Abstract

No presente estudo, avaliou-se as mudanças de metilação do DNA globais em linfoblastóide humano (TK6) células

in vitro

em resposta a 5 diretos e 10 agentes genotóxicos de ação indireta. TK6 foram expostos aos agentes seleccionados durante 24 h, na presença e /ou ausência de mistura S9 metabólica. espectrometria de massa de cromatografia de líquidos foi utilizado para perfis quantitativa de 5-metil-2′-desoxicitidina. O efeito da exposição a 5-metil-2′-desoxicitidina entre o controlo e as culturas expostas foi avaliada pela aplicação do modelo marginal com resíduos correlacionada em% de dados global de metilação do DNA. Nós relatamos a indução da hipometilação do DNA global em TK6 em resposta a mistura metabólica S9, de acordo com as configurações experimentais atuais. Benzeno, hidroquinona, estireno, tetracloreto de carbono e tricloroetileno induzida hipometilação do DNA global em TK6. Além disso, mostramos que a dose não têm um efeito sobre a metilação do DNA global em TK6. Em conclusão, relatam mudanças na metilação do DNA mundial como um evento precoce em resposta a agentes tradicionalmente considerados como genotóxico

Citation:. Tabish AM, Poels K, Hoet P, Godderis L (2012) Fatores epigenéticos no risco de câncer: efeito de produtos químicos cancerígenos no padrão global DNA metilação em TK6 Humanos. PLoS ONE 7 (4): e34674. doi: 10.1371 /journal.pone.0034674

editor: Lorenzo Chiariotti, Università di Napoli Federico II, Itália |

Recebido: 29 de novembro de 2011; Aceito: 06 de março de 2012; Publicação: 11 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Tabish et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Katholieke Universiteit Leuven Fund Research. Os financiadores não desempenhou nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancerígenos ambientais são um fator de risco conhecido de câncer humano [1]. No seu modelo clássico, carcinogênese iniciados e prossegue através de alterações no genoma (ou seja, os efeitos genéticos) [2]. Assim, medindo dano induzido por substância cancerígena DNA ou seja, a formação de adutos de DNA e cross-linking, e mutações no DNA têm sido empregadas nas abordagens clássicas de avaliação de risco de câncer, por exemplo, teste de Ames, teste do cometa e ensaio de micronúcleos [3] – [5]. dano ao DNA induzido por substância cancerígena é um importante evento precoce durante a fase de iniciação da carcinogênese, o que reflete uma mudança permanente e irreversível nas células iniciadas [6], [7]. No entanto, a iniciação

per se

num modelo de carcinogénese clássica não é suficiente para o desenvolvimento do tumor, o que resulta de alterações mais amplas na homeostase celular, principalmente por causa da incapacidade das células iniciadas para controlar de forma adequada e regular a expressão do gene [ ,,,0],8].

a exposição a agentes carcinogénicos genotóxicos, em adição aos seus efeitos genéticos, pode envolver uma variedade de efeitos não genotóxicos em células [9]. Os efeitos não genotóxicos em células podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento do cancro [10]. Evidências sugerem que as alterações não genotóxicos em células, por exemplo, alterações no epigenoma celular, pode resultar no surgimento de células reprogramadas epigenetically [11]. Estas células epigeneticamente reprogramadas mostram um perfil semelhante ao epigenética frequentemente observada em células cancerosas, tais como padrões de modificação da histona alterados, a hipometilação de ADN repetitivos e elementos de proto-oncogenes e hipermetilação de genes supressores de tumores. estatuto epigenética alterado confere instabilidade do genoma e perda de sinais de crescimento controlado, tipicamente observado em células de câncer [12]. alterações epigenéticas em vez de mutações genéticas específicas

per se

são relatados para a expansão clonal de focos pré-neoplásica alterações hepáticas e desenvolvimento do tumor [13].

Recentemente, uma série de estudos relataram que os efeitos cancerígenos induzida por 2-acetilaminofluoreno, tamoxifeno, tricloroetileno, a aflatoxina B1, ocratoxina, níquel e cromo não seguem um modelo de carcinogênese clássica, mas sim abranger um espectro de alterações celulares que abrangem os epigenética. [8], [14] – [16]. fatores epigenéticos desempenhar um papel importante na etiologia do câncer; no entanto, há um conhecimento insuficiente na ligação entre fatores epigenéticos para a carcinogênese ambiental no tecido pré-malignas [17]. Com base em mudanças epigenéticas cada vez mais documentadas na etiologia do câncer, o objetivo deste estudo é avaliar se as alterações na metilação do DNA global são um evento celular precoce em resposta a agentes cancerígenos genotóxicos com um modo bem conhecido de ação (adutos de moldagem e agentes de reticulação ). Neste estudo, foram utilizados 5 diretos e 10 indirect- agindo compostos cancerígenos e genotóxicos para expor as células linfoblastóides humanas (TK6) por 24 h. TK6 foram expostos a agentes cancerígenos em 3 níveis de dose (baixa, média e alta) em duplicatas. Mistura S9 metabólica foi adicionado em culturas em metade das experiências porque cancerígenos actuam indirect- requerem a mistura S9 metabólica para se tornar cancerígenos funcionais. Nós usamos células heterozigoto TK6 timidina quinase humanos neste estudo porque expressam p53 de tipo selvagem, crescer rapidamente em suspensão (população época de 12-14 h de duplicação), e são usados ​​rotineiramente em estudos toxicológicos genéticos. Após a exposição, as células foram colhidas, o DNA foi extraído, hidrolisado, e os níveis de metilação do DNA mundial foram quantificados em TK6.

Materiais e Métodos

Cultura celular

TK6 foram comprado de European Collection of Cell Cultures (ECACC, Wiltshire, Reino Unido). As células foram divididas em 15 grupos de tratamento e 2 grupos de controlo (S9- controlo, S9 de controlo +), e cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro de cavalo inactivado pelo calor, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e L 2 mM -glutamina em 5% de CO2 e 37 ° C. As células foram mantidas a uma densidade de 10

6 células /ml e exposta durante 24 h a carcinogéneos. Montamos duas repetições biológicas por dose química, 10 controle S9- repetições, e 5 S9 control + replica.

Devido à exigência de biotransformação enzimática de pró-carcinogéneos para se tornar cancerígenos ativos, uma mistura de S9 (1% v /v) a partir de fígado humano foi adicionado à cultura em metade dos experimentos [18], [19]. Fígado S9 fracções foram obtidos a partir de Celsis (Neuss, Alemanha), e continha enzimas metabolizadoras de drogas, incluindo o P450 monooxigenases citocromos, flavina, e glucoronil transferases UDP. Um sistema de regeneração de NADPH exógeno (1,3 mM de NADP +, a glucose-6-fosfato 3,3 mM, 0,4 U /ml de desidrogenase de glucose-6-fosfato, e cloreto de magnésio 3,3 mM; BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica) requerido pelo S9 de fígado de fase I oxidação foi incluída nas experiências. As células foram expostas a carcinógenos em duplicata, com ou sem a mistura S9 metabólica.

Chemicals, a viabilidade Ensaios e Dose Seleção

Nós selecionamos produtos químicos com características genotóxicos bem descritos [20]. Uma lista dos agentes seleccionados, a sua dose de classificação e de exposição é dada na Tabela S1. Todos os produtos químicos foram adquiridos a Sigma Aldrich, e dissolveu-se e diluiu-se em sulfóxido de dimetilo (DMSO). os ensaios de viabilidade foram usadas para seleccionar doses por agente. Utilizou-se 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazólio ensaio brometo (MTT) a viabilidade [21], e também contadas as proporções da vida e as células mortas utilizando uma célula Contador condessa ™ (Automated Invitrogen, Carlsbad, CA). Com base nos ensaios de viabilidade, foram selecionados três doses por química, isto é, uma dose com a viabilidade celular de 95% (dose elevada), 1/10 de dose elevada (dose média) e 1/100 da dose elevada (dose baixa).

extração de DNA, concentração e a pureza

Depois de 24 horas de tratamento, as células foram imediatamente processadas para extração de DNA. O DNA foi extraído usando o reagente Trizol® com o System® PureLinkTM Micro-para-Midi de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). quantidade e qualidade do DNA foi medida por espectrofotometria e NanoDrop Agilent 2100 Bioanalyzer.

Hidrólise enzimática de DNA

DNA extraído foi hidrolisado para desoxirribonucle�idos individuais em um procedimento de um passo simplificado [22]. Em resumo, o ADN digerir mistura foi preparada por adição de 250 L de Benzonase (Sigma Aldrich), 300 mU fosfodiesterase I (Sigma Aldrich), e 200 U de fosfatase alcalina (Sigma Aldrich) a 5 ml de tampão Tris-HCl (pH 7,9, 20 mM) contendo NaCl 100 mM e MgCl 20 mM

2. 1 ug do ADN extraído de amostras de controlo e expostas foi hidrolisado em 100 ul de reacção por adição de 50 ul de digerir mistura, e as amostras foram incubadas a 37 ° C durante 6 h. amostras hidrolisadas foram trazidos para 1 ml por adição de HPLC-grade H

2O.

Padrões de Calibração

Os padrões de calibração para 5’methyl- desoxicitidina ((5ME) dC) e desoxicitidina (dC ) foram adquiridos a Sigma, e dissolveu-se em LC-MS (água de grau de soluções de reserva). Uma série de calibração foi preparada para 5 (Me) DC e DC, em uma gama de 0,1-10 ppb e 10-100 ppb respectivamente a partir das soluções de reserva. Os mesmos padrões de calibração foram utilizados em todas as experiências.

A LC-ESI-MS /MS Análise Instrumental

metilação global do DNA foi obtida pela quantificação (5ME) dc e DC utilizando pressão ultra- cromatografia líquida (UPLC) para a separação fracção e espectrometria de massa em tandem (MS-MS) para a quantificação. As análises foram realizadas no Waters UPLC ACQUITY equipado com amostrador automático e espectrômetro de massa Micromass MS Technologies Quattro Premier. Uma amostra de 10 ul foi introduzido numa Acquity UPLC BEH C

18, 50 mm x 2,1 milímetros, 1,7? M, mantida a 40 ° C. A fase móvel utilizada para a separação cromatográfica foi uma mistura de ácido fórmico a 0,1% em água (A) e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo (B), utilizando o seguinte gradiente: 0 min: 90% de A e 10% de B, 2-2,5 min: 100% de B, 3,9-4,0 min: 90% de a e 10% B a uma taxa de fluxo de 0,35 ml /min. Todos os componentes de fase móvel foram de grau LC-MS e foram adquiridos a partir Biosolve (Valkenswaard, Países Baixos).

Primeiro, realizamos espectro completo de varredura sob ionização electrospray (ESI) condições. No espectro de varredura completa, adutos de sódio 5 (Me) DC /DC [M + Na] + e 5 (Me) dímeros DC-DC também foram observados, que é um fenômeno comum em uma varredura completa ESI-MS [23]. As análises foram realizadas no modo de ESI + e uma monitorização de reacção múltipla método (MRM) foi utilizado com árgon como gás de colisão a uma pressão de 2,88 10

-3 mbar. Transições monitorados foram m /z 242,00 → 125,85 para (tensão de cone 14 V, energia de colisão de 10 eV) 5 (Me) dC e m /z 228,10 → 112,00 para a DC (tensão de cone 14 V, energia de colisão de 17 eV). O tempo de permanência por transição foi de 100 ms.

Curva de Calibração

Foi observada resposta linear de padrões sobre uma gama de concentrações (0,1-10 ppb e 10-100 ppb) para 5 (Me) dC e dC com coeficientes de correlação de 0,9991 e 0,9970, respectivamente.

Estatísticas

A porcentagem de metilação global do DNA foi calculado por dose química e é expressa como (5ME) dC /[(5ME) dC + dC]%. Foi utilizado o modelo marginal para explorar fatores contabilizados de variação observada na metilação do DNA mundial em TK6, ou seja, produtos químicos, a dose e S9. Resíduos foram desenhados para verificar os pressupostos de normalidade no modelo marginal. O teste de Shapiro-Wilk para resíduos foi demonstrado ser não-significativa, o que implica que uma resposta aproximação a uma distribuição normal era adequada. O 9.2 pacote estatístico SAS foi usada para ajustar o modelo marginal. Os diagramas de caixa foram gerados para produtos químicos com um efeito significativo sobre a metilação do DNA global em TK6 usando SPSS v.18.

Resultados

metilação do DNA global no controle e culturas expostas por dose química sem e com mistura S9 metabólica é dada na Tabela 1 e 2, respectivamente. Os nossos resultados mostram a indução de hipometilação de DNA global em resposta a mistura S9 metabólica, como mostrado na Figura 1.

metilação global do DNA é expressa como uma percentagem de 5-metilcitosina em relação ao número total de citosinas presentes no genoma. A trama caixa descreve a mediana (linha em toda a caixa), amplitude inter-quartil e valores máximos e mínimos (filamentos). Outliers são mostrados como círculos abertos fora das extremidades dos bigodes.

Variação de metilação do DNA mundial de controle e culturas expostas demonstrou distribuição normal (Figura S1). Assumindo que a metilação do DNA global a ser distribuído normalmente, e considerando cada exposição a substâncias químicas para ser independente, mas replicação em exposição a ser correlacionados, um modelo marginal, que capta essa dependência, foi aplicado. Covariância entre os resíduos do modelo, o que corresponde a correlação uniforme dentro de amostras repetidas, foi estimada como sendo 0,54. Ignorando a correlação dentro de exposições replicados poderia resultar em um na estimativa precisa do significado da metilação do DNA global. Em nossos resultados, observou-se produtos químicos e de contabilidade S9 para a variabilidade observada na metilação do DNA global em TK6 (Tabela S2). Dose foi encontrado para ser não-significativa, mesmo na ausência de S9 no modelo marginal. O modelo foi recolocado excluindo a dose e os resultados são apresentados na Tabela 3.

Além disso, mostramos que o benzeno e o seu metabolito hidroquinona, e estireno, tetracloreto de carbono e tricloroetileno afectou significativamente a metilação do DNA global em TK6 (Tabela 3). perfis de metilação global do DNA observadas com exposição a estes produtos químicos em TK6, sem e com a S9 são mostrados na Figura 2 e 3, respectivamente.

metilação global do DNA é expressa como percentagem da 5-metilcitosina em relação ao número total de citosinas presentes no genoma. A trama caixa descreve a mediana (linha em toda a caixa), amplitude inter-quartil e valores máximos e mínimos (filamentos). Outliers são mostrados como círculos abertos no exterior das extremidades de bigodes.

metilação global do DNA é expressa como percentagem da 5-metilcitosina em relação ao número total de citosinas presentes no genoma. A trama caixa descreve a mediana (linha em toda a caixa), amplitude inter-quartil e valores máximos e mínimos (filamentos). Outliers são mostrados como círculos abertos fora das extremidades dos bigodes.

Discussão

A teoria clássica da carcinogênese é impulsionado por mutações genéticas e anomalias cromossômicas conferem instabilidade do genoma [24], [25 ]. No entanto, o estudo destaca a importância de metilação do DNA global como um fator epigenético início em resposta à exposição genotóxica.

Indirect- agentes cancerígenos que actuam necessita de activação metabólica para se tornar cancerígenos reativos. Devido à activação metabólico necessário, uma mistura de extracto de fígado S9 (1% v /v) foi adicionado a metade das culturas. mistura S9 contém enzimas necessárias para a fase-I ativação metabólica de xenobióticos. A expressão de enzimas metabólicas está ligada com as vias de estresse oxidativo reactivos [26]. O stress oxidativo afecta a metilação do DNA através da alteração da S-adenosilmetionina (SAM) e S-adenosil (HAS) rácio [27] – [29]. Neste estudo, a adição de mistura S9 metabólica em culturas de células TK6 resultou em hipometilação global do DNA (β = -0,9082,

P

0,0001) (Tabela 3, Figura 1). S9 induzida por hipometilação de DNA global em destas culturas podem ser mecanicamente ligados à indução de vias de stress oxidativo. O estresse oxidativo ativa vias de sinalização celular e nucleares, que têm acetiltransferase intrínseca histonas (HAT) e as actividades de histona deacetilase (HADC). Por sua vez, estas proteínas estão ligadas a ADN metiltransferases (DNMTs) nas vias nucleares que conduzem às alterações conformacionais na estrutura da cromatina e histonas, e, portanto, eles alteram o nível de transcrição celular [30], [31].

Um certo número de produtos químicos utilizados no presente estudo afectada alterações globais de metilação do DNA em células TK6 (Tabela 3, Figura 2 e 3). Observamos padrões de metilação do DNA globais interessantes. Benzeno (β = -1,5289,

p Art 0,0295) e metabolito hidroquinona (β = -1,8029,

p Art 0,0108) a exposição induzida hipometilação do DNA global em TK6, enquanto estireno exposição (β = -1,7332,

p Art 0,0115) induzida hipometilação do DNA global, mas a sua exposição óxido de metabólito de estireno não afetou a metilação do DNA global em TK6 (β = -0,2999,

p

0,6547). benzeno exposição mostrou estar associado a níveis reduzidos de metilação de ADN elementos repetitivos [32]. Benzeno e exposição hidroquinona ativa as vias de estresse oxidativo em células que afeta o padrão de metilação do DNA celular [33]. exposição estireno induz a formação de DNA aduto e estresse oxidativo em células [34]. Além desses efeitos, relatamos a indução da hipometilação do DNA global de estireno como um potencial mecanismo não genotóxico, o que poderia explicar a sua toxicidade. Nós também expôs TK6 de tetracloreto de carbono e tricloroetileno. Estes produtos químicos actuam principalmente através da formação de intermediários reactivos após a activação metabólica. No presente estudo, observou-se hipometilação do DNA global induzido por tetracloreto de carbono (β = -1,3879,

p Art 0,0475) e tricloroetileno (β = -1,5302,

p Art 0,0294) exposição em TK6 (Tabela 3, Figura 2 e 3). Estudos anteriores também relataram resultados semelhantes sobre tetracloreto de carbono e tricloroetileno (TCE) induzida hipometilação do DNA global. tetracloreto de carbono induzida hipometilação global do DNA foi resgatado pela suplementação com S-adenosilmetionina (SAM) no fígado de rato [35], [36]. Estas observações sugeriram que o tetracloreto de carbono induzida hipometilação de DNA envolvidos metionina vias metabólicas. Além disso, esses produtos químicos induzir estresse oxidativo, o que poderia afetar a methylome celular.

Em contraste com outros estudos, não observamos mudanças de metilação do DNA globais em TK6 pela exposição a hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP). A exposição crónica de benzo [a] pireno para fibroblastos de rato embrionárias

in vitro

induzida hipermetilação DNA mundial [37]. Além disso, as diferenças em níveis de metilação de ADN têm sido relatadas em linfócitos do sangue periférico dos trabalhadores expostos cronicamente a HAP em comparação com os seus controlos correspondentes [38]. Diferentes configurações experimentais utilizadas nestes estudos, em comparação com o presente estudo poderia explicar a heterogeneidade observada em mudanças de metilação do DNA induzidos PAHs. Além disso, não foram observadas alterações de metilação do DNA globais em TK6 para a mitomicina C, formalina, ciclofosfamida, dibrometo de etilo, epicloridrina e acrilamida. mudanças de metilação do DNA globais em resposta a esses produtos químicos não foram relatados em outros lugares. efeitos epigenéticos sutis, tais como modificações de histonas e metilação do DNA específica do gene, em resposta a esses produtos químicos não podia ser ignorado e será mais explorada.

hipometilação do DNA global em TK6 induzidas pela direta e indirect- agindo compostos cancerígenos e genotóxicos investigada neste estudo poderia implicar que as células estão sob condições pré-neoplásicas. Se sustentada hipometilação do DNA mundial persistir, isso poderia conduzir essas células para o fenótipo neoplásico. No entanto, a duração ea extensão da exposição necessário para hipometilação do DNA mundial sustentada para conferir o fenótipo neoplásico precisa ser totalmente compreendido.

Conclusão

Em conclusão, relatamos o efeito não genotóxica, ou seja, alteração na metilação do DNA global, em resposta a um número de substâncias cancerígenas, que são tradicionalmente considerados para actuar através de mecanismos genotóxicos. Descrevemos também que S9 mix metabólica altera o padrão de metilação do DNA global em TK6. O trabalho futuro irá abordar os efeitos dose-dependentes de S9 mix metabólica

in vitro

e as vias envolvidas em mudanças de metilação do DNA induzido por substância cancerígena. Nossos resultados sugerem a utilização de diferentes linhas celulares e ensaios mais variadas para validar as conclusões acima referidas, bem como explorar as ligações mecanicistas.

Informações de Apoio

Figura S1.

Histograma e densidade diagrama de resíduos para avaliar a normalidade. Normalidade assunção de resposta (metilação do DNA global) foi avaliada através da representação gráfica dos resíduos (eixo-x). O enredo parece indicar que esta hipótese é plausível. teste de Shapiro-Wilk, também foi realizada para confirmar a normalidade e resíduos mostraram-se não significativa

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034674.s001

(TIF)

Tabela S1.

Resumo dos agentes, a sua classificação e doses administradas utilizados no tratamento de TK6.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034674.s002

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Tabela S2.

Resultados do modelo marginal descrevendo o efeito da exposição, ou seja, produtos químicos, dose e S9, na metilação do DNA global em TK6 células

in vitro

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doi: 10.1371 /journal.pone.0034674.s003

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Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer a Peter Collaerts e Karine Vranckx por sua ajuda na exposição a substâncias químicas para culturas de células TK6

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