Abstract

A capacidade de interleucina-15 (IL-15) para ativar muitos mecanismos antitumorais imunes torna o citocina um bom candidato para a terapia de tumores sólidos, em particular carcinoma de células renais. Embora a IL-15 está a ser actualmente utilizado em ensaios clínicos, a função da citocina em componentes do rim não tem sido extensivamente estudado; foi investigada assim o papel de IL-15 em células epiteliais renais normais e tumorais. Nisto, analisou-se a expressão e as funções biológicas de IL-15 em túbulos renais proximais normal (RPTEC) e os seus homólogos em neoplásicas, os carcinomas de células renais claras (RCC). Este estudo mostra que RPTEC expressar um complexo funcional heterotrimérica IL-15Rαβγc cuja estimulação com concentrações fisiológicas de rhIL-15 é suficiente para inibir compromisso epitelial mesenquimal (EMT) preservando expressão de E-caderina. De facto, a IL-15 não só é um factor de sobrevivência para as células epiteliais, mas também pode preservar o fenótipo epitelial renal através da via de sinalização yc, demonstrando que a citocina possuem uma vasta gama de acções na homeostase epitelial. Em contraste, na RCC

in vitro

e

in vivo

estudos revelam um defeito na expressão de yc-receptor e JAK3 quinase associada, que fortemente os impactos IL-15 sinalização. Com efeito, na ausência da yc par /JAK3 demonstramos a montagem de um funcional de elevada afinidade de IL-15Rαβ heterodímero sem precedentes, que em resposta a concentrações fisiológicas de IL-15, desencadeia um sinal desequilibrada fazendo com que a sub-regulação do supressor tumoral gene da caderina-E, favorecendo processo de RCC EMT. Notavelmente, o resgate de IL-15 de sinalização /dependente yc-(STAT5), por yc co-transfecção e JAK3 na RCC, inibe EMT reversão. Em conclusão, estes dados destacam o papel central da IL-15 e receptor-yc sinalização na homeostase renal através do controle da expressão de E-caderina e preservação do fenótipo epitelial, tanto em RPTEC (up-regulation) e RCC (down-regulation).

Citation: Giron-Michel J, Azzi S, Khawam K, Mortier E, Caignard A, Devocelle A, et al. (2012) Interleukin-15 desempenha um papel central na fisiologia Rim humano e Câncer através do yc via de sinalização. PLoS ONE 7 (2): e31624. doi: 10.1371 /journal.pone.0031624

editor: Eliane F. Meurs, Institut Pasteur, França |

Recebido: 15 Abril de 2011; Aceito: 16 de janeiro de 2012; Publicação: 21 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Giron-Michel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Agence Française de Biomedicina, ARC (Association pour la Recherche sur le Câncer) (N ° RAC11005LLA), Inca, NRB-Vaincre Cancer le, AIRC projeto (Associazione italiana per la Ricerca sul Cancro) IG 5642 e Ministério Italiano de Saúde. S.A. foi um destinatário de ARC e NRB-Vaincre Câncer le bolsas de doutoramento. K.K. era um receptor de bolsas de doutorado da Société Française de Nefrologia, ARC e NRB-Vaincre Cancer le. M. C. foi um destinatário de uma bolsa da Fondazione Italiana per la Lotta al Neuroblastoma. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a interleucina-15 (IL-15) é uma citocina pleiotrópica envolvidos na imunidade inata, bem como em funções fora do sistema imune. IL-15 diversidade funcional é explicado em parte pelos seus complexos mecanismos de acção [1], [2] que envolvem não apenas as formas solúveis e de membrana da citoquina, mas também diferentes da IL-15 receptores (IL-15R), com afinidades específicas e a transdução de sinal vias [3], [4]. De facto, a IL-15 se liga à cadeia IL-15Ra privada com elevada afinidade (Kd≥10

-11 M), que proporcionam uma sinalização específica em resposta a IL-15 (NF-kB, a Syk). A IL-15 partilha com IL-2, a IL-2Rp (CD122) e IL-2Rγ (CD132, yc) subunidades, que forma quer um receptor funcional de alta (IL-15Rαβγ, Kd≥10

-11 M) ou afinidade intermédia (IL-15Rβγ, Kd = 4 nM) para a IL-15, permitindo que a sinalização através de uma cascata que envolve a JAK /STAT, MAPK e vias de transdução de PI3-K

.

a cadeia comum do receptor é um yc componente chave da família de citocinas de quatro hélices com feixe, permitindo que através da sua associação com o Janus tirosina quinase 3 (JAK3), a activação de moléculas de STAT (transdutores de sinal e activadores de transcrição) [5]. JAK3 fosforila estatísticas diferentes a jusante, em relação ao tipo do complexo receptor envolvido. Assim, a IL-4 sinaliza predominantemente através de STAT-6, enquanto que a IL-2, IL-7, IL-9 e IL-21 agir através de STAT-1 e STAT-3 e IL-15 principalmente activa STAT-5 [6], [7], [8]. Tanto o yc e JAK3 são essenciais para a função de todos os receptores de citocina desta família e são necessários para o desenvolvimento do sistema de célula linfóide. Com efeito, defeitos genéticos ou yc de JAK3 resulta numa deficiência imunitária combinada severa (SCID), caracterizada pela falta de T, B e células NK, em ambos os ratinhos e seres humanos [9], [10], [11]. No entanto, deve salientar-se que, em pacientes SCID, a terapia genética corretivo para yc pode atuar como um contribuinte para a gênese de linfomas de células [9], [11]. A cadeia IL-2Rγ também é expresso em células não linfóides e é detectada, por exemplo, em determinadas células epiteliais tumorais [12], [13], [14] onde a quantidade de yc está envolvido nos mecanismos que regulam o crescimento celular. IL-2Rγ também é encontrada em células epiteliais normais onde ele modula a transdução do sinal de diferentes membros da família yc, mesmo se as suas funções biológicas específicas não foram ainda claramente definidos [13], [15], [16].

as células epiteliais humanas de vários tecidos de produzir IL-15, que actua não só nas células imunitárias (por exemplo, IELs no intestino), mas também em células epiteliais, principalmente através da sua acção anti-apoptótica [17], [18] , [19], [20]. Assim, demonstrou-se que as células epiteliais tubulares rato renal humana e (RPTEC) expressam constitutivamente o receptor de IL-15Rαβγ [15] e secretar a citocina IL-15 [21], que desempenha um papel importante na fisiologia renal como um factor de sobrevivência autócrino . Com efeito, o aumento da sensibilidade das células à apoptose é observada no rim danificado de IL-15 – /-, a IL-15 Ra – /- knockout ratinhos ou durante a lesão renal aguda induzida por diferentes protocolos que induzem a um decréscimo nos níveis de IL-15 de produção por epitelial células [20], [22]. A IL-15 aumenta a função da barreira intestinal, promovendo a formação de junções apertadas entre as células epiteliais [23]. Estes resultados sugerem que o fator de sobrevivência IL-15 pode ter outras funções, que continuam a ser explorada em células epiteliais renais [15], [24], [25], [26].

Devido à sua imuno -Estimular actividade em vários modelos pré-clínicos, a utilização de IL-15 pode ser uma citoquina útil para o tratamento de cancros do rim. Embora a IL-15 está actualmente a ser testada em ensaios clínicos para o tratamento de cancro do rim (NCT01021059 Protocolo) [2], as funções da citocina em células epiteliais normais, bem como células de tumor permanecem pouco estudada. A fim de melhor compreender as funções da citoquina, propomo-nos estudar o sistema IL-15 /IL15R em células epiteliais de rim humanas de origem normal (RPTEC) e sobre as células de origem tumoral (RCC).

O nosso dados mostram que ambos

in vitro e in vivo

células primárias normais renal tubular proximal (RPTEC) expressar o receptor da IL-15Rαβγ, enquanto que a expressão da cadeia yc e JAK3 está gravemente comprometida em células cancerosas claras renais (RCC) . A expressão diferencial de cadeia yc e JAK3 tem um impacto significativo sobre a homeostase renal desde solúvel de IL-15 em RPTEC através da via de sinalização de cadeia yc preserva a expressão do gene supressor de tumor de E-caderina, inibindo a sua transição compromisso (EMT) epitelial-mesenquimal . Por outro lado, a perda da cadeia yc e JAK3 no CCR primária leva à formação de um funcional de IL-15Rαβ heterodímero de elevada afinidade sem precedentes, cuja estimulação com solúvel de IL-15 faz com que a sub-regulação da expressão de E-caderina favorecendo o processo de EMT .

Materiais e Métodos

Os anticorpos, citocinas e Reagentes

Os anticorpos (ABS) contra a IL-15 (L-20), IL-15R (sc-9172) , IL-2Rp (sc-1046), IL-2Rγ (SC-670), JAK3 (SC-513), e vimentina (SC-73260) foram obtidos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA). Os anticorpos contra ERK fosforilada (4377), IkB fosforilada (4921), STAT5 (9358) STAT5 fosforilado (9356), e o anticorpo monoclonal de coelho fluor-conjugado Alexa contra STAT5 fosforilado (3939) foram obtidos a partir de Cell Signaling (Beverly, MA). Os anticorpos contra a IL-15Ra (AF247), a E-caderina (AF648) e conjugado com PE anti-E-caderina (FAB18381P) foram obtidos a partir de R D Systems Europe Ltd. (Abingdon, Oxon, Reino Unido), bem como neutralizando anti- IL-2Rγ (mAb2842) mAb. O ASO2 anti-fibroblastos conjugado com FITC foi de

Dianova

GmbH (Hamburgo, Alemanha) e do pan-citoqueratina (CK) Ab de EXBIO (Praga, República Checa). faloidina conjugada com rodamina para a detecção e zonula F-actina occludens-1 (ZO-1) foram obtidas de Invitrogen (Cergy Pontoise, França). Anticorpo contra JAK3 (07-1488) era da Millipore (Saint-Quentin-en-Yvelines, França) e anti-IL-2Rp (AB364) foi de Ensaio Biotech (Innovations Interchim Bioscience, França). O mAb anti-actina β (A1978) foi da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Humana recombinante não glicosilada de IL-15 (rhIL-15) e anticorpos neutralizantes anti-IL-2Rp Mikβ1 mAb foram obtidos a partir de (ImmunoTools Friesoythe, Alemanha) e peroxidase de rábano (HRP) e -conjugated Abs secundários fluorescentes foram conjugados a partir de Jackson ImmunoResearch. inibidor de JAK3 (CP-690, 550) e o inibidor de STAT5 (573108) foram adquiridos a partir de Calbiochem (SD, CA). Anti-IL-15R M161 mAb foi fornecido por Amgen (Thousand Oaks, CA).

células e linhas de células primárias

normal de células renais proximal tubular epitelial humana primária (RPTEC) derivada de um não rim -cancerous (Lonza, Verviers, Bélgica) e expandiu

in vitro

seguindo as instruções do fabricante. meio de cultura de REGM RPTEC foi mudado diariamente para manter as características epiteliais. células de tumor primário foram obtidos por digestão enzimática de fragmentos de carcinomas de células renais claras (RCC), tal como descrito anteriormente [27]. Subsequentemente, as suspensões celulares foram digeridos semeados em placas de Petri de plástico, utilizando meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro de vitela fetal, 1% de piruvato de sódio MEM, 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies). Nestas condições de cultura, apenas uma fracção das células adere à superfície de plástico e prolifera, gerando RCC culturas primárias e subsequentemente linhas celulares (RCC5, RCC7, RCC8).

O carcinoma do rim humano ACHN (ATCC, CRL- 1611), MCF-7 (células de cancro da mama humano) e U937 (células de leucemia monocítica humana) linhas de células foram cultivadas tal como descrito acima. A linha celular de eritroleucemia TF1β foi mantida em meio RPMI 1640 suplementado com 5 ng /mL de GM-CSF e /mL de geneticina G418 250 ug. Linfócitos do Sangue Periférico (PBL) foram preparados como anteriormente descrito [28]. amostras humanas foram recolhidos e tratados no pleno respeito da declaração de Helsinki.

transcrição reversa (RT)-PCR análise.

transcrição reversa (RT)-PCR análise foi realizada como previamente descrito [29]. Específicas iniciadores de RT-PCR são detalhados abaixo

IL-15R F 5′-GGCGACGCGGGGCATCAC.; R 5′-TGCCTGTGGCCCTGTGGATA; IL-2Rp F 5′-GAATTCCCTGGAGAGATGGCCACGGTCCCA; R 5′-GAATTCGAGGTTTG GAAATGGATGGACCAAGT; cadeia yc F 5′-CCAGGACCCACGGGAACCCA; R 5′-GG TGGGAATTCGGGGCATCG; JAK3 F 5′-CGTTCATGCAGCCTCTTGTTC; R 5′-GCGCA CCGTCCTCCGAATAC; β-actina F 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA; R 5′-CTCCTTA ATGTCACGCACGATTTC.

IL-15 ensaios de ligação

Humano rIL-15 foi marcado radioactivamente com iodo (radioactividade específica aproximadamente 2000 cpm /fmol) utilizando um método de cloramina-T e ligação experiências foram realizados como descrito anteriormente [30]. A ligação não específica foi determinada na presença de um excesso de 100 vezes de citocina não marcado. Para as experiências de ligação de IL-15, as células foram incubadas RCC7 com concentrações crescentes de rIL-15 marcada. A análise de regressão dos dados de ligação foi realizada utilizando uma equação de ligação de um site de equilíbrio (Grafit, Erithacus Software, Staines, Reino Unido), e os dados foram plotados no Scatchard sistema de coordenadas. Para a inibição de IL-15 experiências de ligação, as células RCC7 foram incubadas na presença de concentrações elevadas de rIL-15 iodada, e as concentrações de anticorpos contra a IL-2Rp (Mikβ1, 10 ug /ml) ou IL-2Rγ neutralizantes fixo (mAB2842 , 1 ug /ml) cadeias. A análise de regressão dos dados foi realizada utilizando uma equação logística de 4 parâmetros (Grafit, Erithacus Software).

Plasmids e transfecção transiente

pCMV6 vector de codificação de comprimento completo cDNA Myc-DDK-marcado ORF de interleucina 2 do receptor gama humana (IL2Rγ) foi adquirido a partir de Origene Technologies Inc (Rockville, MD, EUA) e o ADNc humano de comprimento completo JAK3 subclonado entre os sítios de restrição de EcoRI-XhoI de o

pcDNA3.1

vector de expressão eucariótica foi uma simpática oferta do Dr. Franck Gesbert (UMR1004, Inserm, França). Os plasmídeos foram transformados em células de bactérias da parte superior 10 competentes de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA), extraiu-se usando um kit Maxiprep (Qiagen, Valencia, CA), e amplificadas por cultura em caldo de Luria-Bertani-ampicilina. Os cDNAs foram transientemente transfectados para células de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de seis poços (0,25 × 10

6 células /poço) e cultivadas durante a noite em meio completo. A mistura transiente, que continha 1,0 ug de ADN de plasmídeo e 6 ul de Fugene 6 reagente de transfecção (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) em 100 ul de meio DMEM isento de soro (Invitrogen), foi misturada durante 20 min à temperatura ambiente e, em seguida adicionados a cada poço com meio completo durante 48 h. O vazio

pcDNA3.1

vector foi transfectado como controle.

citometria de fluxo análises

Para todos os ensaios descritos abaixo, nós adquiridos dados de fluorescência para 10.000 células em um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences) e os dados foram analisados ​​utilizando o software CellQuest (BD Biosciences). Três réplicas foram usadas para cada condição e a experiência foi repetida pelo menos três vezes.

Expressão da Cellular antigénios.

A expressão de superfície celular (E-caderina) e intracelular (vimentina, Pan CK) antigénios foi analisada por citometria de fluxo como descrito anteriormente [29], [31], [32]. Resumidamente, suspensões de células enzimaticamente isoladas foram permeabilizadas ou não com BD Cytofix /Cytoperm reagente (BD Pharmingen, Le Pont de Claix, França), e 10

5 células foram suspensas em meio RPMI suplementado com FCS a 1% e coradas com conjugado anticorpos dirigidos contra os marcadores de células acima mencionadas. Subsequentemente, as células foram fixadas por incubação com 1% de paraformaldeído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 20 minutos à temperatura ambiente e analisadas por citometria de fluxo.

STAT5 de activação.

investigado activação STAT5 em RCCWT (RCC tipo selvagem) e IL-2Rγ e /ou transfectadas CCR-JAK3 por tratamento de células com 10 pg /ml de rhIL-15 durante 40 minutos. Tratadas e células não tratadas foram separadas por tripsina, lavadas e fixadas por incubação com 1% de paraformaldeído em PBS durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram permeabilizadas por ressuspensão, com agitação em vórtice, em metanol arrefecido com gelo e incubou-se a 4 ° C durante 10 minutos. As células foram lavadas em 1% de BSA em PBS e incubadas com um anticorpo monoclonal de rato Alexa Fluor 488 conjugado contra STAT5 fosforilado durante 60 minutos a 4 ° C.

de imunoprecipitado Análises

Todos imunotransferência (WB) foram realizados como previamente descrito [29]. Para imunoprecipitação, sedimento celular PBS-lavado foi lisadas em 1 ml de 1% de NP-40 e 0,1% de SDS, 50 mM de tampão de fosfato de sódio pH 7,8, NaCl 150 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1 mM AEBSF, aprotinina, leupeptina e pepstatina (5 ug /ml de cada). Após 15 min com agitação a 4 ° C, a suspensão foi centrifugada (30 min a 14000 rpm, 4 ° C). O sobrenadante foi adicionado a 20 ul de Sepharose conjugada-M161 (anti-IL-15Ra, 2 ug /uL). Após 4 h de agitação a 4 ° C, os imunocomplexos foram lavados 5 vezes com 1 ml de tampão de lise e aplicado em 10% SDS PAGE-. As membranas foram processadas como anteriormente descrito [29].

A imunocitoquímica

As células foram colocadas em compartimentos de oito poços de lâminas de câmara de cultura de tecido Lab-Tek (1 × 10

5 células por poço ;. Nunc, Naperville, Illinois) e a confluência, tratados ou não com 10 pg /ml de rhIL-15 durante 5 dias. Para a coloração da membrana, as células foram fixadas com methanol:acetone frio (01:01) a -20 ° C durante 10 min, lavou-se, em seguida, bloqueadas com PBS BSA a 3% durante 60 min. As células foram incubadas com anticorpos anti-anti-humano ASO2 E-caderina ou conjugados com FITC durante a noite a 4 ° C. Subsequentemente, as células foram lavadas, incubadas durante 30 min com um anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com AlexaFluor488. Para a coloração intracelular, as células foram fixadas com 4% (p /vol) de paraformaldeido em PBS e permeabilizadas por incubação durante 1 minuto com 0,5% de Triton X-100 em PBS. As células foram incubadas com solução de bloqueio (BSA a 3% em PBS) e incubadas durante a noite a 4 ° C com os vários anticorpos. As células foram então lavadas e incubadas com Alexa Fluor 488-coelho conjugado anti-ratinho ou anti-IgG de cabra diluído em solução de bloqueio e incubou-se durante 30 minutos. organização F-actina foi revelado coloração das células com 0,2 ug /mL de rodamina faloidina conjugada durante 20 minutos. As células foram lavadas com PBS, montadas em 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, Invitrogen, Cergy Pontoise, França), e visualizadas por microscopia de fluorescência (Leica, Alemanha).

A imuno-histoquímica em incluídas em parafina tumor renal incorporado e amostras normais

As biópsias de 3 10 secções de tumores de rins nefrectomia com carcinoma renal normal e foram seccionados a 4 mm para Superfrost além de slides. lâminas desparafinizadas foram re-hidratadas em álcoois graduados e submetida a calor induzido por recuperação de epítopo por imersão em 0,01 mol /L de tampão citrato (pH 6,0). As secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anti-JAK3 (07-1488) Abs anti-IL-2Rp (AB364), anti-IL-2Rγ (SC-670) ou, PBS-enxaguadas e incubadas com Ab-HRP secundário para 45 min. A análise foi realizada por métodos convencionais, utilizando diaminobenzidina após contracoloração das secções com hematoxilina. O controlo negativo foi sujeito a todos os tratamentos omitindo o anticorpo primário. As lâminas foram digitalizados usando um scanner Aperio (Vista, CA) e coloração foi quantificada usando um software TRIBVN morfométricas (Montrouge, França).

Resultados

IL-15R expressão em RPTEC e RCC culturas primárias

a fim de lançar luz sobre a função da IL-15 no modelo humano renal, foi investigada a expressão de subunidades dos receptores IL-15 (IL-15Rαβγ) em culturas primárias de normalidade celular renal proximal tubular epitelial ( RPTEC) e células claras carcinomas renais (RCC).

análise de RT-PCR (Figura 1A, painel superior) mostra que RPTEC, de acordo com o controle PBL positivo, expressam diferentes transcrições para a cadeia IL-15R ( 432 e 531 pb), a transcrição para o IL-15Rβ (542 pb) ea transcrição para a cadeia yc (480 pb). Em contraste, apenas a cadeia beta da IL-15Ra e, mas não a cadeia yc, foram detectados quer no RCC (RCC5 e RCC7) ou linha celular ACHN. Uma vez que a JAK3 quinase interage especificamente com o seu receptor cognato cadeia yc, e a expressão de ambas as moléculas é interdependente [33], que ainda analisados, por RT-PCR, a expressão de JAK3 em células renais normais e tumorais (Figura 1A, o painel inferior). JAK3 quinase foi detectado na linha celular de controlo positivo TF1β hematopoiética e RPTEC, enquanto uma quantidade mensageiro fraco ou ausente (RCC8) foi detectado no RCC analisados. Nenhuma mensageiro JAK3 foi detectada na célula de controlo MCF-7 [34].

Análise de IL-15R e expressão JAK3 foi realizada por RT-PCR (A) e imunotransferência (B) no modo normal primário (RPTEC) e tumoral (RCC5, RCC7, RCC8) células epiteliais e a linha celular ACHN. Os dados mostram que RPTEC expressar as três cadeias da IL-15R (αβγ) e JAK3 enquanto que as proteínas yc e JAK3 não foram detectados em RCC. iniciadores específicos ou Abs contra a IL-15Ra (AF247), IL-2Rp (sc-1046), IL-2Rγ (SC-670) e foram usadas JAK3 (SC-513). PBL, TF1β, MCF7 e de células U937 de IFN-y-activados foram utilizados como controlos. Arrumação β-actina foi utilizado como controlo de carga.

Para confirmar a expressão diferencial das subunidades do receptor e a quinase JAK3 ao nível da proteína, imunotransferência foi realizada em ambas as células normais e tumorais. A análise confirmou que RPTEC, carcinoma de células renais e as células TF1β expressar duas bandas principais de 46 e 56 kDa específica para a IL-15Ra (figura 1B, painel superior) e uma banda de 75 kDa para a cadeia IL-15Rβ (Figura 1B, painel do meio) . A ausência da cadeia yc no RCC foi confirmado, uma vez a banda de 64 kDa é detectada exclusivamente em linhas de células de controlo positivo (TF1β e IFN-γ U937 tratados) e RPTEC (Figura 1B, painel do meio). molécula de JAK3 (116 kDa) foi detectado em TF1β e células RPTEC, enquanto imunotransferência não detectar a quinase no RCC, bem como em células MCF-7 e IFN-γ tratada linhas de células de controlo U937 como relatado anteriormente [34], [35] (Figura 1B, painel inferior). Em todos os experimentos acima mencionados, nós também estudou linha renal ATCC-CRL-1611 celular (ACHN) que exibem IL-15R e homólogos expressão JAK3 às observadas em amostras primárias de RCC.

Perda de cadeia yc no renal amostras de tecidos de carcinoma de células claras

a fim de confirmar nossos

in vitro

dados, cadeia de IL-2Rp, cadeia yc e JAK3 colorações imuno-histoquímica foram realizadas em seções normais e tumorais de rins nefrectomia com células renais carcinoma. Hematoxilina de coloração de secções de rim humanos embebidos em parafina sob microscopia de luz revelou a presença de glomérulos (Gl) e vários túbulos distais (dT) e proximal (PT) nas amostras de tecidos normais (Figura 2). Por outro lado, estas estruturas renais não estão mais presentes na seção de carcinoma renal, mostrando células tumorais com a morfologia das células claras, caracterizada por citoplasma opticamente clara e membrana celular agudamente delineadas.

Hematoxilina coloração de biópsias de 2 amostras normais revela a presença de estruturas renais normais (glomérulo (Gl), distal (dT) e proximal (Pt) túbulos), enquanto que a análise de duas amostras de cancro diferentes mostra que a arquitectura do tecido normal é totalmente perdido e são substituídas por células tumorais com células claras morfologia, caracterizada por citoplasma opticamente clara e membrana celular agudamente delineadas. Considerando que não se observa qualquer diferença na produção de IL-2Rp entre amostras de tecidos normais e tumorais, a coloração com IL-2Rγ, localizada proximal e distal túbulos em amostras de tecidos normais, não se encontra nas amostras de tumor. Um forte coloração de JAK3 está localizada a ambas as células tubulares distais e proximais de tecidos normais, enquanto que uma expressão de proteína JAK3 muito fraca é detectado em amostras de tumor. Duas amostras representativas de um total de dez são mostrados para cada coloração. O controlo negativo foi sujeito a todos os tratamentos omitindo o anticorpo primário. As barras de escala, 50 | im. A coloração foi quantificada utilizando um software TRIBVN morfométrica (Montrouge, França) e os resultados são apresentados como histogramas.

coloração imuno-histoquímica em duas amostras diferentes renais normais revela que a cadeia, cadeia yc IL-2Rp e uma forte expressão JAK3 são detectados em células tubulares proximais e distais. Em contraste, a análise de amostras de tumor diferentes revelou a ausência de coloração cadeia yc (P 0,01), com uma expressão de proteína JAK3 muito fraco (P 0,01) ao passo que, não houve diferenças significativas (P 0,05) na expressão da IL-2Rp foram observados em cadeia entre os tecidos normais e tumorais, portanto, confirmando os resultados obtidos

in vitro

em culturas primárias de células normais e cancerosas.

solúvel IL-15 dispara um sinal celular diferencial na RCC e RPTEC

Para o nosso conhecimento, o heterodímero IL-15Rαβ só foi descrito em IL-2Rγ – /- camundongos knockout, que exibe um eficiente endocitose de ligação e de radiomarcado IL-15 [36]. No entanto, os autores não investigar se o heterodímero IL-15Rαβ existe como um complexo pré-formado ou está formado na sequência IL-15 vinculativo gerando assim um heterodímero funcional.

Para avaliar a IL-15 obrigatória para RCC yc-negativos, analisou-se em primeiro lugar marcado radioactivamente IL-15 humana (rhIL-15) ligação a células RCC7 pela análise de Scatchard de trama (Figura 3A) recombinante. Os dados revelam a presença de uma única classe de receptores de elevada afinidade (Kd = 375 pM, 413 IL-15 sítios de ligação por célula). IL-15, a ligação especifica foi completamente abolida pelos anticorpos anti-IL-2Rp mAb Mikβ1 (Figura 3A, inserir), enquanto que anticorpos neutralizantes anti-IL-2Rγ mAb não teve efeito sobre específica a IL-15 de ligação, o que sugere que a ligação de facto reflectiu a presença um complexo de IL-15R /IL-2Rp

a) análise de Scatchard da trama:. Efeitos do anticorpo anti-IL-15Rβ e yc mAbs sobre a IL-15 de ligação ao RCC. Para as experiências de ligação de IL-15, as células foram incubadas RCC7 com concentrações crescentes de rIL-15 marcado radioactivamente com iodo em presença ou não de os seguintes mAbs neutralizantes: anti-IL-2Rp e IL-2Rγ. A ligação de células não-específica foi determinada na presença de radioiodado rhIL-15 e um excesso de 100 vezes de rhIL-15 não marcada. ligado às células fracções não ligadas livres (, F) (B) e foram medidos, e a fracção ligada específica foi calculada subtraindo a ligação não específica a partir da fracção ligada à célula. Na ordenada é representada graficamente a relação entre a fracção ligada específicos (expressos em locais por célula) através da concentração total (ligado mais livre) de rIL-15 (expressa em pM) marcado com iodo radioactivo. Na fracção ligada abcissa (expressa em locais por célula). A alta afinidade específica a IL-15 de ligação (Kd = 375 pM, 413 IL-15 locais por célula de ligação), a qual foi completamente anulada pela anticorpos neutralizantes contra a IL-2Rp (inserção), mas não a cadeia yc, sugeriu a presença de RCC um complexo de IL-15R /IL-2Rp. B) Detecção do complexo IL-15Rαβ por imunoprecipitação (IP) com anti-IL-15Ra (M161) ou IgG de rato de proteína G-Sepharose conjugada no lisado total (LT) de RCC7. complexos imunoprecipitados foram transferidas, quer com anti-IL-2Rp (sc-1046) e anti-IL-15Ra (sc-9172). C) A estimulação por 10 e 40 min com fisiológica (10 pg /mL) e supra-fisiológica (10 ng /ml) concentrações de rhIL-15 induz a fosforilação da MAPK ERK1 /2 e IκBα em RPTEC e RCC7, ao passo que a activação STAT5 foi observada apenas em RPTEC. Histogramas representam comparação densitometria de cada fator normalizadas para beta-actina em 3 diferentes RCC (RCC5, RCC7, RCC8) e 3 lotes RPTEC. * P 0,05 versus controlo, teste de Mann-Whitney. Um representante experimento de um total de três é mostrado.

Para confirmar a presença de um heterodímero de IL-15Ra complexo /IL-2Rp, as potenciais interacções entre as cadeias da IL-15Ra e IL-2Rp em RCC foram investigados realizando experiências de co-imunoprecipitação de lisados ​​de células RCC7 por imunoadsorção com Sepharose conjugada com anticorpo anti-IL-15Ra (M161) (Figura 3B). Anti-IL-2Rp imunotransferência revela a presença de uma proteína específica de 75 kDa (painel superior) enquanto que o anti-IL-15Ra blot, realizada na mesma membrana, mostra a expressão de bandas específicas de 56 e 46 kDa (painel inferior) indica que subunidades do receptor de IL-2Rp e IL-15Ra são constitutivamente associados, formando um heterodímero de IL-15Rαβ na ausência de citoquina.

de modo a determinar se o complexo de IL-15Rαβ expressa em RCC é funcional, nós investigamos activação de transdução de sinal em células renais normais e tumorais tratadas com fisiológica (10 pg /mL) e supra-fisiológica (10 ng /ml) concentrações de rhIL-15 (Figura 3C). Estimulação com rhIL-15 (10-40 min) induziu em RCC7 a fosforilação da MAPK ERK1 /2 em ambas as concentrações, enquanto nenhuma fosforilação STAT5 foi observada mesmo na presença de 10 ng /ml de rhIL-15 (Figura 3B, o painel superior ). Em contraste, em RPTEC expressar o complexo receptor heterotrimérica, a activação das MAPK ERK1 /2 e STAT5 foi induzida em resposta a 10 pg /mL e 10 ng /ml de rhIL-15. Além disso, há uma rápida fosforilação da IκBα, um acontecimento chave na activação do factor de transcrição NF-kB, no RPTEC e RCC7 em resposta ao fisiológica de rhIL-15 concentração (Figura 3B, painel inferior), indicando que a IL-15Rαβ complexo liga-se a IL-15 a uma elevada afinidade e é funcional.

Solúvel de IL-15 controla a expressão de e-caderina nas células epiteliais renais

e-caderina é responsável por manter as interacções de células epiteliais e é frequentemente regulada para baixo durante a progressão tumoral [37]. Assim, foi investigado o efeito de rhIL-15 sobre a expressão de E-caderina em ambos RCC7 RPTEC e por análise de imunofluorescência (Figura 4A) e imunotransferência (Figura 4B). Para avaliar o efeito de rhIL-15 na RPTEC normal, foi utilizado um modelo de célula, onde a privação de corticosteróides, que são indutores potentes da caderina-E [38], juntamente com falta de renovação do meio diária leva dentro de cinco dias para a diminuição da expressão, sem afectar a viabilidade celular de caderina-E (97%, dados não mostrados). Análise por imunofluorescência (Figura 4A) mostra que as células epiteliais normais RPTEC nas primeiras passagens (P2) exibe uma morfologia epitelial semelhante caracterizado por um elevado nível de expressão de membrana de E-caderina (D0 basal) em contraste com os cinco dias RPTEC idade (D5 basal ) que apresentam baixa expressão de caderina-E, na ausência de renovação do meio dia. A adição de 10 pg /ml de rhIL-15 durante cinco dias preserva o nível de E-caderina inicial e, portanto, uma morfologia epitelial semelhante. Em contraste com RPTEC, RCC7 no dia 0 e no dia 5 visor uma fraca expressão de E-caderina, que desaparece após 5 dias de rhIL-15 do tratamento (Figura 4A). Immunoblotting análise (Figura 4B) mostra claramente os efeitos opostos de rhIL-15 sobre a expressão da forma de 120 kDa de E-caderina em madura RPTEC contra RCC (dia 5).

análise de imunofluorescência (A) e (imunotransferência B) mostram que 5 dias rhIL-15 tratamento (10 pg /mL) preserva membrana expressão de E-caderina nas células epiteliais normais RPTEC primária, ao passo que induz a sua infra-regulação em RCC7. O meio de cultura de RPTEC não foi alterado, a fim de induzir a diminuição da expressão de E-caderina. O tratamento com rhIL-15 foi renovado no dia 3. Os histogramas representam comparação densitometria de imunotransfer�cias E-caderina normalizada para p-actina em 3 diferentes RCC células (RCC5, RCC7, RCC8) e 3 lotes RPTEC.