Abstract

O objetivo do presente estudo foi determinar a

in vitro Comprar e propriedades de

atividade in vivo

anti-câncer e farmacológicos 3,4-dimethoxy-

N

-[(2,2-dimethyl-

2H

-chromen-6-yl)methyl]-

N

-phenylbenzenesulfonamide, KCN1. No presente estudo, investigamos o

in vitro

atividade de KCN1 na proliferação celular e distribuição do ciclo celular de células de câncer de pâncreas, utilizando os ensaios de MTT e BrdUrd, e citometria de fluxo. O

in foram avaliados in vivo

efeitos anti-câncer de KCN1 em dois modelos de xenotransplante distintos de câncer pancreático. Nós também desenvolvido um método de HPLC para a quantificação do composto, e examinou a sua estabilidade em plasma de ratinho, de ligação da proteína do plasma, e degradação por enzimas microssomais rato S9. Além disso, foram examinados os seguintes KCN1 farmacocinética de injecção intravenosa ou intraperitoneal em ratinhos. Os resultados mostraram que, de uma forma dependente da dose, KCN1 inibiu o crescimento celular e a paragem do ciclo celular induzida em células de cancro pancreático humano

in vitro

, e mostrou

In vivo

eficácia anticancerígena em ratinhos portadores de Panc xenoenxertos de tumor Mia-1 ou Paca-2. O método de HPLC proporcionou a detecção linear de KCN1 em todas as matrizes na gama de 0,1 a 100 um, e tinha um limite de detecção inferior de 0,085 uM em plasma de ratinho. KCN1 era muito estável no plasma rato, amplamente plasma ligado, e metabolizado por enzimas microssomais S9. Os estudos farmacocinéticos indicaram que KCN1 poderia ser detectado em todos os tecidos examinados, a maior parte de, pelo menos, 24 h. Em conclusão, nossos dados pré-clínicos indicam que KCN1 é um agente terapêutico potencial para o câncer de pâncreas, fornecendo uma base para o seu desenvolvimento futuro

Citation:. Wang W, Ao L, Rayburn ER, Xu H, Zhang X, Zhang X, et al. (2012) KCN1, um romance sintético sulfonamida Anticancer agente:

In Vitro

e

In Vivo

Anti-pancreáticas Atividades de cancro e pré-clínica Farmacologia. PLoS ONE 7 (9): e44883. doi: 10.1371 /journal.pone.0044883

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de fevereiro de 2012; Aceito: 15 de agosto de 2012; Publicado: September 13, 2012 |

Direitos de autor: © Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por um National Institutes of Health subvenção R01 CA116804 (a EGVM). RZ também foi apoiado pelo National Institutes of Health concede R01 CA112029 e R01 CA121211. EGVM também foi apoiado por EmTechBio, o Comité de Investigação da Universidade de Emory University, a Fundação do tumor cerebral para crianças, e da Fundação V para Pesquisa do Câncer. HW foi apoiada pelos cem talentos do Programa, da Academia Chinesa de Ciências, subsídios da National Nature Science Foundation (30870513, 31070680, 91029715 e 81025017) e Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2007CB947100), Nacional de Ciência e Tecnologia grande projecto Key Novas drogas Criação e Programa Manufacturing 2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011). MW foi apoiado pelo National Institutes of Health subvenção R01 CA91980. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro continua a ser um importante problema de saúde pública mundial. Há cada vez mais descobertas do pré-clínicos e clínicos que têm melhorado o prognóstico para pacientes com diagnóstico de câncer, especialmente de mama e próstata. Em contraste, tem havido melhorias só mínimas no resultado para pacientes com câncer pancreático. O câncer de pâncreas é caracterizada pela sua natureza invasiva, a capacidade de fugir terapia agressiva, e diagnóstico fase tardia frequente [1]. A taxa de mortalidade para câncer de pâncreas continua elevada, com uma média de sobrevivência de apenas 10 meses após o diagnóstico [1] – [4]. Há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de novos agentes eficazes e seguros para o tratamento de câncer pancreático.

Estamos interessados ​​em desenvolver novos de câncer de agentes terapêuticos para os cancros humanos com nenhum tratamento eficaz atual, tais como tumor cerebral e câncer pancreático. Uma característica única dos cancros sólidos é que o seu rápido crescimento, muitas vezes resulta na disponibilidade de oxigénio reduzida devido à formação de vasculatura inadequada ou aberrante [5]. A fracção hipóxica dos tumores sólidos é resistente à radioterapia [6] e da quimioterapia convencional [7] – [10], e hipoxia correlaciona-se com mau resultado terapêutico [7], [8], [11], [12]. Ao nível molecular, o factor de transcrição A hipoxia inducible factor-1 (HIF-1) foi identificado como o orquestrador chave da resposta biológica a hipoxia, devido à sua transactivação de genes que estão envolvidos em muitos aspectos do crescimento do tumor maligno de sobrevivência celular e metabolismo para a angiogénese e invasão [13] – [16]. A sobre-expressão de HIF-1 resulta na ativação constitutiva de seus caminhos de destino [13] – [18]. HIF-1 é um factor de transcrição heterodimérica que consiste em duas subunidades, HIF-1a, que é regulada por oxigénio, e HIF-1β, que é constitutivamente expressa. Vários inibidores da expressão de segmentação de HIF-1α ou as suas actividades foram concebidos para o tratamento de cancros; No entanto, nenhum destes compostos foi ainda bem sucedido devido à toxicidade do composto, uma actividade limitada, ou pobres propriedades farmacológicas [18] – [25]. Recentemente, desenvolvemos um romance sulfonamida aril sintético, denominado KCN1 (Fig. 1A), que foi inicialmente pensado para direcionar via HIF-1α. No entanto, em estudos recentes, KCN1 foi mostrado para exercer as suas actividades anti-cancro, tanto em condições de normóxia e de hipóxia em linhas celulares de cancro glioma humano [26] – [31]. Nossos estudos sobre os mecanismos posteriores indicaram que KCN1 tem atividades citostáticos HIF-independente-1a significativos. O presente estudo foi desenhado para determinar o

in vitro

e

in vivo

atividade anti-câncer do KCN1 em câncer de pâncreas e as suas propriedades farmacológicas.

(A) Estrutura química do KCN1. actividade inibidora de (B) o crescimento celular de células cancerosas em KCN1 pancreáticos humanos. As células foram expostas a várias concentrações de KCN1 durante 72 h, seguido por um ensaio MTT. actividade inibidora de (C) o crescimento celular de KCN1 de um modo dependente do tempo. As células foram expostas a KCN1 para diferentes pontos de tempo, seguido por um ensaio MTT. (D) Inibição do crescimento independente de ancoragem por KCN1 em células de cancro pancreático. As células foram tratadas com várias concentrações de KCN1 em agar mole. As culturas foram mantidas no incubador durante duas semanas, em seguida, as colónias de células foram observadas e teve sob um microscópio. efeito (E) anti-proliferativa de KCN1 em células de cancro pancreático humano. As células foram expostas a várias concentrações de KCN1 durante 24 h, seguido por medição da proliferação de células utilizando o ensaio de BrdUrd. O índice de proliferação foi calculada contra células de controlo não tratados. efeito (F) apoptótica de KCN1 em células de câncer pancreático humano. As células foram expostas a várias concentrações de KCN1 durante 48 h, seguido por medição da apoptose por um ensaio de Anexina V. O índice apoptótico foi calculada por comparação com células de controlo não tratadas. Todos os ensaios foram realizados em triplicado. (

# p 0,05, * p 0,01).

Como a distribuição e disposição de um agente dentro do corpo é vital para determinar a sua eficácia e toxicidade, início de estudos farmacocinéticos são de grande importância para o desenvolvimento de drogas [32], [33]. Tais estudos podem fornecer informações sobre a rota mais eficaz e frequência de administração, bem como uma indicação de quão eficaz o agente será contra tumores em diferentes locais dentro do corpo. Eles também podem indicar possíveis locais de acumulação do fármaco e /ou toxicidade [32], [33]. No presente estudo, buscou-se caracterizar as propriedades farmacológicas de KCN1 em ambiente pré-clínico, no que diz respeito à sua estabilidade plasma, ligação às proteínas plasmáticas, a biodisponibilidade, e de distribuição após administração sistémica a ratos. Estes resultados demonstram a eficácia anti-tumoral e propriedades farmacológicas favoráveis ​​deste novo agente, apoiando o seu desenvolvimento ulterior no sentido de ensaios clínicos.

Resultados

KCN1 possui

in vitro

Anti- as células cancerosas atividade contra o cancro do pâncreas

a inibição do crescimento de células cancerígenas.

o

in vitro

atividade anti-câncer do KCN1 foi avaliada utilizando o ensaio MTT. Quatro linhas celulares de cancro pancreático humano (HPAC, Panc-1, BxPC3, Mia e Paca-2) foram cultivadas com o composto a várias concentrações variando de 0-100 fiM durante 72 h, e a viabilidade celular foi determinada. Os efeitos inibidores do composto no crescimento celular foram ilustradas na Fig. 1B. KCN1 inibiu o crescimento de células de cancro de um modo dependente da dose, o que representa 83% (P 0,01), 53% (P 0,01), 81% (P 0,01) e 61% (P 0,01) de inibição a 100 ^ M em o HPAC, Panc-1, BxPC3, e células Mia Paca-2, respectivamente. A linha celular de Panc-1 é conhecida por expressar a proteína de resistência a múltiplas drogas associadas 1 (MRP1) e é conhecido por apresentar resistência a várias drogas terapêuticas do cancro. Esta pode ser a razão pela qual eles foram mais resistentes ao tratamento KCN1 em comparação com outras células. FIG. 1C mostram o curso temporal da inibição do crescimento com tratamento KCN1 em todas as quatro linhas celulares, sugerindo a respectiva sensibilidade ao composto, tal como BxPC3 HPAC Mia Paca-2 Panc-1. Como mostrado na Fig. 1D, HPAC e Panc-1cells foram suspensos em agar mole e as colónias foram contadas após 14 dias de incubação de KCN1. KCN1 diminuiu o número de colónias formadas em células HPAC e Panc-1, 4- e 3-vezes, respectivamente.

A inibição da proliferação de células cancerosas.

O efeito dependente da dose de KCN1 sobre proliferação celular foi analisada com um ensaio de incorporação BrdUrd (Fig. 1E). Os efeitos anti-proliferativos foram observadas em todas as quatro linhas celulares. A uma concentração de 50 uM, KCN1 inibiu a proliferação em cerca de 80% (P 0,01), 56% (P 0,01), 88% (P 0,01) e 60% (P 0,01) no HPAC, Panc- 1, BxPC3, e células Mia Paca-2, respectivamente. BxPC3 células eram mais sensíveis ao tratamento KCN1 na concentração mais elevada do que as outras três linhas de células.

Efeitos sobre a apoptose.

Também examinedwhetherKCN1 tinha um efeito sobre a apoptose celular em células cancerosas pancreáticas (Fig . 1F). Após um tratamento de 48 h, KCN1 mostrou efeitos apoptóticos negligenciáveis ​​ou fracas a seguir à exposição a uma concentração de 50 uM do composto. KCN1 foi capaz de induzir a apoptose apenas em células HPAC (índice apoptótico: 1,4 vezes). A droga não revelou nenhuma actividade detectável apoptótica nas outras três linhas de células. Estes resultados indicam que a indução de apoptose podem não ser os principais mecanismos anti-câncer para KCN1.

paragem do ciclo celular na fase G1.

Nos quatro linhas celulares de cancro do pâncreas diferentes, depois de 24 h tratamento, KCN1 induziu significativamente a paragem do ciclo celular na fase G1 de um modo dependente da dose, com efeitos iniciais começando em 5 uM em HPAC (P 0,01), BxPC3 (P 0,01), e Mia Paca-2 (P 0,01 células), e 12,5 uM em Panc-1 (P 0,01), as células (Tabela 1). Estes resultados indicam que a indução de parada do ciclo celular pode ser um mecanismo importante anti-câncer para KCN1.

KCN1 module a expressão das proteínas relacionadas com ciclo celular

Foram investigados os possíveis mecanismos responsável pelos efeitos anti-proliferativos de regulação do ciclo celular e de KCN1 avaliando os seus efeitos sobre o nível de várias proteínas envolvidas na regulação da proliferação celular e na progressão do ciclo celular (Fig. 2) expressão. Em todas as quatro linhas celulares, o tratamento com KCN1 (12 h e 24 h) conduziu a vários níveis de expressão diminuída de reguladores do ciclo celular E2F1, Cdk2, Cdk4, CDK6, cdc25C, ciclina D1, ciclina e E. Em contraste, a exposição a KCN1 aumentou a expressão de p21 e p27 em todas as quatro linhas celulares. Estas proteínas estão envolvidas principalmente na progressão do ciclo celular e check-ponto de controle. Estes resultados indicam ainda que KCN1 exerce a sua actividade anti-cancro por meio de paragem do ciclo celular.

HPAC, Panc-1, Mia células de cancro do pâncreas e Paca-2 BxPC3 foram expostas a várias concentrações do composto para 12 ou 24 h, e, em seguida, proteínas alvo relacionados com a progressão do ciclo celular foram analisadas por transferência de Western.

KCN1 inibe o crescimento de tumores de xenoenxerto

para determinar se o composto era eficaz contra

in vivo

tumores, avaliou-se o efeito anti-tumoral de entrega sistémica de KCN1 contra a Mia Paca-2 modelos de xenoenxerto subcutâneo Panc-1 e em

nu /nu

ratinhos. O tratamento sistémico por via intraperitoneal (i.p.) com KCN1 (30 ou 60 mg /kg em Cremophor uma 1:01: formulação de etanol, 5 dias /semana) foi iniciado quando o volume do tumor atingiu -100 mm

3

. O composto diminui significativamente o crescimento dos tumores de xenoenxerto pancreáticas de um modo dependente da dose. No modelo de xenoenxerto de Panc-1, a inibição do crescimento do tumor de aproximadamente 46% (P 0,01) foi observada na dose de 30 mg /kg e de 61% (P 0,01) com a dose de 60 mg /kg no dia 21 (Fig . 3A1). Resultados similares foram observados no modelo de xenoenxerto Mia Paca-2. Este modelo pareceu ser quase semelhante sensível ao fármaco, com a dose baixa (30 mg /kg) e dose elevada (60 mg /kg) a diminuição do crescimento do tumor em cerca de 43% (P 0,01) e 57% (P 0,01 ), respectivamente (Fig. 3B1). Além disso, não houve diferenças significativas nos pesos corporais entre os controlos e os animais tratados com KCN1 em ambos os modelos de xenoenxerto (Figs. 3A2 e B2), indicando ausência de toxicidade para o hospedeiro evidente nas doses terapêuticas de KCN1.

Foi administrado

KCN1 por IP injecção de ratinhos nus portadores de Panc-1 (A1) ou Paca-2 Mia (B1) tumores de xenoenxerto. KCN1 foi administrada por injecção i.p. injecção em doses de 30 e 60 mg /kg /d, 5 dias /semana durante 3 semanas para Panc-1 modelo de xenoenxerto e 6 semanas para Mia Paca-2 modelo de xenoenxerto, respectivamente. grupos de controlo receberam apenas veículo. volumes de tumores foram medidos a cada três dias. Os animais também foram monitorados para alterações no peso corporal como um marcador substituto para toxicidade quando foi administrado a ratinhos nus portadores de (A2) Panc-1 ou (B2) Mia Paca-2 tumores de xenoenxerto.

A método HPLC para KCN-1 a análise é desenvolvida e validada

o método de HPLC deu uma curva de calibração linear no plasma do rato para a faixa de concentração investigada de 0,1-100 M. O coeficiente de correlação médio (

r

2) para as curvas de calibração diárias foi = 1,000. As curvas de calibração foram também produzidos em homogenatos de vários tecidos de rato, incluindo o cérebro, músculo esquelético, rins, pulmões, baço e coração, que tinham coeficientes de correlação de pelo menos 0,992 para as mesmas concentrações. As variações exatidão, precisão, intra-dia e inter-dia foram aceitável, com coeficientes de variação (CV) entre 4,25% e 12,62%, eo limite inferior de detecção (LOD) no plasma foi de 0,085 M. A recuperação do composto nos diferentes matrizes variou de ~96% a ~107%. cromatogramas representativos de plasma em branco rato, plasma de ratinho de controlo inoculadas com 1, 5, 25, e 50 uM KCN1 são mostrados nas Figs. 4A-E. cromatogramas semelhantes foram obtidos para os outros tecidos examinados (dados não mostrados). A especificidade foi demonstrada pela ausência de qualquer interferência endógena nas amostras biológicos durante o tempo de retenção dos picos de KCN1.

(A) KCN1 no controlo (sem droga) plasma de ratinho e plasma de murganho subiu para conter 1, 5, 25, e 50 uM KCN1; Uma amostra de plasma de rato e plasma de murganho amostra em branco enriquecida com 1 uM (B), 5 uM (C), 25 uM (D), e 50 uM (E) KCN1.

KCN1 é estável em plasma de rato a várias temperaturas por longos períodos

KCN1 era estável em plasma de ratinho a 37 ° C, com mais do que 80% do composto restante depois de uma incubação de 8 horas, tanto para a baixa (1 uM) e alta ( 10 uM) concentrações. Nós também descobrimos que KCN1 pode ser armazenado a 4 ° C durante pelo menos 24 horas, com mais de 90% do composto restante (Fig. 5A1), ou a 37 ° C durante pelo menos 8 h, com mais de 85% do composto restante (Fig. 5A2), ou a -80 ° C durante até 4 semanas com mais de 92% do composto restante (Fig. 5A3).

Estabilidade de KCN1 em plasma de ratinho a 37 ° C ( A1), 4 ° C (A2), e -80 ° C (A3). (B) Degradação de KCN1 por frações isoladas de fígado de rato S9.

KCN1 se liga à proteína do plasma extensivamente

KCN1 ligado extensivamente às proteínas no plasma do rato, com a baixa (1,0 mM) e alta (10,0 uM) concentrações demonstrando 90,96% e 99,32% da ligação às proteínas plasmáticas composto, respectivamente.

KCN-1 é metabolizado por enzimas S9 (Fase I)

Como KCN1 apareceu a ser extensivamente metabolizado ou degradado no plasma de ratinho, foi realizado um estudo preliminar do potencial mecanismo (s) pelo qual KCN1 é metabolizado utilizando o ensaio S9. Este ensaio pode ser utilizado para determinar se o composto é metabolizado

através

fase I (sistemas de regeneração de NADPH) ou enzimas extraídas a partir de microssomas de rato fase II (UDPGA e os PAP). Os estudos indicaram que S9 KCN1 tem uma meia-vida relativamente longa, na presença dos enzimas II (conjugação) microssomais de fase. No entanto, houve uma redução superior a 60% na quantidade de KCN1 observada quando foi incubada com fase rato I (oxidação) enzimas (Fig. 5B), o que sugere que é provável que metabolizado pela primeira fase da enzima (s).

KCN1 tem uma meia-vida longa e Distribuição Tissue larga em camundongos após intravenosa e intraperitoneal Administrações

Análise de amostras de plasma recolhidas de ratinhos doseados com KCN1 (35 mg /kg) mostraram que as concentrações plasmáticas do composto ainda eram detectáveis ​​para ambas as estirpes, pelo menos, 6 horas após o (IV) injecções intravenosas, e eram detectáveis ​​por até 24 horas após a administração intraperitoneal (IP) (Fig. 6A e 6B). Na sequência de bolo i.v. administração, as concentrações plasmáticas foram maiores do que 5 ug /ml em 5 minutos para ambos CD-1 (9,98 ug /mL) e ratinhos nus (5,19 ug /mL). Estes níveis declinaram para 0,3 ng /mL às 6 h após dosagem em ambas as estirpes. Após I.P. dosagem, os níveis de plasma atingido o seu máximo em 30 min em ratinhos CD-1 e em 2 h em ratinhos nus. Em geral, V.I. administração deu maior AUC plasma e C

valores max, mas inferiores

1/2 valores T em comparação com o I.P. a via de administração (Tabela 2).

plasma curvas de concentração-tempo para KCN1 seguintes (A), IV e (B) injecção ip de 35 mg /kg em ratinhos CD-1 e nus (nu /nu). distribuição dependente do tempo do KCN1 em vários tecidos seguinte (C) a administração IV ou (D) a administração IP 35 mg /kg do composto. As colunas representam ratinhos nus, enquanto que as pirâmides representam ratinhos CD-1.

De interesse, KCN1 poderia ser detectada na maioria dos tecidos amostrados (coração, pulmões, fígado, baço, rins , e no músculo esquelético; a Fig. 6C e 6D) de ambas as estirpes durante pelo menos 24 h após a administração por qualquer via. No entanto, o composto não pode ser detectado após 6 h no cérebro de qualquer estirpe de ratinhos após qualquer via de administração. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados para o plasma e os vários tecidos (Tabela 2). Os maiores valores AUC em ambos nus e CD de 1 ratos seguintes I.V. injecção foram nos pulmões, no fígado e no baço, e os tecidos com os valores mais baixos de AUC seguintes V.I. injecção foram o plasma, cérebro e músculo esquelético. A concentração elevada observada nos pulmões após a V.I. injecção era provavelmente devido a acumulação de fármaco precipitado, embora isto não foi verificado experimentalmente. Em ambas as linhagens de camundongos, o baço apresentou o maior seguinte AUC I.P. injecção, seguida pela do fígado. O plasma e no cérebro apresentaram os menores valores de AUC para ambas as estirpes seguintes I.P. injecção.

dos 35 mg /kg de KCN1 administrado por via intravenosa, menos do que 1% da dose total foi recuperado como KCN1 KCN1 parental a partir da urina de ambos os ratinhos CD-1 nu e durante as primeiras 24 h , com menos do que 0,5% a ser recuperado a partir de ambas as estirpes seguintes IP injecção. Cerca de 1% da dose inicial do composto parental foi recuperada nas fezes dos ratos após a administração i.p. injecção, e menos de 1% foi recuperado seguindo V.I. injecção (dados não mostrados).

Discussão

inibidores da via de HIF representar um novo alvo agente terapêutico. Embora o sucesso tem sido visto usando agentes de direccionamento moléculas individuais (por exemplo, Herceptin, Gleevec), estes agentes são tipicamente limitadas no que diz respeito aos tipos de cancro, e de sub-classes, dentro dos tipos de cancro, que podem ser tratados. Porque KCN1 inibe um processo fisiológico (hipoxia), que é inerente na formação de tumores, em vez de um alvo específico do tipo de cancro, o agente pode, potencialmente, ser utilizados para tratar uma variedade de diferentes cancros, incluindo aqueles para os quais não existem actualmente eficaz tratamentos, especialmente cancro pancreático.

O composto de teste KCN1 foi inicialmente concebido como um HIF-1α-inibidor, mas seus efeitos inibitórios da proliferação celular e crescimento nos levou a especular se ele pode ter um efeito em condições normóxica. HIF-1α também desempenha um papel importante na regulação do ciclo celular. Em condições de hipóxia, torna-se estabilizado levando a sobrevivência do tumor

via

aumento da angiogênese e glicólise anaeróbia. Surpreendentemente, HIF-1α também regula-se genes que promovem a paragem do ciclo celular e apoptose, tais como p21, p27, p53 [34], [35]. Em vista disso, os benefícios de inibição HIF-1α na terapia do cancro parece questionável uma vez que pode desfazer a paragem do ciclo celular sob condições hipóxicas e prevenir a morte celular. Estes efeitos contraditórios pode limitar o efeito anti-cancro dos inibidores de HIF-1α [34], [35]. No entanto, se os inibidores de HIF-1α tem o efeito adicional de induzir a paragem do ciclo celular ou a morte celular, que pode ser melhor proposições como agentes anti-cancro. Assim, é imperativo durante o desenvolvimento de inibidores de HIF-1α como agentes anti-câncer para avaliar os seus efeitos sobre ciclo celular e morte celular.

O presente estudo é o primeiro a investigar sistematicamente a

in vitro

e

in vivo

efeitos anti-tumorais de KCN1 em células de câncer de pâncreas, de forma HIF-independente-1α. Observamos que KCN1 diminuiu significativamente o crescimento de células de câncer pancreático e proliferação, e levou à interrupção do ciclo celular sob normóxica (20% O

2) condições de cultura. Depois de avaliar os efeitos do composto em

In vitro

proliferação, progressão do ciclo celular e apoptose, concluiu-se que a paragem do ciclo celular foi o principal mecanismo pelo qual o composto exerce os seus efeitos citostáticos em cultura de células. a paragem do ciclo celular é uma das estratégias mais eficazes para inibir o crescimento tumoral [36]. No presente estudo, verificou-se que a parada do ciclo celular KCN1 mediada foi alcançado

via

uma modulação de inibidor da ciclina quinase (CKI) – cyclin- dependente da ciclina quinase (CDK) máquinas operando na fase G1 do ciclo de célula. Uma família de complexos de proteína-quinase orquestra a progressão do ciclo celular em eucariotas [37]. Cada complexo é composto minimamente de uma subunidade catalítica, a CDK, e a sua parceira activador essencial, a ciclina. Várias combinações de ciclinas e CDKs controlar o ciclo celular em pontos diferentes [37]. Por exemplo, a ciclina E é expresso transitoriamente durante a transição G1 /S e é rapidamente degradada quando a célula entra na fase S [38]. Ciclina E regula Cdk2 enquanto Ciclina D1 regula CDK4 e CDK6 [38]. Estes complexos são activadas a vários postos de controlo após a intervalos específicos ao longo do ciclo celular, mas também pode ser induzida e regulada por factores exógenos [37] – [39]. As cdk são sujeitas a inibição por a ligação de CKI, como o CIP KIP (p21, p27) e INK4 /famílias de proteínas [37] – [39]. A transcrição de genes necessários para a /transição G1 S, tais como ciclina E e ciclina D1 é iniciada por E2F1, que está sob o controle do supressor tumoral Rb [37] – [39]. Neste estudo, foi examinada a influência de KCN1 sobre a expressão de várias proteínas que se sabe estarem envolvidos nestes processos. Em todas as quatro linhas celulares de cancro pancreático testadas, verificou-se a diminuição da expressão de cycleproteins celulares, incluindo E2F1, ciclina D1, ciclina E, Cdk2, CDK4 e CDK6, e aumento da expressão de p21 e p27. Enquanto KCN1 induzida paragem do ciclo celular em linhas celulares de cancro do pâncreas, que tinha pouco efeito citostático em células de glioma e fibroblastos imortalizados, sugerindo que os seus efeitos podem ser células tipo-dependente [31]. Para confirmar a eficácia terapêutica do composto, foi também investigada para

In vivo

efeitos. KCN1 diminuiu o crescimento de ambos Panc-1 e Mia Paca-2 tumores de xenoenxerto.

Uma vez que não há relatos publicados sobre a farmacocinética, a toxicidade, ou a biodisponibilidade de KCN1, foi realizada uma avaliação dessas propriedades farmacológicas. Foi desenvolvido um método de HPLC adequado para a detecção de KCN1 em várias matrizes biológicas, e demonstraram que KCN1 é estável no plasma de rato (Fig. 5A1-A3), que é amplamente ligada às proteínas do plasma, que é provável que metabolizado pela primeira fase enzima (s) (Fig. 5B), e que é distribuída para vários tecidos do rato depois de ambos IV e I.P. administração (Fig. 6 e Tabela 2). Nossos estudos de farmacologia iniciais trouxe à luz diversas características interessantes sobre KCN1. Em primeiro lugar, houve acumulação extensiva do composto nos pulmões de ratinhos após a V.I. injecção, e no baço e no fígado de ratos após a administração i.p. injecção. Futuros estudos são necessários para determinar os mecanismos para o padrão de distribuição exclusivo desta droga. Foi administrada intraperitonealmente a uma dose de até 60 mg /kg por dia em uma cremofor: etanol formulação para até 12 semanas, e este regime foi bem tolerado pelos animais. Não havia sinais aparentes de toxicidade nestes animais, e o seu comportamento e a aparência eram indistinguíveis dos animais de controlo. As nossas análises preliminares indicaram que os valores de populações de células sanguíneas e a química do sangue estavam dentro dos limites normais (dados não mostrados). Além disso, o exame patológico dos principais órgãos no momento da necropsia demonstrou nenhuma alteração ultra-estruturais no cérebro, rins, tracto GI ou pulmões (dados não mostrados). O fígado é o único órgão onde se observou uma alteração relacionada com o tratamento. Inchaço foi observada nos fígados dos animais na autópsia, edema do tecido com a estagnação do ducto biliar foi indicada por exame patológico, mas sem qualquer evidência de morte de hepatócitos. O inchaço observado do fígado foi invertido nos ratinhos dentro de 2-3 semanas após a interrupção do tratamento, e pode ter sido causada pelo Cremophor:. Formulação de etanol, o que pode interferir com o fluxo sanguíneo hepático [40] – [42]

O segundo ponto de interesse é que houve diferenças na farmacocinética do KCN1 entre CD-1 e ratos nus. Enquanto algumas destas diferenças pode ter sido devido às variações normais entre os ratos, as diferenças no tempo de exercício (estação), quando os estudos foram feitos, e diferenças devidas à fonte dos ratinhos (Harlan Frederick vs), alguns dos diferenças entre as linhagens de camundongos foram ainda digno de nota. Por exemplo, a ratinhos CD-1 mostrou uma concentração muito mais elevada nos pulmões do que os ratinhos nus, apesar de ter recebido a mesma dose. No entanto, na maioria dos casos, a ratinhos nus mostraram uma maior absorção do agente para os diversos tecidos examinados (fígado, rins, baço, coração, músculo esquelético, e cérebro). Também houve diferenças na biodisponibilidade intraperitoneal de KCN1, com o composto a ser absorvido muito melhor após a injecção intraperitoneal em ratinhos nus em comparação com ratinhos CD-1. Este aumento da biodisponibilidade provável era responsável pela absorção de tecido superior. Se os resultados semelhantes são encontrados em estudos repetidos, será necessário para elucidar o mecanismo (s) subjacente a estas diferenças na absorção, a fim de determinar se esses factores são susceptíveis de impacto a farmacocinética do KCN1 em outras espécies, incluindo os seres humanos. Além disso, enquanto que os ratinhos CD-1 são frequentemente usadas para avaliar a farmacocinética de compostos novos, ratinhos nus são a estirpe de ratinho utilizada mais frequentemente para os estudos de eficácia anti-cancro. Diferenças na farmacocinética entre as cepas podem levar a super ou sub-avaliação da eficácia ou toxicidade de um composto.

Nós também observou que KCN1 aparentemente sofre recirculação entero-hepática. Não só o composto foi ainda presente em muitos tecidos, mas em alguns casos, foi superior às 24 h do que às 4 ou 6 horas (por exemplo, fígado e baço). Além disso, KCN1 ainda era detectável a um nível baixo de, pelo menos, cinco dias após a administração intraperitoneal (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que pode ser possível para dar KCN1 relativamente com pouca frequência, uma vez que o composto pode permanecer no tecido alvo por vários dias. No entanto, será necessário assegurar que o composto não exercem efeitos tóxicos sobre o fígado, vesícula biliar ou outros tecidos expostos a uma elevada concentração do composto para períodos de tempo prolongados.

Em adição a alterações na frequência de dosagem para os estudos de eficácia, alterando a formulação também pode melhorar a actividade do composto. Embora o composto foi eficaz quando administrada I.P. em cremofor: etanol, a formulação não é o ideal. Mais importante ainda, enquanto a própria KCN1 não pareceu exercer qualquer toxicidade importante, o veículo conduzido para o fígado inchaço após várias semanas de administração nos animais de controlo. Deste modo, alterando a formulação pode diminuir a toxicidade do composto, e é possível que a optimização da formulação e administração do composto também iria aumentar os seus efeitos anti-cancro.

Em resumo, demonstrámos que pode KCN1 exercer citotoxicidade e proliferação celular efeitos inibição potente no sentido de células de câncer de pâncreas, e levou à diminuição da regulação de importantes proteínas oncogênicas e pró-crescimento /pró-proliferação. Nós apresentamos um método válido para detectar e quantificar KCN1 em várias matrizes. Nós também apresentamos dados farmacocinéticos iniciais sobre o composto, indicando que ele está bem distribuído, estável, e é detectável em vários tecidos por um período relativamente longo de tempo. As informações geradas neste estudo será útil para o desenvolvimento do composto.

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

KCN1 foi sintetizada e purificada conforme relatado anteriormente [ ,,,0],29], [43] – [44], e a estrutura foi confirmada por UV, IV, MS e espectroscopia de RMN. A pureza do composto foi determinada como sendo superior a 99%.

Todos os produtos químicos e solventes utilizados na análise de preparação de amostras e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foram de grau analítico. Metanol (qualidade para HPLC) foi adquirido a Fisher Chemicals (Fairlawn, NJ) e trietilamina foi adquirido a partir de Sigma (St. Louis, MO).