Sumário

gene supressor do tumor de Wilms (WT1) foi identificado como um oncogene em muitas doenças malignas, tais como a leucemia, cancro da mama, mesotelioma e cancro do pulmão. No entanto, o papel de WT1 em cancro do pulmão de células não pequenas, (NSCLC) carcinogénese permanece obscura. Neste estudo, comparou-se os níveis de ARNm de WT1 em tecidos com NSCLC expressão significativamente mais elevada emparelhado tecidos adjacentes correspondentes e identificadas em amostras de NSCLC. A proliferação celular de três linhagens de células NSCLC positivamente correlacionada com a expressão de WT1; Além disso, estas associações foram identificadas nas duas linhas celulares e um rato modelo de xenotransplante. Além disso, demonstrou-se que a sobre-regulação da ciclina D1 e a proteína do retinoblastoma fosforilado (p-PRB) foi mecanicamente relacionado com WT1 acelerando as células para a fase S. Em conclusão, os nossos resultados demonstraram que WT1 é um oncogene e promove a proliferação de células NSCLC por up-regulação da ciclina D1 e p-PRB expressão

Citation:. Xu C, Wu C, Xia Y, Z Zhong, Liu X , Xu J, et al. (2013) WT1 promove a proliferação celular em Non-Small Cell Lung Cancer Cell Lines através Up-Regulação de ciclina D1 e p-PRB in vitro e in vivo. PLoS ONE 8 (8): e68837. doi: 10.1371 /journal.pone.0068837

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 28 Dezembro, 2012; Aceito: 04 de junho de 2013; Publicação: 01 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Science Foundation Natural da China [81170158] (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser um importante problema de saúde pública, tanto em homens e mulheres, é atualmente o tipo de câncer com maior mortalidade no mundo. A incidência tem aumentado rapidamente devido ao grande consumo de tabaco [1] – [3], e na China, tem havido um aumento de 26,9% nos homens e 38,4% em mulheres durante os últimos cinco anos [4]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) inclui vários subgrupos histológicos, adenocarcinoma de células escamosas e carcinoma de células grandes, que compreendem 80-85% do total de incidência, enquanto os restantes casos incluem o grupo mais distinta do cancro do pulmão de células pequenas ( SCLC) [2], [5] – [7]. Neste estudo, vamos nos concentrar sobre o papel do WT1 no desenvolvimento e na carcinogênese do NSCLC.

gene do tumor de Wilms (WT1) que está localizado na 11p13q, codifica uma proteína kDa 52-54, que contém quatro zinco dedo factores de transcrição e foi identificado pela primeira vez como um gene supressor do tumor em nefroblastoma ou tumor de Wilms, cancro renal pediátrica [8], [9]. A sobre-expressão desse gene também foi descoberto em diversas leucemias e tumores sólidos, tal como o cancro da mama, cancro do pulmão e mesotelioma, e foi colocada a hipótese de que este gene tem um papel oncogénica [10], [11]. Oji Y et ai sugeriram que WT1 desempenha um papel importante no crescimento de células normais de pulmão; a sobre-expressão de WT1 perturbar o crescimento e diferenciação de células de pulmão normal e, de acordo com os seus resultados, para levar o cancro do pulmão [11]. WT1 foi demonstrado desempenhar um papel na regulação da proliferação celular e da apoptose em muitos mecanismos biológicos e patológicos. Recentemente, tem sido investigado como um alvo potencial para a imunoterapia de vários tipos de cancro, incluindo NSCLC e mesotelioma [12].

Sinal transdutores e activadores de transcrição 3 (STAT3) têm sido relatados para ser sobre-expresso em muitos humana doenças malignas e activados por citoquinas e factores de crescimento diferentes durante o desenvolvimento e progressão [13], [14] do cancro. Foi demonstrado que a STAT3 promove a proliferação de células de cancro por meio de sobre-regulação de genes que codificam inibidores de apoptose, tais como reguladores de Mcl-1 e Bcl-xL e do ciclo celular, incluindo as ciclinas D1 /D2 e ​​c-Myc [13] – [17 ]. Curiosamente Rong et al demonstraram evidência de que WT1enhanced a actividade de transcrição de STAT3 fosforilado (p-STAT3) levando a sinérgico sobre-regulação de genes a jusante, incluindo a ciclina D1 e Bcl-xL, em fibroblastos de murganho, melanoma e células hepáticas, bem como de rim embrionário humano células [18]. No entanto, WT1 não tenha sido previamente relatada em linhas celulares de cancro do pulmão.

Neste estudo, buscou-se identificar a expressão da proteína WT1 em amostras de NSCLC em comparação com os tecidos adjacentes, investigar a proliferação promoção de função do WT1 in vitro e in vivo e identificar sua relação com a activação da transcrição p-STAT3.

Materiais e Métodos

Os pacientes

NSCLC e tecidos adjacentes incluídos neste estudo correspondente foram obtidos a partir de 85 consecutivo pacientes que tiveram a doença de novo e ressecção cirúrgica sofrido. Eles foram incluídos entre dezembro de 2010 e abril de 2011, o Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing (Nanjing, China). O diagnóstico correto foi avaliada por um patologista experiente e estadiamento do CPNPC por um oncologista clínico de acordo com a Associação Internacional para o Estudo do Câncer de Pulmão (IASLC) 7ª TNM-classificação. tecido adjacente foi localizado a 3 cm da borda do tecido de tumor.

RT-PCR

O RNA foi obtido a partir de tecidos congelados instantaneamente e linhas celulares de NSCLC utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA , método EUA) seguindo o protocolo do fabricante. As concentrações de RNA e qualidades foram examinados pela Beckman Coulter DU800 espectrofotômetro (Beckman, Brea, CA, EUA). ADNc foram sintetizados com um kit de reagente Primescript ™ RT (Takara, Japão). 12 uL de ARN total misturado com 8 ul de tampão e 20 Primescript água tratada com DEPC ul foi incubada a 37 ° C durante 15 min, 85 ° C durante 5 s e armazenado a 4 ° C até à sua utilização.

qRT -PCR

ABI Prism7500 Sistema Sequence Detector (ABI, EUA) foi utilizado para determinar o nível relativo de ARNm em tecidos de tumor e os tecidos adjacentes. A análise quantitativa PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para WT1 e β-actina foi realizada com SYBR® Premix ExTaq ™ (Takara, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. A PCR foi realizada utilizando 10 ul de 2 x tampão de pré-mistura, 0,5 ul de cada ‘e 3’ do iniciador 5, e amostras de 1 ul ou água destilada para um volume final de 20 ul. Cada frasco foi desnaturada a 95 ° C durante 1 min. desnaturado a 95 ° C durante 15 seg, recozidas a 60 ° C durante 15 seg e estendido a 72 ° C durante 30 seg usando os seguintes iniciadores: iniciador de sentido directo, de WT1 5’GCTATTCGCAATCAGGGTTACAG3 ‘; WT1 iniciador inverso, 5’TGGGATCCTCATGCTTGAATG3 ‘. β-actina iniciador directo, 5’CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT3 ‘; p-actina escorva inversa: 5’ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA3 ‘; no final da fase de extensão, foi realizada a detecção de fluorescência. Para discriminar específico a partir de produtos não específicos de cDNA, uma curva de fusão foi obtida no final de cada ensaio.

Cultura celular

A549, H1299, H1650 e linhas celulares 293T (ATCC) foram utilizadas para o presente estudo. A549, H1299 e H1650 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal de bovino 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), enquanto 293T foram cultivadas em meio de glicose elevada DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%. Todas as células foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO

2.

Lentivírus Produção e transdução

WT1A (-17aa-KTS isoforma) do gene foi sintetizado (adquirido a partir de Genscript, Piscataway, NJ) com a digestão restritiva usando Mlu I e subclonado plasmídeo PLV-GFP (oferta de D. Beicheng Sun, Universidade Universidade de Nanjing Medical, China), e nomeado PLV-GFP-WT1. Para gerar o plasmídeo que expressa WT1-shRNA, os oligonucleótidos de cadeia dupla foram clonados no vector pLL3.7 (oferta de D. Chen Yun, Universidade de Medicina da Universidade de Nanjing, China), e chamado pLL3.7-WT1-shRNA. As sequências de WT1-shRNA utilizados são aac TCAGGGTTACAGCACGGTC ttcaagaga GACCGTGCTGTAACCCTGA tttttt c. As letras maiúsculas representam sequência específica WT1 e letras minúsculas representam sequências hairpin. lentivírus recombinante foi gerado a partir de células 293T usando a precipitação com fosfato de cálcio. A549, H1299, H1650 foram transfectadas com lentivírus com polibreno (8 ug /ml). representativos de imagens de tipo selvagem e as células transfectadas são apresentadas na Figura S1.

Western-blotting Ensaio

As proteínas foram extraídas a partir de células cultivadas e tecidos ratos, quantificada utilizando um ensaio de proteína (método BCA, Beyotime, China). As proteínas foram fraccionadas por SDS-PAGE, transferidos para membrana de PVDF, bloqueados em leite em pó a 4% à temperatura ambiente durante 1 hora e imunocoradas com anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite utilizando anticorpos anti-WT1 (1:1000, 6F-H2, Millipore, EUA), anti-STAT3 /p-STAT3 (1:2000, Cell Signaling Tecnologia, Beverly, MA, EUA), anti-ciclina D1 (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, EUA), anti-P -pRb (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA), anti-caspase3 (1:3000, Abcam, Cambridge, MA, EUA), anti-Bcl-2L (1:1000, Abcam, Cambridge, MA , EUA) e anti-GAPDH (1:1000, Kangchen, China). Os resultados foram visualizados por meio de um sistema de detecção quimioluminescente (sistema ECL Pierce Substrato de detecção de mancha de Western, Thermo, Pittsburgh, PA, EUA) e exposta em Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).

Contagem celular Kit-8 (CCK-8) Ensaio

As células foram semeadas em placas de 96 poços (6,0 × 10

3 células /cavidade). A viabilidade celular foi avaliada por CCK-8 ensaio (Beyotime Instituto de Biotecnologia, China). A absorvância de cada poço foi lida num espectrofotómetro (Thermo, Pittsburgh, PA, EUA) a 450 nm (A450). Três experimentos independentes foram realizadas em quintuplicado.

Citometria de Fluxo Análise

análise de citometria de fluxo foi levado para detectar o estado de apoptose e ciclo celular. As células foram colhidas, lavadas duas vezes e ressuspensas em 100 ul de PBS contendo 3 mL de anexina V e 3 mL de PI (KeyGen, China) de acordo com a recomendação do fabricante. A aquisição e análise de dados foram realizados a apoptose por citometria de fluxo instalação (BD Biosciences, San Jose, CA).

análise de ciclo celular foi avaliado por conteúdo de DNA detectado utilizando citometria de fluxo instalação (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Depois de recolhidas por tripsinização, as células foram suspensas com etanol a 70% e mantidas a 4 ° C durante 30 min. Filtrada através da malha, e foi analisado o conteúdo de ADN dos núcleos corados. Todos os experimentos foram realizados três vezes para garantir a resultados facticidade.

tumorigenicidade em ratinhos nus

Para investigar os efeitos de WT1 no crescimento do tumor in vivo, foi estabelecido o modelo de xenotransplante em 4-semana- old Balb /c

nu /nu. Nós empregamos 90 Balb /c

nu /nu (comprado de centro de pesquisa de modelo animal da Universidade de Nanjing, na China) neste estudo e as dividiram em 5 grupos aleatoriamente (n = 6 por grupo) para cada linha celular (A549 /H1299 /H1650). Todas as células foram ressuspensas e tripsinized com 100 ul de PBS (contendo 50 uL de Matrigel), respectivamente, e injectados subcutaneamente na axila de cada ratinho nu (5 × 10

6 células por ratinho). Uma semana após a injecção, dimensões Os tumores foram medidos a cada 4 dias e depois de um mês, todos os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram obtidos (Figura S2). O volume foi calculado utilizando a fórmula seguinte: volume = comprimento x largura

2 × 0,5

A imuno-histoquímica

Os tecidos foram fixados em paraformaldeído a 4% e cortados a partir de blocos de parafina de 5 um de espessura.. Depois de desparafinagem com xileno e re-hidratação com uma série graduada de etanol, os slides foram aquecidos em autoclave durante três minutos, utilizando tampão de citrato (pH 6,0) e incubadas com o anticorpo primário de WT1 (1:100, 6F-H2, Millipore, EUA), p-STAT3 (1:400, Cell Signaling Tecnologia, Beverly, MA, EUA), ciclina D1 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, EUA) e p-pRB (1:100, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA) a 4 ° C durante a noite. Tampão de bloqueio de soro ou de uma diluição de anticorpo foram preparadas como controlos negativos. Os anticorpos primários utilizados foram todos os mesmos que para a análise de Western blot. As fotografias foram tiradas por microcope (Nikon, ECLIPSE 50i) e v4.0 software NIS-Elements. Valores médios de densidade óptica integrada (IOD) foram obtidos a partir de cinco campos aleatórios por lâmina usando o software mais a imagem-Pro (v5.0). Todos os dados foi detectado três vezes, pelo menos.

Análise Estatística

Os dados foram apresentados como média ± SD baseado em três experimentos separados. O teste t de Student, análise de variância e teste exato de dois lados Fisher foi usado para avaliar a significância estatística das diferenças em todas as experiências pertinentes. Um valor de P 0,05 foi considerado como significância estatística, e P 0,001 foi considerado altamente significativo. Todas as análises estatísticas foram analisados ​​utilizando o programa SPSS v17.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA).

Resultados

1. Níveis de mRNA WT1 foram sobre-expressos em NSCLC amostras

Nós investigamos 85 pares de NSCLC e amostras adjacentes correspondente usando imunohistoquímica e PCR em tempo real. As características clínicas dos pacientes são mostradas na Tabela S1. expressão WT1 em tumores foi significativamente maior em comparação com os tecidos adjacentes. imagens representativos são mostrados na Figura 1A. A análise estatística dos valores IOD de 85 lâminas coradas com WT1 é mostrado no histograma na Figura 1B (* p 0,05). Tal como ilustrado na Figura 1C, o nível de ARNm de WT1 foi significativamente sobre-expresso em amostras de NSCLC (** p 0,001). Além disso, os nossos resultados indicaram que o nível de ARNm de WT1 foi associado tanto com o tumor em relação normal e com a fase do tumor, ver Tabela S1 (** p 0,001). Tomados em conjunto, estes resultados estão em concordância com os achados anteriores que indicam que a maior expressão de WT1 está associada com NSCLC.

A, coloração imuno-histoquímica de WT1 no tumor (esquerda) e espécimes adjacentes (direita). B, o valor médio de densidade óptica integrada (IOD) foi avaliada através da análise de cinco campos por lâmina e gravado no histograma. C, em tempo real A análise de PCR de nível de ARNm de WT1 em tumores e tecidos adjacentes em relação a p-actina. Os dados são representados como média ± DP.

* P 0,05,

** P . 0.001

2. WT1 Expressão promovido a viabilidade das linhas celulares de NSCLC in vitro

Para encontrar um WT1-shRNA que poderia efectivamente regular negativamente a expressão de WT1 em linhas celulares de NSCLC, três candidato WT1-shRNA (Tabela S2) foram sintetizados e testadas usando análise de Western-blot e PCR em tempo real. Descobrimos que WT1-shRNA3repressed a expressão de WT1 em A549 /H1299 /H1650 com a eficiência máxima (Figura 2A). Em seguida, foi detectada a expressão de WT1 em todas as linhas celulares para confirmar o lentivírus por análise de Western-blot e PCR em tempo real. Descobrimos que a expressão de WT1 em A549 /H1299 /H1650 transduzidas com pLL3.7-WT1-shRNA foi muito menor em comparação dos controlos; simultaneamente, a expressão de WT1 em A549 /H1299 /H1650 transduzidas com VLP-GFP-WT1 era muito mais elevado em comparação com os controlos. Nós também descobrimos que os dois vectores (pLL3.7-WT1 e VLP-GFP) não teve efeito sobre a expressão de WT1 (Figura 2A e Figura S3). Em seguida, foi realizada de CCK-8 de ensaio para testar a viabilidade; os resultados indicaram que a sobre-expressão de WT1 viabilidade celular aumentada, enquanto que a sub-regulação de WT1 exibiu o efeito oposto e a discrepância foi cada vez mais evidente ao longo do tempo (Figura 2B). Portanto, estes resultados indicaram que WT1 promovido a viabilidade das células NSCLC in vitro.

A expressão WT1 de células do tipo selvagem NSCLC e células NSCLC transfectadas por lentivírus contendo pLL3.7 (GFP1), PLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) e PLV-GFP-WT1 (WT1) por western-blot. B, A viabilidade das células NSCLC foi avaliada por CCK-8 de ensaio: a sobre-expressão de WT1 promove a viabilidade celular enquanto que a inibição da expressão de WT1 reduz o efeito. Os dados são representados como média ± DP.

* P 0,05,

** P . 0.001

3. WT1 Expressão de entrada na fase S acelerada do ciclo celular por cima de regulação da ciclina D1 e p-pRb Proteína

Para investigar o mecanismo pelo qual WT1 promoveu a proliferação de células NSCLC, estudamos os efeitos da expressão de WT1 sobre o ciclo celular por meio de análise de citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a percentagem de fase-S em grupo a sobre-expressão de WT1 foi superior em comparação com o controlo, ao passo que o grupo knockdown WT1 era inferior (Figura 3A 3B). Este resultado sugeriu que WT1 potencialmente promoveu a proliferação de células NSCLC, acelerando a entrada na fase S do ciclo celular.

A, análise do ciclo celular de células do tipo selvagem e NSCLC transduzidas com WT1-shRNA ou WT1. células do tipo selvagem foram utilizados como controle. B, Análise /G1 fase S-fase foi calculado e registrado nos histogramas. C, a análise celular apoptose de células do tipo selvagem e aqueles NSCLC transduzidas com WT1-shRNA ou WT1. células do tipo selvagem foram utilizados como controle. D, análise de Western-blotting da expressão de WT1, STAT3, p-STAT3 (Y705 S727 e), ciclina D1, p-pRb, caspase3, Bcl-2L em células NSCLC indicados. GAPDH foi usada como um controlo de carga. Os dados são representados como média ± DP.

* P 0,05,

** P . 0.001

A fim de elucidar o mecanismo, detectamos a expressão de ciclina D1 e p-PRB porque esta actividade é necessária para G1 do ciclo celular /transição S por Western-blot. Tal como ilustrado na Figura 3D, ciclina D1 e proteína p-pRb foram ambos aumentada em células que sobre-expressam WT1 e reduzida em células de WT1 regulada para baixo. Com base em WT1, aumentada a actividade de transcrição de p-STAT3, e outros achados por Rong et ai, foi detectada a actividade da STAT3 e p-STAT3 (S727 e Y705) e descobriu que a fosforilação de ambos S727 e Y705 foi sobre-expressa em todas as linhas celulares . No entanto, até à data, não existem relatórios que examinaram se WT1 está associada com a fosforilação de STAT3. Além disso, também detectada apoptose e não encontrou qualquer efeito de WT1 (Figura 3C 3D). Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que WT1 acelera a entrada na fase S do ciclo celular por up-regulação da ciclina D1 e expressão da proteína p-pRb.

4. WT1 Expressão promoveu o crescimento de tumor de xenoenxertos in vivo

Para determinar se WT1 afetados progressão NSCLC in vivo, foi estabelecido um modelo de tumor xenoenxerto utilizando Balb /c

nu /nu. Os ratos foram injectados por via subcutânea com estavelmente PLV-GFP-WT1 e pLL3.7-WT1-shRNA A549 infectado /H1299 /H1650 células em um único site, respectivamente, com o plasmídeo vazio e do tipo selvagem WT1 como controles. Como ilustrado na figura 4A, verificou-se que não houve diferenças significativas entre células do tipo selvagem e as células transduzidas com PLV-GFP e pLL3.7-GFP; isto indicava que a curva de crescimento do tumor nas células transduzidas com VLP-GFP-WT1 foi marcadamente aumentada em comparação com o controlo, enquanto a curva de crescimento do tumor em células transduzidas com pLL3.7-WT1-shRNA foi significativamente inibida. tecidos tumorais obtidas de camundongos nus foram apresentados em luz brilhante (Figura 4B esquerda) e in vivo de fluorescência sistema de imagem (Figura 4B direita). Aumentos significativos no volume do tumor foram encontrados quando as células foram transduzidas com VLP-GFP-WT1 em comparação com as células do tipo selvagem; Em contraste, o volume do tumor de células transduzidas com pLL3.7-WT1-shRNA foi significativamente diminuída. Além disso, foi detectada a expressão de proteína WT1 em tumores obtidos a partir de ratinhos nu por análise de Western-blot. Descobrimos que não houve qualquer alteração em relação às células in vitro (Figura 2A à direita e a Figura 4C). Estes resultados sugerem que WT1 promove o crescimento de tumor in vivo implante subcutâneo.

A, o volume do tumor de ratinhos Balb /c

ratinhos nu /nu nu 31 dias após a injecção de células NSCLC. B, tecidos tumorais obtidas de camundongos nus apresentados à luz brilhante (esquerda) e no sistema de imagem de fluorescência vivo. C, expressão WT1 em tecidos tumorais de ratinhos nus por análise de Western-blot. Os dados são representados como média ± DP.

* P 0,05,

** P . 0.001

5. WT1 Afetados a expressão da ciclina D1 e p-PRB in vivo

In vivo, nós ainda validado nossos resultados in vitro em que WT1 acelerados entrada S-fase do ciclo celular por up-regulação da ciclina D1 e p-pRb . Nós investigamos a expressão de STAT3, p-STAT3 (S727), ciclina D1 e p-pRb em tumores obtidas de camundongos nus através de coloração imuno-histoquímica e análise de Western-blot. Tal como mostrado nas Figuras 5A e 5B, a ciclina D1 e p-PRB níveis foram aumentados em tecidos que sobre-expressam WT1 em comparação com WT1 tecidos sub-regulada. Enquanto isso, P-STAT3 (S727) foi sobre-expresso em ambos os tecidos. A análise estatística dos valores IOD de tecidos de tumor é mostrada no histograma (Figura 5A, p 0,05). Conclusivamente, estes resultados indicam que WT1 promove o crescimento de tumor in vivo e também depende de a sobre-regulação da expressão de ciclina D1 e p-pRb.

A, coloração imuno-histoquímica de WT1, p-STAT3 (S727) , ciclina D1 e p-pRb em WT1 superexpresso (WT1) tecidos tumorais e WT1 regulada tecidos tumorais (WT1-shRNA) in vivo. O valor médio da densidade óptica integrada (IOD) foi obtido como descrito acima, demonstrou que a expressão de ciclina D1 e p-pRb foi significativamente regulada para cima. B, análise de Western-blotting da expressão de WT1, STAT3, p-STAT3 (Y705 S727 e), ciclina D1, p-pRb em tumores indicados. GAPDH foi usada como um controlo de carga. Os dados são representados como média ± DP.

* P . 0,05

6. WT1 Expressão Afetados a expressão da ciclina D1 e p-pRb em NSCLC amostras

Nós ainda avaliada a correlação entre a expressão WT1 eo nível de ciclina D1 e p-PRB com 85 embebidos em parafina lâminas de tecido NSCLC humanas. Dois casos com diferentes níveis de expressão de WT1 são mostrados na Figura 6: Caso 1 (positivo forte) e Hipótese2 (fraco positivo). O nível de ciclina D1 e p-pRb foi regulado para cima em comparação com Hipótese1 Hipótese2. Como esperado, p-STAT3 (S727) foi fortemente com detalhes em ambos Case1 e Case2. Este resultado apoia a hipótese de que WT1 pode aumentar a expressão de ciclina D1 e p-PRB e regulam o ciclo celular.

coloração imuno-histoquímica de WT1, p-STAT3 (S727), ciclina D1 e p-pRb em WT1 superexpressão (processo 1) tecidos tumorais e WT1 baixa expressão (processo 2) tecidos tumorais in vivo. O valor médio da densidade óptica integrada (IOD) foi obtido como descrito acima, demonstrou que a expressão de ciclina D1 e p-pRb foi significativamente regulada para cima. Os dados são representados como média ± DP.

* P . 0,05

Discussão

Ao longo das últimas décadas, embora alguns estudos têm investigado o papel de WT1 em NSCLC, a sua função ainda não foi completamente elucidado. Neste estudo, verificou-se que a expressão do gene WT1 e proteína em amostras de NSCLC foi acentuadamente regulada para cima em comparação com os tecidos adjacentes; WT1 promoveu a proliferação de células NSCLC in vitro e in vivo, e a expressão de WT1 afectou o nível de ciclina D1 e p-pRb que acelerou a proliferação celular em células NSCLC e espécimes clínicos. Com todas as conclusões tomadas em conjunto, a hipótese de que WT1 potencialmente desempenha um papel oncogênico na promoção da carcinogênese e progressão das NSCLC.

WT1 foi originalmente identificado como um gene supressor de tumor no tumor de Wilms, e posteriormente foi encontrado para ser sobre-expresso em uma variedade de tumores sólidos [19]. No entanto, a relação entre expressão e carcinogênese de WT1 em NSCLC permanece controverso. Oji et al. sugerido que WT1 possa perturbar o crescimento e diferenciação de células normais de pulmão e contribuem para a oncogénese do cancro do pulmão [11]. Mais recentemente, Hayashi S et al relataram que a expressão do gene WT1 baixo em tumores NSCLC foi um sinal prognóstico negativo e também foi associado com metástase ganglionar [20]. Além disso, foi demonstrado que a perda de WT1 induzida senescência e diminuição da proliferação de células de cancro de pulmão a jusante de sinalização KRAS oncogénicos [21] .STAT3 é constitutivamente activada em muitos tumores humanos, tais como próstata, pulmão, cérebro, da mama e cancro pancreático [13], [15], [22], [23]. Os genes a jusante, incluindo ciclina D1, c-myc, e Bcl-xL de STAT3, são potencialmente sobre-regulada por STAT3 fosforilado. A ciclina D1 é um regulador do ciclo celular que promove a partir de células G1-fase para a fase S, e fosforila a proteína pRb [24], que é uma fosfoproteína nuclear que regula o crescimento celular em G1-fase. Hipofosforilado pRb em E2F S780 seguida, liberta de um complexo de inibidor, que permite a promover a transcrição necessários para a progressão em G1 de fase tardia e fase S [24] – [26]. Tem sido relatado que o 4 (CDK4) pRb fosforilada de ciclina D1 e ciclina-dependente cinase-pRb e que perdeu a sua capacidade de se ligar ao E2F [27]. Assim, quando Ciclina D1 é sobre-regulada por STAT3 pode fosforilar pRb e promover o crescimento celular através da libertação de E2F.

Rong et ai relatou que a função de WT1 como supressor de tumores ou oncogenes foi principalmente dependente das actividades da STAT3. Por conseguinte, quando a STAT3 foi activado, WT1 funcionava como um supressor de tumor, mas quando STAT3 foi desactivado, WT1 funcionava como uma oncoproteína [18]. Eles também proposto que WT1 e STAT3 sinergeticamente promovido a proliferação de células em cerca de regulação de genes, tais como ciclina D1 e Bcl-xL. Com base nestes resultados, a hipótese de que WT1 poderia funcionar como um oncogene em NSCLC.

Neste estudo, demonstramos que WT1 foi overexpressed em tecidos NSCLC em comparação com os tecidos adjacentes. WT1 exibiu um efeito sobre a proliferação de células NSCLC in vitro e in vivo: a sobre-expressão de WT1 promoveu o crescimento das células enquanto que a sub-regulação inibiu a proliferação de células NSCLC. Nós também detectou expressão de STAT3 em amostras e células NSCLC, em linha com Fernandes et al que encontrou STAT3 sobre-expressos em tecidos de câncer de pulmão [23]. Os nossos resultados mostraram que WT1 acelerada a entrada na célula da fase S; Assim, avaliou-se os genes reguladores do ciclo celular tais como ciclina D1 e p-PRB e verificou-se que a expressão da ciclina D1 e p-pRb foi efectivamente regulado para cima como mostrado na Figura 3D. Tomando em consideração os nossos resultados e os resultados anteriores de Rong et ai, verificou-se que WT1 e STAT3 sinergicamente promover o crescimento de células NSCLC por cima-regulação dos reguladores do ciclo celular da ciclina D1 e p-pRb. Além disso, verificou-se que a expressão WT1 foi associada tanto com metástases em linfonodos e estágio do tumor. Este resultado indica que a expressão de WT1 pode ser relevante para a invasão tumoral e metástases. Epitelial para mesenquimal (EMT) é considerado um processo essencial para a metástase de carcinoma e disseminação de células de cancro a partir do tumor primário e migração para diferentes locais do corpo [28]. Curiosamente, WT1 pode potencialmente conduzir EMT através de alvos relacionados-EMT, como caracol, Lesma e E-caderina [29] – [31]. Isso vai exigir mais pesquisas para determinar a função de WT1 na invasão tumoral e metástase.

De forma inesperada, não encontramos que WT1 teve qualquer efeito sobre a apoptose de células NSCLC de acordo com a citometria de fluxo de ensaio e também pela Western ensaio -blot; isto é diferente de descobertas de Y Rong et al WT1 que demonstraram aumento da expressão de Bcl-xL [18]. Também foi relatado que WT1 é necessária para uma inibição de apoptose no cancro da mama e cancro rabdóide diminuindo Bcl-2 de ARNm e os níveis de proteína [32], [33]; No entanto, outros relatos indicaram que WT1 regulada negativamente o promotor de Bcl-2 na linha de células de próstata [34]. Vincent S et al. relataram que não detectou qualquer diferença na resposta ao esgotamento WT1 em linhas celulares de NSCLC [21], que foi de acordo com os nossos achados. A razão para estas diferenças permanece desconhecida, mas maior elucidação, porque de WT1 e STAT3 promover sinergicamente o nível de ciclina D1, mas não têm efeito sobre o nível de Bcl-2L em NSCLC, é garantido. Os co-fatores WT1 transcrição recentemente identificados, como BASP1 (proteína solúvel em ácido cérebro 1) e WTIP (proteína interagindo WT1) pode participar dessas diferenças na regulação da transcrição mediada por WT1 de genes alvo, tais como Bcl-2L [35] – [37].

em conclusão, neste estudo, encontramos um nível de expressão WT1 significativamente maior em amostras de NSCLC em comparação com tecidos não-cancerosas adjacentes, demonstramos a proliferação promover a função de WT1 in vitro e in vivo e identificamos sua função oncogénica em NSCLC através da amplificação da actividade de transcrição de p-STAT3-se que regula os genes a jusante, incluindo ciclina D1 e a proteína do retinoblastoma fosforilada hipo-(p-pRB). Assim, WT1 potencialmente servir como um alvo terapêutico para o tratamento de NSCLC.

Informações de Apoio

Figura S1.

A imagem de células e outros do tipo selvagem NSCLC transfectadas com lentivírus na luz brilhante (superior) e na luz verde (inferior). células do tipo selvagem NSCLC referidos como controle; As células transduzidas com pLL3.7 e VLP-GFP referidas como GFP1 e GFP2; As células transduzidas com pLL3.7-WT1-shRNA referido como WT1-shRNA e transduzidas com PLV-GFP-WT1 referido como WT1 na figura

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s001

(TIF)

Figura S2.

tumores obtidos a partir dos ratinhos nus. Os tumores obtidos a partir dos ratinhos nu são todos apresentados nesta figura. Deve notar-se que apenas detectado em 4 tumores H1299-WT1-shRNA grupo e 5 em tumores H1650-WT1-shRNA grupo no local injectado

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s002

( TIF)

Figura S3. expressão

WT1 mRNA de células NSCLC. expressão de WT1 de células do tipo selvagem NSCLC e NSCLC células transfectadas por lentivírus contendo pLL3.7 (GFP1), PLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) e PLV-GFP-WT1 (WT1) por PCR em tempo real. Os dados são representados como média ± DP. * P 0,05

doi: 10.1371 /journal.pone.0068837.s003

(TIF)

Tabela S1..

Relação de expressão WT1 e as características clinicopatológicas de NSCLC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s004

(DOC)

Tabela S2.

A sequência de WT1-shRNA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s005

(DOC)

Reconhecimentos

Os autores agradecem a todos os indivíduos que voluntariamente participaram do estudo e D. Beicheng Sun e D. Yun Chen (University of Medical University Nanjing, Nanjing, China) para os seus plasmídeos.