Abstract
FBXW7
atua como um supressor de tumor através ubiquitinação e degradação de várias oncoproteínas. A perda da expressão FBXW7, que pode ser parcialmente atribuído pela deleção ou mutação genómica do locus de FBXW7, é frequentemente observado em vários cancros humanos. No entanto, os mecanismos que regulam a expressão FBXW7 ainda permanecem pouco compreendidos. Aqui nós examinamos a região 5 ‘de
FBXW7
gene para investigar a regulação da expressão FBXW7. Foram identificados sete formas de splicing alternativo (AS) 5′-UTR de FBXW7α que são compostas de vários novos exões não codificantes. Uma diferença significativa na eficiência de translação entre estes 5′-UTRs variantes foi observada por in vivo ensaio de repórter de luciferase e Western blot. Além disso, verificou-se que o nível de ARNm do formulário como com alta eficiência de translação foi especificamente reduzida em mais de 80% das linhas celulares de cancro da mama e em mais de 50% dos cancros primários humanos a partir de vários tecidos. Além disso, nós também identificaram mutações de FBXW7 em cancros da próstata (5,6%), cancros do rim (16,7%), e cancros da bexiga (18,8%). Nossos resultados sugerem que, além de mutação, expressão diferencial de FBXW7α como formas com diferentes propriedades de translação pode servir como um novo mecanismo para a inactivação de FBXW7 no câncer humano
Citation:. Liu Y, Ren S, Castellanos-Martin A, Perez-Losada J, Kwon YW, Huang Y, et al. (2012) Várias novas formas de splicing alternativo do FBXW7α têm uma função Translational modulatória e Mostrar alteração específica em Câncer Humano. PLoS ONE 7 (11): e49453. doi: 10.1371 /journal.pone.0049453
editor: Jingwu Xie, da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América
Recebido: 19 Agosto, 2012; Aceito: 09 de outubro de 2012; Publicação: 14 de novembro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. JPL é parcialmente financiado pelo FEDER e MICINN (PLE2009-119), FIS (PI10 /00328) “Fundación Eugenio Rodríguez Pascual”, e Fundación Inbiomed (Instituto Oncológico Obra social de la Caja Guipozcoa-San Sebastian, Kutxa). YS é apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (2012CB518300) e do Ministério da Ciência Tecnologia de Xangai (08410701500). JHM é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer concessão R01 CA116481, Low Dose Foco Scientific Area, Office of Biological Pesquisa Ambiental, Departamento de Energia (DE-AC02-05CH11231) norte-americano, Laboratório de Pesquisa Dirigida Programa de Desenvolvimento (LDRD) e NASA Centro Especializado de Investigação em Radiação Efeitos na Saúde (NNX09AM52G). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O gene
FBXW7
é um alvo transcricional de p53, cuja expressão é regulada positivamente em uma p53-dependente forma após o tratamento de radiação [1]. O gene de
FBXW7
codifica uma proteína F-box, que é essencial para a ubiquitinação de oncoproteínas diferentes, incluindo c-Myc [2], [3], c-Jun [4], ciclina E [5] , [6], os diferentes membros da família Notch [7], [8], a Aurora-a [1], [9], mTOR [10], [11], e KLF5 [12], [13]. A sobre-expressão de vários destes objectivos, tais como a ciclina E [14], c-Myc [15] e a Aurora-A [16] tem sido implicada para induzir instabilidade genómica. Estas observações demonstram que
FBXW7
é um gene supressor de tumor humano, uma conclusão que também é suportado pela descoberta de
FBXW7
mutações genéticas em cancros de um largo espectro de tecidos humanos, tais como a bile duto, sangue, osso, cérebro, mama, cólon, endométrio, estômago, pulmão, ovário, pâncreas e próstata, com frequência ponto de mutação global de 6% [17].
a supressão da
Fbxw7
gene em camundongos leva a letalidade embrionária, mas camundongos heterozigotos desenvolvem normalmente [18], [19]. Embora eles não desenvolvem tumores espontâneos, a exposição à radiação dá origem a diferentes tipos de tumores, incluindo uma gama de cancros epiteliais [1]. Os ratos que carregam os alelos inativadas de ambos
Fbxw7
e
p53
show de aceleração do desenvolvimento do tumor. perda Haploinsufficient de
Fbxw7
é observado na maioria dos linfomas neste modelo de ratinho, mesmo os decorrentes de
Fbxw7 /p53
camundongos heterozigotos duplos, ou seja, a perda de apenas uma cópia do gene pode gerar um impacto biológico substancial [1]. Observações semelhantes de mutações heterozigóticas foram subsequentemente encontrado em tumores humanos [20]. Por conseguinte, é provável que o impacto global deste gene supressor de tumor no cancro humano é maior do que a frequência de mutação 6% acima referido, uma vez que a perda de apenas uma cópia do gene pode ter um efeito substancial sobre o desenvolvimento do tumor. As deleções do cromossoma 4q31, em que
FBXW7
está localizado, é comum em muitos tipos de cancros humanos [21] – [25], o que sugere que a interrupção desta via pode ser uma característica importante de muitas, ou mesmo um maioria, dos cancros humanos.
o 5 ‘não traduzida (5′-UTR) desempenha um papel importante no controlo da expressão do gene eucariótico [26]. Estudos recentes sobre o transcriptoma de mamíferos sugerem que a maioria dos genes expressar múltiplos splicing alternativo (AS) 5′-UTR, e UTR heterogeneidade de um gene específico provavelmente tem um efeito diferencial na expressão da proteína [27], [28]. Notavelmente, muitos oncogenes e genes supressores de tumores também são capazes de expressar atipicamente complexos 5′-UTR [29], [30]. Além disso, torna-se claro que a expressão inapropriada de 5’-UTR Tal como foi mostrado para contribuir para o desenvolvimento de cancro [31], [32].
No presente estudo, foi investigada a região 5 ‘ de
FBXW7
para entender seus mecanismos reguladores, e identificou vários novos exons não-codificantes em FBXW7α isoforma, que produziu vários 5′-UTR como formas. O impacto funcional destas 5′-UTR sobre a eficiência da tradução foi mostrado para regular posteriormente expressão FBXW7α. FBXW7α 5′-UTR são diferencialmente expressos entre os vários tecidos normais e de tumor, o que resulta na alteração nos níveis de expressão FBXW7α durante a carcinogénese provável. Nossos achados deste estudo sugerem que a expressão diferencial de FBXW7α como formas serve um novo mecanismo de inativação
FBXW7
no câncer humano.
Resultados
Várias novas formas de splicing alternativo identificado em
FBXW7
gene
Três FBXW7 isoformas (α, p e y) foram relatados até agora. Eles diferem no primeiro exão e compartilhar os seguintes 2-11 exons. A fim de examinar a regulação da
FBXW7
expressão, caracterizamos ‘região de FBXW7α, β e γ isoforma usando 5’ a 5 técnica de RACE com cDNA a partir da célula epitelial mamário humano (HMEC) 184A1. análise de sequenciação de 115 clones RACE revelou cinco novos exons não-codificantes dentro
FBXW7α
5′-UTR quando alinhado com a seqüência genômica humana, ao passo que há exons adicionais foram detectados a partir de
FBXW7β Comprar e
FBXW7γ
por sequenciação de 27 e 31 clones RACE respectivamente (Figura 1). O
FBXW7α
5′-UTR sofre splicing alternativo (AS) para produzir sete transcritos de ARNm com o mesmo local de tradução primário de iniciação (Figura 1, Tabela S2). Estes resultados foram confirmados por explodir as seqüências no banco de dados de seqüências expressas (dbEST). As sequências de sete formas de splicing alternativo foram depositados em Genebank com o número de acesso HQ873864-HQ873870.
ilustração estrutural de múltiplas formas de splicing de FBXW7α. Sete formas de splicing diferentes de FBXW7α foram identificados por 5′-RACE usando gene primer específico (SPG) e primer ninho (Rs1). O número de colónias para cada forma variante encontrada durante a triagem foi mostrado. A sequência N-terminal da isoforma β e γ também foi investigada por 5′-RACE utilizando os iniciadores correspondentes GSPβ, GSPγ, Nestβ e Nestγ. As setas representam os iniciadores utilizados neste trabalho e a sua posição na sequência correspondente.
Entre estes exões, 1αa 1αc e aparecem na maior parte das formas de AS, enquanto 1αd é apenas em um dos sete splicing formas (Figura 1). Curiosamente, 1αb e 1αd parecem, ao contrário de coexistir no mesmo AS formulário. Para confirmar isso, concebidos iniciadores de PCR específicos correspondentes às sequências correspondentes em 1αb e 1αd, respectivamente (Figura S1) e não foram capazes de detectar nenhuma banda de ARNm de tecidos utilizados neste estudo por RT-PCR (dados não mostrados). Além disso, não há novas ORF encontrada em todos os sete AS formas de FBXW7α, indicando que estes novos exons única formar diferentes regiões 5′-UTR de diferentes formas AS.
As diferenças na eficiência de tradução de diferentes
FBXW7α
como formas
para investigar o efeito funcional destas 5′-UTRs sobre a eficiência de translação posterior FBXW7α ORF, foi utilizado pela primeira vez um ensaio de repórter luciferase para comparar sete sequências 5′-UTR. Para este fim, cada clonado a montante 5′-UTR do gene da luciferase de pirilampo (LUC) no vector repórter do promotor pGL3 (Promega), e transfectada em células HeLa-los. Vazia pGL3-promotor foi utilizado como um controlo (Ctrl-LUC). a actividade da luciferase de Renilla-normalizado para cada construção foi comparado com o luc-Ctrl. Os resultados destes ensaios mostraram consistentemente as diferenças significativas nas actividades de LUC entre estes sete 5′-UTR variantes (Figura 2A). Spli2-UTR sempre exibiu a maior actividade LUC enquanto que o nível de actividade LUC em Spli1-UTR, Spli4-UTR, e Spli5-UTR foi intermediária, mas significativamente mais elevada do que Luc-Ctrl; a actividade LUC de Spli3-UTR, Spli6-UTR, e Spli7-UTR não foi estatisticamente significativo em comparação com LUC-ctrl (Figura 2A). A fim de corroborar que estas diferenças na actividade LUC não eram devidas às variações de LUC transcrição, foi realizada em tempo real quantitativa de RT-PCR (qRT-PCR). Como mostrado na Figura 2B, não houve diferenças significativas nos níveis de transcrição LUC entre as diferentes variantes de 5′-UTR quando comparado com Luc-Ctrl. Este resultado indica claramente que os 5′-UTR de FBXW7α regula a eficiência de tradução do ORF a jusante.
(A) Efeito de
FBXW7α
5′-UTR variantes sobre a actividade LUC. LUC construções repórter, que continham cada
FBXW7α
5′-UTR a montante do gene repórter LUC no vector pGL3, foram transfectados em células HeLa. A actividade LUC foi medida como o rácio Firefly /Renilla. Os resultados representam os dados de três experiências independentes. Cada experiência foi realizada em triplicado. Valores médios e desvios-padrão são mostrados. * P 0,05 em comparação com Luc-CTR. os níveis de transcrição (B) LUC foram examinados por qRT-PCR. O conteúdo de ARNm LUC foram normalizados para o conteúdo de ARNm de Renilla para todas as amostras e o ARNm LUC relativa para pGL3p (vector vazio, Promega) foi considerada arbitrariamente para ser de 1 (controle). (C) Efeito de 5′-UTR sobre os níveis de proteína FBXW7α. De imunotransferência foi desenvolvida com anticorpo anti-HA a partir de extractos com construto indicado. A intensidade de pcDNA3.1 (+) contendo o gene FBXW7α (controlo) foi considerada como 1. GFP foi usado como controlo da eficiência de transfecção, e β-actina como controlo de carga. Todas as transfecções foram efectuadas em triplicado, e as barras indicam o desvio padrão. * P 0,05 em comparação com o controlo. (D) frangments ADNc para FBXW7 (painel superior), a GFP (painel do meio) e GAPDH (painel inferior) foram especificamente amplificado por RT-PCR a partir de células HeLa transfectadas com as construções indicadas.
Para verificar adicionalmente o impacto de 5′-UTRs sobre a regulação da tradução, nós clonado sete 5′-UTRs para a montante da ORF FBXW7α em pcDNA3.1 marcado com HA epitopo e subsequentemente transfectadas las em células HeLa. análise de transferência de Western mostrou nível de expressão a partir da construção Spli2 era consistentemente mais elevada do que a observada com as outras UTRs e construções de controle quando normalizados para o nível de transfecção proteína de controlo da eficiência de GFP (Figura 2C), o que é consistente com os resultados do ensaio de repórter de luciferase . Confirmou-se que a diferença de expressão não é devido aos efeitos da transcrição desde que os níveis de ARNm não são significativamente diferentes (Figura 2D). Tomados em conjunto, concluiu-se que as variantes 5′-UTR de FBXW7α tem a função moduladora translacional.
perfis de expressão de
FBXW7α
como formas em tecidos normais humanos
Dado que 5 ‘-UTR pode regular a tradução da ORF a jusante, o próximo procurou investigar o padrão de expressão de
FBXW7α
como formas em tecidos humanos. Para este efeito, semi-quantidade de RT-PCR foi realizada em 21 tecidos humanos normais com diferentes conjuntos de iniciadores correspondentes a exões recentemente identificados (Figura 1, Tabela S1). RT-PCR foi realizada inicialmente com um par de iniciadores (F2 /Rs1) que pode detectar todos como formas. Como esperado, múltiplos como formas foram expressos em todos os tecidos humanos (Figura 3A, painel superior). Os AS formar Spli5, Spli4 e Spli2, correspondendo a banda de tamanhos 386 pb, 435 pb, 478 pb respectivamente, mostraram alto nível de expressão de mRNA (Figura 3A, painel superior), de acordo com os nossos achados em 5 ‘estudos de corrida, onde o número de clones correspondentes a estes como formas foram encontrados muito mais elevada frequência (Figura 1). O nível de expressão de diferentes FBXW7α como formas variaram entre os tecidos. Por exemplo, o Spli4 é a forma dominante em testículos (pista 12 na Figura 3A, painel superior) ao passo que a Spli2 é o mais expressa um em outros tecidos (Figura 3A, painel superior), o que sugere um padrão de distribuição associada a tecido.
(A)
FBXW7α
como formas níveis de expressão foram detectados por semi-quantitativo de RT-PCR utilizando os diferentes pares de iniciadores. (B) Os níveis de Spli1 2 e expressão Spli3-5 foram quantificados a partir da experiência mostrada em (A) do painel inferior. Os tecidos normais incluem: 1-esófago, 2-adiposo, 3-coração, 4-bexiga, 5-renal, cérebro-6, 7-hepática, 8-pulmão, colo-9, 10-cólon, 11-baço, 12- testículos, 13-timo, 14-thyraoid, 15-traqueia, 16-intestino delgado, músculo-esqueléticas 17, 18 próstata, 19-placenta, ovário-20, 21-mama. “M” representa DNAs escada marcador.
Como o sete como formas contêm cruzamento de vários exons em 5′-UTR, é difícil distinguir estas variantes. Assim nós projetamos os primers F2 /R2 localizados em 1αa exão e 1αc para comparar o nível de expressão da Spli1 2 (a soma de expressão Spli1 e Spli2) com as formas Spli3-5 (a soma de Spli3, Spli4 e expressão Spli5) . Descobrimos que Spli1 2 predominantemente expresso na maioria dos tecidos (Figura 3A, painel inferior, e a Figura 3b). Mas alguns tecidos, como baço, timo e do intestino delgado mostraram níveis de expressão iguais de Spli1 2 e Spli3-5 (pistas 11, 13 e 16 na Figura 3A, painel inferior, e Figura 3B), enquanto Spli3-5 é só alta expressa em testículos (pista 12 na Figura 3A, painel inferior, e Figura 3B).
expressão alternadas de
FBXW7α
específica como formas em cancros humanos
Uma vez que a expressão diferencial de 5′-UTR como formas tem sido associada com a progressão do tumor, foi investigado o perfil da expressão FBXW7α identificados como formas de cancro humano por semi-quantitativo de RT-PCR utilizando o mesmo conjunto de iniciadores descritos acima. O resultado de um painel de linhas celulares de cancro da mama 20 mostraram que a maioria das linhas celulares de cancro da mama têm níveis diminuídos de FBXW7α específica como formas em comparação com as células normais epiteliais mamárias humanas (HMEC) (184A1 e 184B5) (Figura 4A) de expressão. Quase todas as linhas de células de câncer de mama mostrou redução significante na expressão de Spli1 2 que não existem alterações na expressão de Spli3-5 em comparação com os níveis em HMECs (Figura 4A, painel inferior, a Figura 4B). Estas observações foram ainda confirmadas em um conjunto de 92 cancros da mama humanos primários. Em comparação com os tecidos da mama normal reunido, Spli1 2 níveis de expressão mostraram uma redução significativa em mais do que 50% dos tumores. Surpreendentemente, descobrimos que os níveis de expressão Spli3-5 mostrou aumento significativo em mais de 30% dos tumores (Figura 4C e D).
(a) o perfil de expressão de ARNm de FBXW7α como formas de cancro da mama humano e HMEC linhas celulares foi determinada por semi-quantitativo de RT-PCR, utilizando diferentes conjuntos de iniciadores. “B1 a B20” representa 20 linhas celulares de cancro da mama diferentes, “A1” significa 184A1, “B5” para 184B5. (B) Os níveis de Spli1 2 e expressão Spli3-5 foram quantificados a partir da experiência mostrada em (A) do painel inferior. (C) O perfil de expressão de mRNA representante da FBXW7α como formas de 92 cancros da mama primários humanos por semi-quantitativa RT-PCR usando diferentes conjuntos de primers. (D) Quantificação de Spli1 2 e expressão Spli3-5 níveis em 92 cancros da mama humanos primários. (E) O perfil de expressão de ARNm de FBXW7α como formas em 24 cancros renais humanas primárias por semi-quantitativo de RT-PCR utilizando conjuntos de iniciadores diferentes. (F) Quantificação de Spli1 2 e expressão Spli3-5 níveis em 24 cancros renais humanas primárias. “N” para RNAs obtidos a partir de tecidos normais, “m” para DNAs escada marcador.
Em seguida, determinar se a expressão diferencial de
FBXW7α
específica AS também ocorreu em outros tipos de humanos Câncer. Na verdade, a expressão
FBXW7α
é alternado de Spli1 2 a Spli3-5 no rim humano, próstata e cancro da bexiga (Figura 4E e F, Figura S2A e S2B). Este padrão de expressão diferencial de FBXW7α como formas em vários cancros humanos suporta substancialmente a nossa hipótese de que formas FBXW7α AS envolver na regulação da FBXW7α durante tumorigênese. Juntos, nossos resultados sugerem que os níveis de proteína total FBXW7 pode ser reduzida nas células tumorais através da expressão diferencial de FBXW7α como formas, e a diminuição da FBXW7 abundância afeta substancialmente a sua função na ubiquitinação e degradação de suas metas (oncoproteínas), conseqüentemente, resultando no desenvolvimento do tumor e progressão.
a análise mutacional de
FBXW7
em cancros urológicos humanos
Embora as mutações são raramente detectada em cancros da mama, alterações genéticas ainda são encontrados em cancros da próstata [35], e não existe nenhum relatório sobre as alterações genéticas em tumores da bexiga e nos rins. Além disso, as disparidades de câncer foram encontrados entre os diferentes grupos étnicos. Também não há relatório sobre a
FBXW7
espectro de mutações no câncer entre os pacientes chineses. Isso nos intriga para examinar se há mutações e qual é a freqüência das mutações em pacientes com câncer chineses. Assim, foi realizada a análise de mutações de
gene FBXW7
em 18 de próstata, 24 de rim e 16 de bexiga tecidos tumorais de pacientes chineses. Ambas as mutações e deleções foram encontrados nesses tumores, como mostrado, quer por electroforese em gel de sequenciação ou mapa na Figura 5. A sequenciação de fragmentos de RT-PCR confirmou encurtados duas amostras de bexiga e de uma amostra de rim têm deleções. Das deleções tumor da bexiga, um tumor tem uma delecção de parte do exão 8, além de todo o exão 9, enquanto que no outro tumor da bexiga todo o exão 2 e 3 sequências estão ausentes. O câncer de rim tem uma deleção de parte dos exons 8 e 10, juntamente com todo o exão 9 (Figura 5B-D, Tabela 1). A taxa global de mutações em cancros da próstata FBXW7 é 5,6%, 16,7%, em cancros do rim, e 18,8% em cancros da bexiga de pacientes chineses como resumido na Tabela 1.
(a) a análise de RT-PCR de
FBXW7
, produtos de RT-PCR contendo as supressões são indicadas por asterisco. (B-D) de sequenciação confirmaram a eliminação em dois cancros da bexiga (B e C), e um cancro do rim (D). (E) sequência Representante traça mostrando as mutações do
FBXW7
.
Discussão
Este estudo fornece novos insights sobre os mecanismos que regulam a expressão FBXW7α através um padrão de splicing romance. Nós identificamos sete romance como formas de
FBXW7α
por 5 técnica de RACE ‘. Embora eles produzem essencialmente a mesma proteína, a
FBXW7α
AS formas aparecem para controlar a expressão de proteínas através da regulação da eficiência de translação destas como formas desde que demonstraram que as variantes FBXW7α 5′-UTR têm uma função moduladora translacional. Multiple como formas só foram encontrados em
FBXW7α
, não em
FBXW7β
ou
FBXW7γ
. No entanto, descobrimos que
FBXW7
α predominantemente expresso em quase todos os tecidos humanos examinados enquanto
FBXW7
β mRNA é enriquecido no cérebro e no timo e é ausente ou na quantidade de traço em outros tecidos, e
FBXW7
γ mRNA é encontrado para ser restringida em coração e músculo esquelético (Figura S3), que destaca a importância potencial de
FBXW7
α para a função de FBXW7. Assim, o múltiplo como formas apresentadas em FBXW7α pode permitir a regulação precisa da sua expressão durante processos biológicos.
para a primeira vez que descobrimos que os níveis de proteína de FBXW7α são regulados por meio de controlo da tradução, demonstrando a eficácia de tradução diferencial de diferentes formas FBXW7α AS. O
in vivo
experimentos usando ensaios de repórter de LUC consistentemente mostrou que a forma Spli2 tem a maior eficiência de tradução em comparação com outros. Vários factores são conhecidos para determinar a eficiência de translação [33]. As diferenças na eficiência de translação entre FBXW7α 5′-UTR variantes é improvável devido ao seu comprimento, a sequência em torno do local de início da tradução, e o número de codões de iniciação dentro deles o mesmo número de codões de iniciação e a mesma sequência em torno do local de início da tradução foram encontrados em todas as variantes FBXW7α 5′-UTR. O comprimento de Spli2-UTR é claramente mais longo do que o Spli6-UTR e Spli7-UTR, mais curto do que Spli3-UTR, mas Spli2 exibiu maior eficiência da tradução. Além disso, foram examinadas diferenças em estruturas secundárias e energia livre de cada
FBXW7α
5′-UTR variantes usando o software online-dobrar RNA (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi- bin /RNAfold.cgi.). Não há diferenças significativas no valor de energia livre após a normalização para o comprimento entre estes 5′-UTR (dados não mostrados). será concedido estudos futuros para investigar os possíveis mecanismos pelos quais 5′-UTRs regulam a eficiência de translação.
FBXW7
emergiu como um importante gene supressor de tumor humano. Vários mecanismos têm sido relatados para a inactivação de FBXW7 no cancro humano, incluindo a mutação, eliminação e hipermetilação [17], [21] – [25], [34]. Um monte de esforços concentraram-se na constatação de mutação FBXW7 em vários tipos de câncer humano e mostraram que a frequência total ponto de mutação é de apenas 6% em cancros humanos [17], mas houve variação significativa entre os tipos de tumores. Aproximadamente 30% de frequência de mutação foi encontrada em colangiocarcinoma e de células T leukamias linfoblástica aguda Considerando que as frequências de mutação na próstata, cancros endometriais, bem como cancro gastrointestinal organizar a partir de 4% a 15% [35]. Consistem com estes resultados, relatamos aqui pela primeira vez que as mutações de FBXW7 detectada em tumores do rim e bexiga humana com a frequência de 16,7% (24/04) e 18.8% (16/03) (Tabela 1), respectivamente. A frequência no tumor da próstata de população chinesa é de 5,6%, semelhante a um estudo anterior realizado em caucasianos [36].
achado mais importante deste estudo é que o
gene FBXW7
é desregulamentado através da expressão diferencial de formas como em cancros humanos. A conexão entre o desenvolvimento do tumor e desregulamentação do AS tornaram-se um aspecto novo e importante da biologia do câncer. Nossos resultados mostram que o padrão de transcrição da
FBXW7
como formas em cancros humanos é diferente do compartimento de tecido normal. Como mostrado na Figura 4, o
FBXW7α
padrões de expressão na maioria dos cancros humanos são comutados de Spli1 2 de Spli3-5 em comparação com o seu tecido normal. A consequência desta opção faz com que a redução da
FBXW7
nível de proteína, e por sua vez leva à perda parcial da sua função. Este resultado sugere que desregulamentado a partir de
gene FBXW7α
pode ser um mecanismo adicional para inativar
FBXW7
em cancros humanos. Desde expressão diferencial de
FBXW7α
como formas foi encontrado em mais de 50% dos cânceres, propusemos que este novo mecanismo desempenha um papel importante no desenvolvimento do câncer humano.
Em conclusão, analisando
FBXW7
5 região end ‘, identificamos o romance
FBXW7α
variantes 5′-UTR que regulam
FBXW7α
expressão do gene através do mecanismo envolvendo eficiência de translação. Estes AS formas são expressas de forma associada ao tecido com níveis variados entre os diferentes tecidos. Nosso estudo fornece uma nova visão sobre a alteração do
expressão FBXW7α
durante o desenvolvimento do câncer humano.
declaração de Ética Materiais e Métodos
O primário de mama humano os tumores foram coletadas no momento da ressecção cirúrgica no Hospital Universitário de Salamanca, Salamanca, Espanha. Coleta e o uso de amostras de pacientes foram aprovadas pelo Conselho de Ética Médica do Hospital Universitário de Salamanca. Os tumores de próstata primário, bexiga e rins humanos foram coletadas no momento da ressecção cirúrgica no Hospital Changhai, China. A recolha e a utilização de amostras de doentes foram aprovados no âmbito do conselho de ética institucional de revisão Changhai Hospital, Segunda Universidade Médica Militar. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes para a pesquisa utilizando estas amostras de tumor.
As amostras dos pacientes
Em ambos os hospitais, as amostras de tecido do tumor frescas foram obtidos no momento da ressecção cirúrgica de tumores de pacientes. As amostras foram imediatamente congelados instantaneamente em azoto líquido para baixo e depois de armazenamento a -80 ° C congelador antes de usar. H E (hematoxilina e eosina) lâminas de tecidos tumorais humanas congeladas foram examinados pelos patologistas deste estudo para assegurar que os tecidos de tumor seleccionados tinham focos cancro de alta densidade. ( 80%)
celular linhas
linhas celulares de cancro da mama foram cultivadas em DMEM ou RMPI1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% e estreptomicina 100 mM e penicilina; detalhes foram descritos em nosso estudo anterior [37]. As células HeLa foram cultivadas em MEM com soro fetal bovino a 10% e estreptomicina e penicilina a 100 mM. As células foram incubadas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO
2.
extracção de RNA total a partir de células e tecidos
Os ARNs totais foram preparados a partir de 80% da cultura confluente de mama linhas celulares de cancro, células HeLa 36 h após a transfecção e da mama humano congelado, rim, próstata e tecidos tumorais de bexiga utilizando Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de RNA extraídos foram tratados com o kit livre de ADN (Ambion), antes de posterior análise, a fim de remover qualquer quantidade residual de ADN genómico. A concentração de RNA e qualidade foram determinadas com um espectrofotômetro Nanovue (GE Healthcare). RNA total humano a partir de diferentes tecidos normais foi adquirido de Ambion.
5 ‘amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE)
A caracterização do
FBXW7
terminal gene N foi realizada usando 5 ‘RACE kit (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o ARN total foi isolado a partir da célula epitelial mamaria humana (HMEC) 184A1 células com Trizol (Invitrogen), e o cDNA foi gerado utilizando o iniciador específico (SPG) listados na Tabela S1. O ADNc foi atada com dCTP utilizando o terminal desoxi-transferase, e um iniciador poli-G (Invitrogen) foi combinada com cada
FBXW7
ADNc para PCR. Um segundo PCR foi realizada com uma diluição da primeira PCR, cada iniciador usando ninho Nestα (Rs1), Nestβ ou Nestγ (Tabela S1), e um iniciador adaptamer fornecida por Invitrogen. Os produtos de PCR foram analisados por electroforese em gel e clonado em pCR4 foram vector. Cada clone foi sequenciado.
A transcrição reversa e a amplificação por PCR de ADNc
O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado utilizando SuperScript III kit de síntese de ADNc (Invitrogen). 1 ug de ARN foi submetido a transcrição reversa seguindo as condições de reacção especificadas pelo fabricante. As reacções foram iniciadas com 50 ng de hexâmeros aleatórios. Os cDNAs de linhas celulares de cancro da mama, painel de tecidos normais humanos e primário de mama, rim, próstata e tumores de bexiga foram analisadas para como transcrições de
FBXW7
α usando PCR com pares de primers F2 /RS1, F2 /R2 e F1 /Rs1 (Tabela S1). O gene GAPDH governanta foi amplificado como controle por o par de primers GapF /GAPr (Tabela S1). O protocolo para a reacção de PCR foi de 26-35 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 s, emparelhamento a 56 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 30 s.
Para detectar mutações FBXW7 na próstata primário, bexiga, rins e tumores, a sequência codificante de
FBXW7
foi amplificado por RT-PCR utilizando os três pares de iniciadores P1F /R, P2F /R e P3F /R (Tabela S1), e o amplificado produtos foram sequenciados e comparados com a base de dados Genebank. Para diferentes produtos feitos sob medida de PCR, as bandas foram excisadas gel e purificado, e, em seguida, verificado por sequenciação de ADN.
plasmídeo constrói
sete diferentes FBXW7α 5′-UTRs (Spli1 a 7) foram amplificados daqueles clones positivos pCR4 em corrida usando o seguinte par de primers GL3F /GL3R (Tabela S1). Os produtos de PCR foram, em seguida, digerido e ligado ao vector pGL3-promotor (Promega) através de sítios de restrição HindIII /NcoI imediatamente adjacente ao gene de luciferase a jusante purificado em gel. As construções gerados foram designados como Spli1-UTR, Spli2-UTR, Spli3-UTR, Spli4-UTR, Spli5-UTR, Spli6-UTR, e Spli7-UTR. Da mesma forma, sete 5′-UTRs amplificados pelo par de iniciadores GL3F /GL3R2 foram introduzidos a montante do gene FBXW7α fundido com HA epitopo em pcDNA3.1 (+) vector (salvo neste laboratório) via HindIII /EcoRI. Todas as construções foram verificadas por sequenciação de ADN.
transfecção transiente
transfecções transientes foram realizados em cerca de 70% confluentes células HeLa, utilizando o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Vinte e quatro horas antes da transfecção, as células foram tripsinizadas e transferidas para qualquer placas de 96 poços (para o ensaio de luciferase) ou placas de 60 mm (para o isolamento de ARN). A transfecção foi realizada com o reagente seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, 0,2 mg de DNA experimental a partir de preparações de plasmídeo em grande escala foi entregue para a cada poço nas placas de 96 poços na presença de phRL-TK
Renilla
plasmídeo de controlo de luciferase (Promega, 0,01 ug) ou quatro ug de ADN experimental e 0,2 ug de
Renilla luciferase
plasmídeo de controlo para as células semeadas em mm prato 60, e as células foram incubadas a 37 ° C.