas a 125 x g durante 5 min a 4 ° C. As células foram lavadas com fosfato de gelo frio solução salina tamponada, e centrifugou-se novamente. Os sobrenadantes foram aspirados e os sedimentos congelados rapidamente em azoto líquido. Todas as amostras foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.

Avaliação das curvas de sobrevida de The Cancer Genome Atlas (TCGA)

O cBioPortal para o cancro Genomics [37], [38], desde através de The Cancer Genome Atlas Portal de dados foi utilizado para acessar e visualizar conjuntos de dados clínicos e expressão gênica de adenocarcinoma de próstata humana [39] e carcinoma de células renais de células claras humana [40]. Somente a “expressão de mRNA z-scores vs. Normais” opção foi marcada. Foram selecionados “Todos os tumores” para a consulta. RNA-Seq dados foi utilizado para os conjuntos de dados de carcinoma de células claras. As curvas de sobrevivência foram avaliadas com base na expressão de genes no interior da ponte de GABA. Amostras que exibiram aumento da

GAD1

expressão (escore z 2 ou 3) e diminuição da

GLUL

expressão (z -2) foram identificados e informação clínica exportado. As curvas de sobrevida foram construídas com GraphPad Prism.

Tempo Real PCR Primer Design by

Primers para PCR em tempo real foram projetados usando PrimerBLAST.

GAD1

(NM_000817.2), mas não 18S rRNA (

RNA18S5

; NR_003286.2), foi concebido através de uma junção intron-exon. primers selecionados não têm qualquer amplificação previu fora do alvo no genoma humano. temperaturas de fusão de iniciadores foram concebidos entre 61 ° C e 63 ° C. Os iniciadores foram testados por PCR a partir de ADNc sintetizado a partir de linhas de células LNCaP NCI-H660 e. Os amplicons de comprimento esperado (GAD1:145 pb; 18S: 182 pb) foram obtidos a partir de preparações de ADNc e não eram evidentes em reacções de PCR utilizando ADN genómico como molde apenas uma ou água. Derreter curvas e as eficiências de amplificação de todos os pares de iniciadores foram realizadas. As sequências dos iniciadores são os seguintes:

GAD1

(para a frente): 5′-ATGGGGTTCGCACAGGTCATCC-3 ‘,

GAD1

(reverso): 5′-TCCATGAGGACAAACACTGGTGCA-3′;

RNA18S5

(para a frente): 5′-GGGCATTCGTATTGCGCCGC-3 ‘,

RNA18S5

(reverso): 5’GAATAACGCCGCCGCATCGC-3′.

PCR em Tempo Real

o ARN foi isolado a partir dos sedimentos celulares congelados de encaixe, utilizando o kit RNeasy (Qiagen). Após a extracção do ARN, todas as amostras de RNA foram divididos em alíquotas e armazenado a -80 ° C. Todas as amostras de RNA foram tratadas com ADNase TURBO (Ambion) para a remoção de ADN genómico. Todos os ARN utilizados para PCR quantitativo foi imediatamente transcrito inversamente com o estojo iScript (BioRad). A pureza do cDNA foi avaliada por amplificação de PCR do rRNA 18S da amostra de ADNc e uma amostra de controlo negativo de ARN que faltava a transcriptase reversa. Todas as amostras utilizadas para as experiências subsequentes QPCR não têm contaminação detectável de ADN genómico, tal como evidenciado por uma falta de uma 18S amplicão seguinte 40 ciclos da reacção sem transcriptase inversa. Cada amostra foi testada em triplicado a 50 ng de cDNA. PCR em tempo real foi realizado com SYBR mistura verde mestre (BioRad) e uma concentração de 100 nM de iniciador específico fixado em um instrumento Bio-Rad CFX96 de PCR (95 ° C durante 10 min, depois 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s , 61 ° C durante 1 min, e 74 ° C durante 1 min). primers 18S rRNA foram utilizados como padrão interno.

Experimentos estresse metabólico

Para experiências de privação de nutrientes, na falta de glicose, foi utilizado meio DMEM /F12 piruvato, e glutamina (USBiological). O meio foi suplementado com os seguintes componentes: inactivado pelo calor soro dialisado com um limite de exclusão de 10 kDa de peso molecular (Sigma), aminoácidos não essenciais a 1% (NEAA, Gibco), 5 ng /ml de EGF (BDBiosciences), e 5 ng /mL bFGF (Sigma). Glicose e glutamina (Gibco) foram suplementados com os meios de comunicação especializados, quando necessário. A glucose foi adicionada ao meio de utilização de concentrações padrão de formulação de DMEM /F12 de 17,5 mM. A glutamina foi usada a 6 mM. Antes da experiências de stress metabólico, as células PNEC foram plaqueadas a uma densidade de 400000 células por poço numa placa de 12 poços com 1,5 ml de meio de crescimento normal. As células foram deixadas crescer durante 24 horas. Meios foi então trocado por meio de estresse 1,5 mL. Para todas as experiências stress do pH, o meio de crescimento convencional PNEC foi utilizado sem tampões HEPES e bicarbonato ou foi modificado como se segue. Para o stress, ácido 2 – (

N

-morfolino) etanossulfónico (MES), pH 6,5 foi adicionado para uma concentração final de 20 mM. Para pH convencional, HEPES, pH 7,4 foi adicionado para uma concentração final de 20 mM e bicarbonato de sódio adicionada para uma concentração final de 0,34 g /L. Para o stress alcalina, tris (hidroximetil) aminometano (Tris) pH 8,5 foi adicionado para uma concentração final de 20 mM e bicarbonato de sódio adicionada para uma concentração final de 0,34 g /L. As células foram então incubadas numa câmara humidif içada, sem CO

2 a 37 ° C durante 24 horas.

Preparação de amostras

A preparação das amostras para o ensaio enzimático foi modificado a partir de métodos anteriormente descritos [13 ], [26]. Para as experiências de stress, o meio foi rapidamente aspirada a partir dos poços e as células foram lavadas com 1 mL de PBS. Para as experiências de ácido e de base de stress, os poços foram lavados com solução salina tamponada ao pH apropriado com MES 20 mM de HEPES ou como acima. As células foram então submetidas a lise em 200 uL solução gelada de lise (50 mM de hidróxido de sódio e 1 mM de EDTA) e suavemente agitada durante 30 seg. Um volume igual de ácido clorídrico a 100 mM foi então adicionada para acidificar o lisado. As placas foram cobertas com o adesivo vedante filme PCR e incubada num banho de água a 60 ° C durante 30 minutos para destruir a actividade da enzima endógena, bem como NADH endógeno. A seguir à incubação, as placas foram brevemente centrifugadas a 100 x g (Allegra 6R; Beckman Coulter-) para eliminar o condensado. O filme foi removido e 100 ul de 400 mM de Tris base foi adicionada a cada poço, para um volume total de 500 uL em cada lisado (pH final de cerca de 8) bem. Os lisados ​​foram centrifugados a 15000 x g durante 5 minutos para sedimentar os detritos e os sobrenadantes foram recolhidos e congelados a -80 ° C até à sua utilização.

Ensaio Baseado em Resazurina para GABA e succínico semialdeído Determinação

Após optimização reagente, o mastermix para quantificar GABA e semialdeído succínico (SSAL) em amostras consistiu de 0,063 U /ml GABase, 0,063 U /mL de diaforase, 6,25 uM resazurina, 100 uM de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP), 5 mM de alfa-cetoglutarato , e 3,125 uM ditiotreitol (DTT) em 100 mM de base Tris, pH 8,8. O mastermix foi feito fresco antes de cada experiência.

Um mastermix para quantificar única SSAL incluídos os reagentes acima, bem como sulfato de hidrogénio de 50 mM de 2-aminoetilo, um inibidor da transaminase de GABA o componente da preparação de enzima GABase. O inibidor foi adicionado ao mastermix durante 10 minutos à temperatura ambiente antes da adição de mastermix para as amostras. Uma preparação fresca do inibidor foi preparado previamente para todas as experiências.

aliquotas de amostras (10 ul) foram adicionados a poços de uma placa de cultura de preto 96 poços de fundo claro (Costar), seguido pela adição de 90 uL de MasterMix com uma pipeta de canais múltiplos electrónico. Duas aliquotas da mesma amostra foram usadas para a determinação do GABA total mais SSAL ou SSAL sozinho na mesma placa. A menos que especificado de outro modo, a reacção foi conduzida à temperatura ambiente e foi protegida da luz durante 30 minutos. O sinal obtido a partir resorufina, o produto fluorescente de resazurina, foi quantificada utilizando um leitor de microplacas Fluostar Optima (BMG Labtech) com 544 nm de excitação /590 conjunto de filtros de emissão nm (ganho, 1327; 10 flashes por poço). análises cinéticas foram realizadas com 1 hora ciclos.

O sinal de GABA total mais SSAL em cada amostra foi subtraído a partir do sinal sozinho SSAL para obter o sinal de GABA. As curvas padrão para o GABA e SSAL foram construídos para a quantificação e foram corrigidos para a reacção em branco com e sem a presença de hidrogenossulfato de 2-aminoetilo. GABA e SSAL medições foram normalizados para proteína nos lisados, quantificada com o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce) usando albumina sérica bovina curva padrão. Os dados foram processados ​​com o GraphPad Prism. grupos de nutrientes e stress do pH foram analisados ​​com um teste ANOVA forma e Dunnett pós-teste para a análise estatística.

Ensaio Baseado em Resazurina para o glutamato Determinação

um ensaio enzimático para a determinação de glutamato foi realizada como descrito previamente [41]. Resumidamente, os componentes de reacção incluído 10 uM resazurina, 4 U /mL de glutamato desidrogenase, 0,25 U /mL de transaminase glutâmica-pirúvica, 100 uM de alanina, de 0,5 mg /mL de NAD +, e 0,5 U /mL diaforase em 100 mM de Tris-HCl, pH 7.5. 10 uL das amostras acima foram adicionados a 90 uL da mistura de reacção e ensaios conduzidos no escuro a temperatura ambiente. sinal resorufina foi medida em 15 minutos. grupos de nutrientes e estresse pH foram analisados ​​com uma ANOVA caminho e Dunnett pós-teste para análise estatística

NAD (P) H baseada em fluorescência GABase Ensaio

O ensaio foi modificado a partir Passoneau [26. ]. O mastermix consistiu de 0,08 U /mL GABase, 5 mM de alfa-cetoglutarato, 500 uM de NADP, DTT 100 uM e EGTA 4 mM em pirofosfato de sódio a 100 mM, pH 8,6. As aliquotas de amostras (10 ul) foram adicionadas a placas de 96 poços (Falcon ópticos 353261) seguido por 90 mL de mastermix. A reacção foi conduzida à temperatura ambiente durante 1 hora e medida num Fluostar Optima com um /450 nm conjunto de filtros de emissão de 340 nm de excitação (ganho, 2103, 10 flashes por poço).

Western Blotting de enzimas metabólicas

PNEC células foram plaqueadas, forçado, e lavado como descrito acima. 100 uL de tampão RIPA arrefecido em gelo (10 mM de Tris pH 8,0, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, cloreto de 140 mM de sódio, 0,1% dodecilsulfato de sódio (SDS), 0,1% de desoxicolato de sódio, e 1% de Triton X-100) contendo 1 mM de ortovanadato de sódio e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) foi adicionado. As células foram raspadas dos poços sobre gelo e adicionados a tubos de microcentrífuga. As amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a 10.000 x g a 4 ° C para remover o precipitado insolúvel. A proteína foi quantificada com o ensaio de BCA tal como descrito acima

Um total de 30 ug de proteína foi aplicada num gel de 4-12% de Bis-Tris de poliacrilamida (Ferrolho, Life Technologies). Com um agente de redução de acordo com as especificações do fabricante. O gel foi transferido para uma membrana Immobilon (Millipore) e bloqueadas com solução salina tamponada com fosfato contendo 5% de albumina de soro bovino e 0,1% de Tween-20. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-GAD1 (MAB5406; Millipore), a 1:5000 de diluição, anti-ALDH5A1 (HPA029716; Sigma) a 1:1000 de diluição, anti-GLUL (MAB302; Millipore), a 1:1000 diluição, e anti-ACTB (ab8226; Abcam) a 1:4000 diluição. Os anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 ° C. de cabra anti-ratinho secundário ou anti-coelho-peroxidase de rábano conjugada com anticorpo (Cell Signaling) foi então utilizado em 1:5000 diluição. A mesma membrana foi utilizado para examinar a expressão de todas as proteínas. Após utilização de cada anticorpo, a mancha foi despojado com a Western Re-sonda (G Biosciences) de acordo com as especificações do fabricante. As manchas foram desenvolvidas e visualizados utilizando o kit de detecção de WesternBright Quantum (Advansta).

enzimática Ensaios

PNEC células foram plaqueadas, forçado, e lavado como descrito acima. As células foram raspadas em 100 ul de tampão de lise arrefecido em gelo (fosfato de sódio 100 mM, pH 7,0, 20 uM de fosfato de piridoxal, e 0,1% de Triton X-100) e repetido uma segunda vez para cada poço. As amostras foram sonicadas brevemente (2-3 segundos) em gelo e, subsequentemente, centrifugada durante 10 minutos a 10.000 x g a 4 ° C para remover o material insolúvel. Antes da quantificação amostra, todos os ensaios foram avaliados quanto à linearidade relativamente ao tempo e quantidade de lisado adicionado. Todas as actividades enzimáticas foram normalizados para o tempo e a quantidade de proteínas no lisado. As análises estatísticas foram realizadas como descrito acima.

ensaio de glutamato descarboxilase.

O método foi modificado a partir de um protocolo original [42]. O tampão de ensaio continha 100 mM de fosfato de sódio pH 7,0, fosfato de piridoxal 250 uM, glutamato 50 mM e 0,4% beta-mercaptoetanol. Um espaço em branco reacção foi realizada para cada amostra e não continha fosfato de piridoxal ou glutamato. 50 ul de lisado foi adicionado a 50 ul de tampão de reacção numa placa de PCR e incubadas durante até 8 horas a 37 ° C num termociclador sem tampa aquecida. O ensaio foi terminado com a adição de 17 mL de HCl a 350 mM e aquecida durante 30 minutos a 60 ° C num termociclador. A placa foi removida e brevemente centrifugado para eliminar o condensado. 17 ul de Tris base 400 mM foi adicionado para neutralizar a amostra e centrifugou-se a placa durante 10 minutos a 1000 x g para eliminar a precipitado de proteína. Os poços foram em seguida diluída dez vezes para a medição do GABA, o produto da reacção enzimática, utilizando o ensaio de GABase-resazurina como descrito acima.

ensaio da glutamina sintetase.

O método foi modificado a partir de um original protocolo com determinação espectrofotométrica de γ-glutamil hidroxamato [43]. O tampão de ensaio continha 50 mM de tampão de imidazolo, pH 6,8, 50 mM de hidroxilamina, pH 6,8, 100 mM de glutamina, arsenato de sódio 25 mM, 0,2 mM de adenosina-difosfato (ADP) e 0,5 mM de cloreto de manganês. Um espaço em branco reacção foi realizada para cada amostra e não continha arsenato, ADP, ou glutamina. 10 ul de lisado foi adicionado a 90 ul de tampão de reacção numa placa de PCR e incubadas durante até 8 horas a 37 ° C num termociclador sem tampa aquecida. A reacção foi terminada com a adição de 100 uL de reagente de desenvolvimento (0,37 M de cloreto de ferro (III), 0,3 M de ácido tricloroacético, ácido clorídrico 0,6 M). As amostras foram centrifugadas para remover o precipitado e a absorvância medida a 505 nm. absorbância da amostra foi calibrado com γ-glutamil padrão hidroxamato.

ALDH5A1 ensaio (SSADH).

O método foi modificado a partir de protocolos anteriores [26], [44]. O tampão de ensaio continha Tris 100 mM, pH 8,8, cloreto de potássio 50 mM, ditiotreitol 1 mM, 2,5 mM de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD), 1,25 mM SSAL, e 0,02% de albumina de soro bovino. Um espaço em branco reacção foi realizada para cada amostra e não continha SSAL. 10 ul de lisado foi adicionado a 90 ul de tampão de reacção numa placa de PCR e incubadas durante até 8 horas a 45 ° C num termociclador sem tampa aquecida. As reacções foram transferidas para uma microplaca e a absorvância do NADH, o produto enzimático, foi medida a 355 nm. absorbância da amostra foi calibrado com padrão de NADH.

Resultados

implicações clínicas do GABA Shunt

Temos previamente determinado com expressão analisa que a síntese de GABA é enriquecido em malignidades NE alto grau [13] e validou a presença de um desvio de GABA funcional no cancro da próstata NE linha celular (PNEC) usando uma combinação de perfis de expressão de gene, e metabolito actividade enzima quantificação [13], [25]. GABA pode ser derivada a partir de ácido tricarboxílico (TCA) intermediários do ciclo e /produtos de aminoácidos de poliamina catiónica que par GABA metabolismo de múltiplas vias no metabolismo da energia celular (Fig. 1). Numa via, o GABA é produzida por glutamato descarboxilase 1 (GAD1) ​​descarboxilação de glutamato mediada por derivado de um glutamina ou alfa-cetoglutarato do ciclo do TCA. Numa segunda via, os produtos de degradação e de poliamina catiónico, através de aminoácidos putrescina sofrer conversão mediada por redox ao GABA. GABA pode, então, ser metabolizado por transaminase aminobutirato (ABAT, GABA-T) e ácido succínico semialdeído desidrogenase (ALDH5A1, SSADH) em succinato para a entrada no ciclo do TCA

GLUD:. Desidrogenase de glutamato; GLS: glutaminase; GLUL: glutamato-amoníaco-ligase; GAD1: glutamato descarboxilase; ODC1: ornitina descarboxilase; ABP1: diamina oxidase; ABAT: GABA transaminase; SSAL: semialdeído succínico; ALDH5A1: succínico desidrogenase semialdeído do ácido; ALDH9A1: aldeído desidrogenase; SAT1:. Espermidina /espermina N-acetiltransferase

Em primeiro lugar, para determinar se a sobre-expressão de enzimas shunt GABA eram detectáveis ​​em malignidades da próstata humanos e se superexpressão correlacionado com eventos clínicos adversos, utilizou-se o cBioPortal [37] , [38] de TCGA para interrogar um conjunto de dados de expressão gênica do câncer de próstata publicamente disponível e sua informação clínica correspondente [39] para coortes de pacientes cujo câncer componentes do shunt GABA overexpressed. De todas as enzimas listadas na Fig. 1,

GAD1

foi o único gene cuja superexpressão foi associada com sobrevida livre de doença reduzida. Foram identificados um total de 6 pacientes, de um total de 216 pacientes (2,8%) cujos cânceres exibida

GAD1

superexpressão com um z-score superior a 2. Pacientes com câncer que overexpressed

GAD1

tinha uma doença tempo de sobrevida livre mediana de 19,8 meses versus 110,3 meses (p = 0,003) (Fig. 2A). Este grupo de pacientes tinha uma ampla gama de antigénio sérico da próstata (PSA) níveis variando 3,5-40,2 mg /dl, os graus de Gleason 3 + variando entre 3-4 + 5, e estadiamento variando de T2C para T3B. Embora apenas um caso documentado de linfadenopatia metastizado no momento da cirurgia, todas as amostras mostraram extensão extracapsular. Curiosamente, a diminuição da expressão da glutamina sintetase (

GLUL

) que podem potencialmente competir com a enzima GAD1 de glutamato foi também associada à diminuição da sobrevida livre de doença. Um total de 14 pacientes com escores z menor que -2 foram identificados com uma sobrevida mediana de 27,9 meses versus 110,3 meses (p = 0,006; A Fig. 2B).

A.

GAD1

superexpressão de ARNm em adenocarcinomas de próstata se correlaciona com a diminuição da sobrevida livre de doença. Tumores com um

GAD1

expressão z-score superior a dois exibição diminuição da sobrevida livre de doença (mediana de 19,8 meses) em relação a tumores que não têm aumentado

GAD1

expressão (mediana de 110,3 meses; p = 0,002). B.

GLUL

downregulation em adenocarcinomas de próstata se correlaciona com sobrevida livre de doença (mediana de 27,9 meses) em relação aos tumores sem

GLUL

downregulation (mediana de 110,3 meses; p = 0,006). C.

GAD1

expressão de mRNA em linhas celulares de cancro da próstata medida com PCR quantitativa.

GAD1

expressão é detectável em linhas celulares de castração resistente NCI-H660, PC3 e DU145, mas as linhas celulares não responsivos aos andrógenos LNCaP e LAPC4. 18S rRNA foi usado como um padrão interno. Ôc

t é a diferença entre o ciclo de limiar de

GAD1

e o ciclo limiar de rRNA 18S. ND: Não detectado. D.

GAD1

superexpressão de ARNm em carcinomas de células renais de células claras se correlaciona com a sobrevida global reduzida. Tumores com um

GAD1

z-score 2 exibição diminuiu a sobrevida global (mediana de 52,5 meses) em relação a tumores que não têm aumentado

GAD1

expressão (mediana de 80,6 meses; p = 0,01 ). Tumores com um

GAD1

z-score 3 visor uma maior diminuição do tempo médio de sobrevivência (média de 31,1 meses) em relação ao restante dos tumores (mediana de 78,4 meses, p = 0,002)

Como a expressão de genes NE tem sido implicado no cancro da próstata resistentes à castração, especificamente no que diz respeito ao aumento da expressão da descarboxilase NE marcador aminoácido aromático (

DDC) na próstata castração-resistente cancro [21], determinou-se

GAD1

ARNm foi enriquecida no cancro da próstata de castração humana resistente. Curiosamente,

GAD1

expressão de ARNm foi detectada apenas em linhas celulares de castração resistentes (Fig. 2C), com níveis de expressão semelhantes na linha celular de cancro do NCI-H660 NE e a PC3 e DU145 linhas de células de adenocarcinoma. Nenhuma expressão detectável de GAD1 foi identificada em qualquer uma das linhas celulares LNCaP e LAPC4 responsivos aos andrógenos.

Devido a um relatório de expressão da proteína GAD1 num subconjunto de carcinomas das células renais [45], que um interrogado publicada recentemente estudo do subtipo de células claras de carcinomas de células renais [40] fornecidos através do cBioPortal para determinar se havia características de sobrevivência semelhantes. Foram identificados 39 pacientes de um total de 499 pacientes (8%) cujos tumores sobre-expressos

GAD1

mRNA com um escore z maior que +2. Esta coorte mostrou uma redução significativa na sobrevida global em relação à população total de câncer de células claras, com um tempo médio de sobrevivência de 52,5 meses em comparação com 80,6 meses (p = 0,01). em seguida, nós isolamos uma coorte de

GAD1

superexpressão tumores (n = 18) com um z-score superior a 3, e identificou uma nova redução na sobrevida global com um tempo médio de sobrevivência de 31,1 meses em comparação com 78,4 meses (p = 0,002) (Fig. 2D). Não houve efeito significativo da

GLUL

expressão de mRNA na sobrevida dos pacientes nesta população.

Ensaio Desenvolvimento

O potencial de GABA ter significado prognóstico na identificação de subgrupos de pacientes com câncer com diminuição da sobrevida nos levou a desenvolver um ensaio para GABA que pode ser amplamente adotada e independente da instrumentação tecnicamente desafiador tais como espectrometria de massa e RMN. O esquema da reacção juntamente necessária para quantificar GABA é fornecida na Fig. 3. A disponível comercialmente “GABase” preparação de

Pseudomonas fluorescens

é uma combinação de ABAT e ALDH5A1 actividades enzimáticas que oxidam GABA por meio de uma série de duas reacções em succinato, resultando em redução de NADP para cofactor NADPH. NADPH é então oxidado para NADP por diaforase mitocondrial acoplando, assim, a redução da resazurina em resorufina produto fluorescente. Embora ALDH5A1 pode utilizar tanto NAD + e NADP como substratos, NADP tem sido usado convencionalmente como um co-factor com esta preparação de enzima [26].

A preparação GABase, de uma combinação de enzimas e ABAT ALDH5A1 de

P. fluorescens

converte GABA em succinato através da conversão de alfa-cetoglutarato a glutamato e NADP a NADPH. Embora NAD ou NADP podem potencialmente ser utilizados como substratos por ALDH5A1, NADP é convencionalmente utilizado como um co-factor para esta preparação. semialdeído succínico (SSAL), um intermediário do metabolismo do GABA também é metabolizada pela preparação GABase. Diaforase oxida o NADPH e reduz a resazurina resorufina fluorescente. Aplicação de hidrogenossulfato de 2-aminoetilo (2-AEHS), um inibidor de ABAT pode ser utilizado para determinar a contribuição de SSAL para o sinal total gerada a partir de GABA e SSAL em lisados ​​celulares.

Optimização Ensaio

um ensaio de actividade de enzima NADPH clássica de fluorescência [26] foi usado como uma base para a optimização dos componentes individuais de uma leitura à base de resazurina de GABA. Cada componente foi titulada ao longo de um intervalo de concentrações, mantendo todos os outros componentes constante (Fig. 4). Como esperado, o ensaio foi sensível a resazurina, demonstrando um aumento de 5,9 vezes no sinal sobre o fundo a uma concentração de 6,25 uM.