Abstract

Fundo

Honokiol, um pequeno peso molecular naturais produto, tem sido demonstrado que possuem propriedades anti-neoplásicos e anti-angiogénicos potentes. Os seus mecanismos moleculares e a capacidade de anti-cancro gástrico permanecem desconhecidos. Tem sido demonstrado que a função anti-apoptótica de proteínas reguladas-glucose (GRP) prevê que a sua indução em células neoplásicas pode levar à progressão do cancro e resistência aos medicamentos. Nós exploramos os efeitos da honokiol sobre a regulação dos GRPs e apoptose em células de cancro gástrico humano e crescimento do tumor.

Metodologia e principais conclusões

O tratamento de várias células cancerosas gástricas humanas com honokiol levou à indução da clivagem GRP94, mas não afetou GRP78. Silenciamento de GRP94 pela pequena interferência RNA (siRNA) poderia induzir a apoptose celular. O tratamento das células com agentes quimioterapêuticos ou honokiol agente etoposido reforçada o aumento da apoptose e GRP94 degradação. A actividade de calpaína e proteína de calpaina II (m- calpaina) (mas não-eu calpaína) μ-calpaína () nível também pode ser aumentada por honokiol. induzida por Honokiol GRP94 para baixo-regulação e apoptose em células de câncer gástrico poderia ser revertida por siRNA segmentação inibidores de calpaina calpaína-II e. Além disso, os resultados da coloração por imunofluorescência e imunoprecipitação revelou uma interacção específica de GRP94 com calpaina-II nas células após o tratamento honokiol. Nós próxima observado que o tumor GRP94 sobre-expressão e crescimento de tumores em camundongos BALB /c nu, que foram inoculados com células de câncer gástrico humanos MKN45, são marcadamente diminuiu tratamento honokiol.

Conclusões e significado

Estes resultados fornecem a primeira evidência de que a clivagem GRP94 calpaina II-mediada induzida por honokiol provoca a apoptose de células de cancro gástrico humano. Sugerimos ainda que honokiol pode ser um possível agente terapêutico para melhorar o resultado clínico de câncer gástrico

Citation:. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol Induz Mediada por Calpain Glucose-Regulado Protein-94 Cleavage e células de câncer gástrico apoptose em humanos e reduz o crescimento do tumor. PLoS ONE 2 (10): e1096. doi: 10.1371 /journal.pone.0001096

Editor do Academic: Hany El-Shemy, Universidade do Cairo, Egipto

Recebido: 26 de junho de 2007; Aceito: 10 de outubro de 2007; Publicação: 31 de outubro de 2007

Direitos de autor: © 2007 Sheu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan (NSC95-2320-B040-005). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é a segunda causa mais comum de morte por câncer no mundo [1]. Quase dois terços dos casos ocorrem em países em desenvolvimento e 42% só na China [1], [2]. Os alvos moleculares e mecanismos subjacentes mau prognóstico não está bem compreendida. O tratamento do câncer gástrico localmente avançado continua a ser um grande desafio. Apesar dos recentes avanços no tratamento, o resultado clínico em pacientes com câncer gástrico continua pobre. Para além da cirurgia, o papel da terapia adjuvante ainda não foi provado [2], [3]. Assim, a necessidade para identificar agentes terapêuticos potenciais novos e quimioprotector é óbvia.

Honokiol, um componente activo isolado e purificado a partir do

Magnolia officinalis

, tem sido demonstrado que possuem os efeitos de anti-oxidação [4], contra a peroxidação lipídica [5] e anti-inflamatório

in vitro

e

in vivo

[6], [7]. Honokiol também foi mostrado como sendo um inibidor disponível sistemicamente e não tóxica da angiogénese [8]. Os estudos recentes relataram que a apoptose dependente honokiol induz caspase em células de leucemia linfocítica crónica de células B e supera a resistência aos medicamentos convencional no mieloma múltiplo humano por indução de caspase-dependente e independente de apoptose [9], [10]. Embora uma avaliação completa do potencial clínico dos compostos ainda não é possível, a farmacocinética do honokiol foi exaustivamente investigado, revelando que honokiol está disponível mediante terapia de câncer clínico. Mais produtos naturais que contêm uma variedade de compostos terapêuticos úteis na prevenção do desenvolvimento de doenças malignas continuam a ser descobertos; no entanto, muito pouco se sabe sobre seus mecanismos subjacentes de ação ou o seu alvo molecular.

proteína Glucose-regulada (GRP) 94 é uma glicoproteína mais abundante no retículo endoplasmático (ER) e apenas ser identificado em vertebrados. A sobre-expressão anti-sentido e de ribozima se aproxima em sistemas de cultura de tecidos directamente demonstrado que GRP78 e GRP94 poderiam proteger as células contra a morte [11] – [13]. A função de protecção do GRP foi também observada na resistência à radiação no cancro do colo do útero [14]. A função anti-apoptótica do GRP também prevê que a sua indução em células neoplásicas pode levar à progressão do cancro e de resistência às drogas [15] – [18]. condições patológicas, tais como o crescimento de tumores e malignidade têm sido sugeridos para correlacionar com GRP94 proteína citoprotector sobre-expressão [19]. No modelo de doenças malignas metastáticas, uma eficácia significativa da estratégia /imunoterapia baseada em gene GRP94 foi demonstrado quando foi combinada com a terapia de radiação [20]. O ER desempenha um papel directo na activação de um subconjunto de caspase durante a activação da apoptose que ocorre durante o stress ER [21]. Por outro lado, calpa�as são uma família de Ca

2 + dependentes de proteases de cisteína intracelular. Ubiquamente expressa proteases calpaína-I (μ-calpaína) e a calpaina II-(m-calpaína) estão implicados no desenvolvimento da apoptose. Um estudo recente mostrou que calpa�as ubíquos promover a caspase-12 e a activação de JNK durante ER apoptose induzida por stress [22]. Foi também indicado que GRP94 com Ca

2 + liga�o ao e propriedades anti-apoptóticas é um alvo proteolítica de calpaina durante a apoptose induzida por etoposido [23]. Além disso, em vários modelos experimentais de apoptose, tem sido demonstrado que a unidade de inibidor de calpaina amino-terminal de calpastatina pode ser clivada por caspases, sugerindo que a clivagem é essencial para a regulação da actividade de calpaína durante a morte celular [24] – [28] . Caspase-7, que é recrutada para o ER em células estressadas, podem do mesmo modo clivar e activar a caspase-12 [29] – [31]. Os efeitos de honokiol na sinalização e de apoptose relacionado com GRP ainda permanecem desconhecidos. No presente estudo, nós exploramos os mecanismos moleculares de honokiol na apoptose de células de câncer gástrico humano e crescimento do tumor

in vitro

e

in vivo

. Inesperadamente, descobrimos que GRP94 sofre uma clivagem proteolítica específica por calpaina durante a apoptose induzida por honokiol. Estas observações podem dar evidências de que honokiol é um possível agente terapêutico para melhorar o resultado clínico de câncer gástrico.

Resultados

Cinética de GRP94 clivagem proteolítica em linhas celulares de cancro gástrico humano tratados com honokiol

em primeiro lugar, examinou os efeitos de honokiol sobre as expressões de GRP94 e GRP78 em várias linhas celulares de cancro gástrico humano. Honokiol diminui marcadamente os níveis de GRP94 em uma dose e modo dependente do tempo, mas os níveis não são afectados GRP78 (Figs. 1 e 2). Cinética da clivagem induzida por GRP94 honokiol em várias células de cancro gástrico humano foram mostrados na Fig. 2. SCM ou MKN45-1 foram mais resistentes a respostas induzidas por honokiol do que as células AGS ou N87; os níveis de GRP94 foram reduzidas para cerca de 50% para o dobro do tempo. Os níveis de proteínas GRP78 permanecer inalterado em todas as quatro linhas celulares de cancro gástrico. Além disso, há expressão de proteínas GRP94 pequenos em tecido de rato epitélio gástrico normal e células endoteliais humanas em comparação com células de cancro gástrico (Fig. 1C).

(A) análise de transferência de Western para GRP94 e GRP78 em células MKN45 tratados com honokiol durante 8 h de um modo dose-resposta. analisa (B) Western Blot para GRP94 e GRP78 em células MKN45 tratados com honokiol (a, b; 20 �, 40 um) de uma forma tempo-resposta. (C) Comparação da expressão da proteína GRP94 entre linhas celulares de cancro gástrico humano (SCM-1, AGS, N87, e MKN45), tumor isolado a partir de MKN45 ratinhos células inoculadas (t), ratinho normal epitélio gástrico tecido (N), e humanos As células endoteliais da veia umbilical (HUVEC). Todos os resultados apresentados são representativos de, pelo menos, quatro experiências independentes.

análises de Western blot para GRP94 e GRP78 em células (N87 (A), a AGS (B), MKN45 (C) e SCM-1 ( D)) tratados com 40 mM honokiol para vários cursos de tempo, como indicado. Os dados são apresentados como média ± EPM (n = 5).

Honokiol GRP94 induz resposta apoptótica associada à clivagem

Como se mostra na Fig. 3, honokiol aumentou a poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e a clivagem do gene induzível danos no ADN CHOP /GADD153 (uma proteína tem sido identificada para mediar ER apoptose induzida por stress) níveis em células MKN45 em uma dose e tempo-dependente maneira. Honokiol 20 e 40 m também desencadeada as expressões de caspase-12 clivado e caspase-7 (p20), que a magnitude do aumento foi proporcional ao tempo (Fig. 3B). Além disso, para compreender se a clivagem GRP94 estava envolvida na apoptose de células de cancro gástrico humano, a apoptose foi detectada em células GRP94 siRNA-transfectadas. O silenciamento de ARNsi GRP94 por apoptose celular induzida (Fig. 4A) e diminui a expressão da proteína GRP94 (Fig. 4B-a). Nós também comparou os efeitos de honokiol em apoptose e degradação GRP94 em células cancerosas gástricas humanas com agentes quimioterápicos etoposídeo. Os resultados mostraram que o tratamento de células com honokiol ou etoposido reforçada o aumento da apoptose (Fig. 4A) e GRP94 degradação (Fig. 4B-b). Quando as células foram tratadas simultaneamente com 40 M etoposídeo e 20 M honokiol, um aumento maior na degradação GRP94 do que eles fizeram foi mostrado (Fig 4B-b.); Estes resultados implicam que a combinação de honokiol com outros fármacos anticancerígenos podem ser uma estratégia terapêutica potencial.

(A) para análises de Western blot de PARP e GADD153 em células MKN45 tratada com honokiol durante 8 h de uma maneira dose-resposta . (B) Tempo respostas curso para PARP, GADD153, caspase-7 e caspase-12 em células MKN45 tratados com honokiol (20 mM). Os resultados apresentados são representativos de, pelo menos, quatro experiências independentes.

(A), a apoptose em células MKN45 GRP94 siRNA-transfectadas foram analisados ​​por coloração com anexina V /PI, como descrito em Materiais e Métodos, que foi comparado com células tratadas com honokiol (40 uM) ou etoposido (40 uM). (B-A) os níveis de proteína GRP94 foram detectadas por análise Western blot no controle e GRP94 siRNA-transfectadas células MKN45. (B-b) e etoposido Honokiol induzir clivagem GRP94 em células MKN45. As células foram tratadas com 20 honokiol uM e 40 uM etoposido (Etopo.), Tal como indicado durante 4 h. Os resultados apresentados são representativos de, pelo menos, quatro experiências independentes.

A calpaína é necessário para mediada por apoptose celular honokiol

próxima determinar se a actividade da calpaína (tiol-proteases dependentes de cálcio) seria induzida por honokiol em quatro linhas celulares de cancro gástrico. Como mostrado na Fig. 5A, honokiol 20 H aumento da actividade de calpaína de uma maneira dependente do tempo, que começaram a aumentar aos 15 minutos, e atingiu um pico aos 60 min e, em seguida, desceu para um nível inferior a 4 h. As células permaneceram aderentes ao longo do tempo, sem perda de viabilidade (dados não mostrados). Na Fig. 5B, os resultados mostraram que o aumento da actividade de calpaína, em resposta a honokiol (20 e 40 M) durante 60 min, em quatro linhas celulares de cancro gástrico. Além disso, os inibidores de calpaína, N-acetil-Leu-Leu- norleucina (ALLN), N-acetil-Leu-Leu methioninal (ALLM), e Z-Leu-Leu-CHO, inibiu eficazmente o aumento da actividade de calpaína induzida por honokiol em N87 e células MCP-1 (Fig. 5C).

actividade calpaina foi medida com o substrato fluorescente de calpaína Suc-LLVY-AMC em N87, AGS, e MKN45 células MCP-1. (A) Tempo respostas curso para honokiol (20 mM) de tratamento. Os dados são expressos em termos de dobra de condições de controlo. (B) Honokiol (20 e 40 mM) aumenta a actividade da calpaína a 60 min de tratamento. (C) A calpaína inibidores ALLN, ALLM, e Z-Leu-Leu-CHO; 25 e 50 uM) inibiu significativamente a actividade de calpaína aumentou-honokiol. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 4).

Nós ainda testou se a diminuição da atividade calpaína pode comprometer a capacidade de honokiol na indução de apoptose. Como mostrado na Fig. 6A, honokiol (40 H) a apoptose celular induzida em SCM-1 de células, o que pode ser invertida por inibidores de calpaína (ALLN ou ALLM). calpaína-I expressões Além disso, honokiol melhoradas de proteína de calpaina-II, mas não em células de proteína MCP-1 (Fig. 7a). Utilizando uma abordagem de siRNA para knockdown actividade de calpaína II-levou a uma redução significativa de honokiol (20 H) induzida por apoptose em células de cancro gástrico humano após 4 horas de tratamento (Fig. 6B). SiRNA calpaína-I não afectar a apoptose induzida por honokiol (Fig. 6B).

células de cancro gástrico humano foram analisadas quanto à apoptose por coloração de anexina V /PI, como descrito em Materiais e Métodos. (A) As células de SCM-1 foram tratados com honokiol (HK, 40? M) durante 4 horas na presença ou ausência de inibidores de calpaina (ALLN e ALLM, 50 uM). (B) células transfectadas com ARNsi AGS-calpaína-I ou siRNA-calpaína-II foram tratados com honokiol (HK, 20? M) durante 4 h. Os resultados apresentados são representativos de pelo menos quatro experiências independentes.

Localização e interação de calpaína-II e GRP94 após o tratamento honokiol

O passo seguinte foi para elucidar o papel da calpaína-II GRP94 em degradação induzida por honokiol. No estudo microscópico confocal a laser, a localização da proteína de calpaina-II foi determinada por fluorescência verde, enquanto que a localização de GRP94 foi determinada por fluorescência vermelha. Como mostrado na Fig. 7B, tanto a calpaína II e GRP94 foram detectadas no citoplasma, com a co-localização em células de cancro gástrico humano. A fluorescência da calpaína-II foi gradualmente aumentada, mas a fluorescência de GRP94 foi gradualmente reduzida em células de cancro gástrico humano sob tratamento honokiol. Para confirmar ainda mais os resultados de coloração imunocitoquímico que a calpaína-II interage com GRP94, foram realizados os ensaios de co-imunoprecipitação e transferência de Western em células de cancro gástrico. Como mostrado na Fig. 7C, a calpaína-II foi especificamente relacionado com GRP94 em várias células de cancro gástrico na presença de honokiol (20 e 40 M), em comparação com o controlo de IgG. Além disso, testou-se as actividades proteolíticas da caspase, proteassoma ou a catepsina estavam envolvidos na clivagem de GRP94. Os nossos resultados mostraram que o tratamento de células com inibidores da caspase (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK e Z-DEVD-FMK, 50 M) a dose elevada bloqueou parcialmente a clivagem de GRP94 durante a apoptose induzida por honokiol (Fig. 8A ), em comparação com o inibidor de calpaína ALLM 25 M, o que poderia bloquear completamente a clivagem GRP94. O pré-tratamento de células com o inibidor da catepsina B CA-074-Me 25 e 50 M e inibidor de catepsina L inibidor da catepsina G e II 25 50 M e inibidor de proteassoma MG132 0,1-10 H foi capaz de bloquear a clivagem GRP94 (Fig. 8B e 8C) . Além disso, a clivagem específica de GRP94 por calpaina pode ser observado usando os lisados ​​de células preparados a partir de células de cancro gástrico humano (dados não mostrados).

As células foram tratadas com honokiol (20-60 uM) para vários intervalos de tempo, tal como indicado . os níveis de (A) A calpaína-I e II de proteína foram detectadas por análise Western Blot em células SCM-1 tratadas com honokiol. (B) Os anticorpos primários para a calpaína II e GRP94 foram aplicados a células MKN45 (e SCM-1) seguido de anticorpos secundários acoplados com conjugado com FITC ou TRITC-conjugado, respectivamente. A co-localização dos dois antigénios marcado foi detectada como uma única imagem quando as imagens de ambos os canais foram sobrepostas. (C) Interacção de calpaína e GRP94 foram detectados em N87, AGS, e MKN45 células MCP-1. As proteínas imunoprecipitadas foram recolhidas e submetidas a SDS-PAGE e imunotransferência com anticorpos anti-anti-calpaina GRP94-II ou. Os resultados apresentados são representativos de, pelo menos, quatro experiências independentes.

As células foram ou não tratados ou pré-tratados com inibidores durante 1 h seguido de 40 uM honokiol tratamento durante mais 24 h. (A) inibidor de caspase (Z-VAD-FMK, 25 e 50 uM) ou inibidor da calpaína (ALLN, 25 uM); (B) inibidor da catepsina B (CA-074-Me, 25 e 50? M) ou a catepsina G inibidor (inibidor de catepsina G II, 25 e 50 uM); (C) inibidor de proteassoma (MG132, 0,1-10? M) ou inibidor da calpaína (ALLN, 25 uM). Os resultados apresentados são representativos de, pelo menos, quatro experiências independentes.

A seguir investigou se a activação de calpaina é necessária para a apoptose celular induzida por honokiol. Na Fig. 9, os aumentos da expressão de calpaína II e degradação de proteínas GRP94 e caspase-7 e caspase-12, a activação induzida por honokiol (40 M) foram prevenidas por inibidores de calpaína farmacológicos e transfecção transiente de siRNA-calpaína-II em células de SCM-1.

tratamento de transferência de Western para determinar a degradação e GRP94 calpaína-I e II, a expressão e a activação de caspase-7, caspase-12 e em células de SCM-1 24 h após honokiol (40 uM) na presença ou ausência de inibidores de calpaina (ALLN e ALLM, 25 e 50 uM) foi detectado. Em algumas experiências, as células MCP-1 foram transfectadas com calpaina II-siRNA de controlo ou ARNsi. Os resultados apresentados são representativos de pelo menos quatro experiências independentes.

Honokiol atenua GRP94 tumor sobre-expressão e crescimento de tumores em ratos nus

Os ratinhos nus foram inoculados com 4 × 10

6 células de adenocarcinoma indiferenciado MKN45 e tratados com honokiol 0,5 e 1,5 mg /kg ou veículo quando do tumor tornou-se evidente. análise imuno blotting e Western demonstrou que a sobre-expressão GRP94 e acumulada na região do tumor, mas não no tecido normal gástrica (10A-A Figs. 10A e-b). Honokiol diminuiu marcadamente a acumulação de GRP94 em tumores, em comparação com o controlo de veículo (Fig. 10A-A e 10A-b). A expressão de GRP78 não foi afectada (dados não mostrados). Para determinar se o honokiol podem suprimir o crescimento tumoral

In vivo

, tumores sólidos foram estabelecidos em ratinhos e o efeito anti-tumoral de repetidamente injectada honokiol foi estudada. Como mostrado na Fig. 10B, a administração de honokiol 0,5 e 1,5 mg /kg mostraram uma significativa actividade anti-tumoral.

tumores em ratinhos nus foram criados durante 14 dias após a injecção de células MKN45 e seguido por tratamento com 0,5 e 1,5 mg /kg honokiol todos os dias durante 10 dias. expressões (A-A) GRP94 em tumores ou tecidos normais gástricas foram determinadas por imuno-histoquímica. As secções foram coradas com anticorpo GRP94, conforme descrito em Materiais e Métodos. As expressões de proteínas GRP94 em citoplasma foram coradas em marrom escuro. (A-b) transferência de Western para a determinação de proteínas GRP94 em tumores com ou sem tratamento honokiol foi detectado. (A-c) A detecção da expressão da proteína GRP94 por transferência de Western em células MKN45 com ou sem tratamento honokiol (40 uM) ou em tecidos normais foi mostrado gástricas. Os resultados apresentados são representativos de, pelo menos, quatro experiências independentes. de volume (B) do tumor foi avaliada. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 7).

Discussão

Nós relatamos aqui pela primeira vez que a calpaína, um Ca nonlysosomal

2 + cisteína -activated protease, especialmente calpaína II, desempenha um papel fundamental na clivagem de GRP94, mas GRP78 não é afectada, e na regulação da apoptose induzida por honokiol em células de cancro gástrico humano. Em particular, fornecemos evidências funcionais que a clivagem de GRP94 após tratamento atos honokiol como um benefício terapêutico, inibição do crescimento tumoral no modelo de ratinho de carcinoma gástrico humano. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório para mostrar que honokiol pode manipular a proteína chaperona degradação GRP94 calpaína-inducible ser o alvo durante a apoptose.

Estudos de vários laboratórios apontou para o ER como um compartimento alvo por agentes terapêuticos implicado na execução da apoptose. Ca citosólico

2+ tem sido implicado como um segundo mensageiro de proapoptosis envolvidos em ambos desencadeando a apoptose e as caspases ou regulam calpainas [32] – [34]. Um estudo recente mostrou que a calpaína é um importante mediador de resveratrol (um polifenol natural da planta) apoptose induzida no cancro da mama [35]. Eles descobriram que o resveratrol pode causar um aumento no Ca intracelular

2+, e activa a apoptose mediada por calpaina, conduzindo à degradação da membrana plasmática Ca

2 + -ATPase isoforma 1 e fodrina em caspase-3 deficiente MCF- 7 células. Honokiol também tem sido relatado para induzir Ca

2+ mobilização em neurónios corticais de rato e células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, presumivelmente através da activação de fosfolipase C e IP

3 receptores [36]. No presente estudo, descobrimos que honokiol é capaz de aumentar a atividade calpaína e expressão da proteína calpaína-II, mas não calpaína-I durante a apoptose de células de câncer gástrico induzida por honokiol. Além disso, os inibidores de calpaína e silenciamento de calpaína-II por siRNA reverteu significativamente a apoptose induzida por honokiol. Estes resultados implicam que Ca

2 + Triggered calpaína-II ativação pode desempenhar um papel potencial na apoptose induzida por honokiol.

GRP94 /gp96 é o membro residente ER da família HSP90. GRP94 desempenha um papel importante na manutenção da homeostase celular. Este conceito convencional de GRP94 como acompanhante enovelamento de proteínas é atualizado pelas descobertas que GRPs promover a proliferação do tumor, metástase, resistência aos medicamentos, e imunoterapia, que têm importantes implicações clínicas no prognóstico e tratamento do câncer [3]. GRP94 foi demonstrada estar associada com tumorigenicidade em linhas celulares de cancro, modelos de tumores de roedores e biópsias de cancro humano [37] – [39]. Isto é consistente com as conclusões de que a indução deste tipo de proteínas faz com que uma função de protecção, como as respostas de sobrevivência à fome de nutrientes, acidose, e condições de hipoxia, que são comuns em tumores sólidos vascularizados mal [11], [40]. Foi também apareceu que a maioria dos GRP em células tumorais está envolvida em complexos multi-chaperonas, embora não seja em células normais [41]. A vacinação de ratinhos com as proteínas de stress derivadas de tumor, GRP94, podem provocar respostas imunes antitumorais, dando origem a uma supressão significativa do crescimento de tumores e metástase. A actividade de inibidores de Hsp90 foi bem validado em modelos de cancro da mama pré-clínicos, tanto em estudos de agente único e em combinação com quimioterapia convencional [41]. Além disso, tem sido sugerido que GRP94 é um substrato fisiológico para a calpaína [23]. A calpaina tem sido demonstrado ser activado na membrana do ER, onde interage com GRP94, resultando na sua clivagem proteolítica específica como as células sofrem apoptose desencadeada por etoposido [23]. No estudo actual, verificou-se que a clivagem induzida por honokiol GRP94 e apoptose em células de cancro gástrico humano pode ser completamente invertida por calpaina inibidores da calpaína e silenciamento-II por siRNA. inibidores de caspase, à dose mais elevada inverteu parcialmente a clivagem induzida por GRP94 honokiol. O pré-tratamento das células com a catepsina B e L e inibidores de inibidor de proteassoma foi incapaz de bloquear a clivagem induzida por honokiol GRP94. Também demonstramos que o silenciamento de GRP94 por siRNA pode induzir a apoptose de células de câncer gástrico. Além disso, os resultados da coloração imunocitoquímica e imunoprecipitação revelou uma interacção específica de GRP94 com calpaina II em células de cancro gástrico após o tratamento honokiol. A clivagem específica de GRP94 pela calpaína também pode ser observada usando lisados ​​celulares preparados a partir de células gástricas cancerosas humanas. Estas descobertas sugerem, assim, que a clivagem GRP94 calpaina II-mediada joga um papel importante na apoptose de células de cancro gástrico desencadeada-honokiol.

calpains e as caspases são duas famílias de proteases de cisteína que estão envolvidas na regulação da célula patológica morte [22], [31]. Estas proteases compartilhar vários substratos relacionados com a morte incluindo caspases si mesmos, proteínas do citoesqueleto, Bax e Bid [42]. proteólise prossegue de uma forma limitada, mas não exige um resíduo de aminoácido específica, como a de caspases mediada por calpaina. Embora tanto a calpaína e caspase têm sido propostos para desempenhar papéis importantes na regulação da morte celular patológica, as interacções entre estas duas famílias de proteases sob condições patológicas não são claras. No presente estudo, knockdown e inibidores farmacológicos abordagens têm contribuído significativamente para o nosso conhecimento da biologia calpaína, particularmente no que diz respeito à sua função específica na apoptose celular, o que é possível que as caspases 7 e 12 a jusante da calpaína na mediação de cancro gástrico induzida por honokiol apoptose celular.

drogas produtos naturais têm sido sugeridos para desempenhar um papel dominante na assistência farmacêutica [43]. Produtos naturais são uma das importantes fontes de potencial quimioterápico do câncer e agentes quimiopreventivos [43]. Honokiol tem sido amplamente utilizada na medicina tradicional chinesa e japoneses por milhares de anos, principalmente, para o tratamento de efeitos anti-trombótica, anti-bacterianas, anti-inflamatórios, e ansiolíticos. Relatórios anteriores demonstraram que honokiol também está possuindo propriedades anti-neoplásicos e anti-angiogénicos potentes [6], [19], [38]. No entanto, o mecanismo molecular preciso da actividade anti-tumor exibido por honokiol não é bem compreendido. Assim, os resultados deste estudo proporcionam evidências para a actividade anti-tumoral de honokiol no cancro gástrico, e mais importante ainda, a base molecular para o seu efeito. Descobrimos que honokiol induz a activação da calpaína, clivagem GRP94, e a apoptose em células de cancro gástrico humano. Além disso, após a administração de honokiol em nude implantados com células do tumor gástricas MKN45 mostrou actividade anti-tumoral significativa. Este estudo pré-clínico pode servir como um quadro e representa um romance promissor abordagem específica. Além disso, os compostos naturais têm sido mostrados para combinar com os agentes citotóxicos convencionais podem ser clínico benéfico com fármacos anti-cancerígenos. Esta vantagem, mais a evidência emergente de seus mecanismos anti-tumorais fazer honokiol aplicação clínica em curso para ser um agente anti-tumoral eficaz e segura.

Materiais e Métodos

Células e Condições de cultura e reagentes

linhas de células humanas, incluindo linhas caucasianos gástricas celulares de cancro (AGS, uma linha de células de adenocarcinoma moderadamente pouco diferenciado e N87, uma linha de células de carcinoma bem diferenciado) e linhas celulares de cancro gástrico Asiático (MKN45 e SCM-1, o células de adenocarcinoma indiferenciadas) foram obtidos a partir de banco de células no centro de câncer de Taipei veteranos hospital geral (Taiwan). As células foram mantidas em meio RPMI 1640 contendo inactivado pelo calor 10% de FCS (Life Technologies) e estreptomicina /penicilina (Life Technologies) numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. Honokiol foi obtido a partir de Wako Chemical Company (Japão), e a sua pureza foi determinada como sendo um mínimo de 99% por cromatografia líquida de alta eficiência.

Western Blot Analysis e imunoprecipitações

lisados ​​de células inteiras foram preparados como descrito previamente [44]. As proteínas foram separadas por electroforese em gel pré-fundido de 8-20% de SDS-poliacrilamida, e, em seguida, transferidas electroforeticamente do gel para membranas de difluoreto de polivinilideno. Após o bloqueio, as manchas foram incubadas com anti-GRP94, anti-GRP78, anti-caspase 12, anti-caspase 7, o anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-calpaína-I (μ-calpaína), anti-calpaina II (m- calpaina) (Santa Cruz Biotechnology), e anti-β actina (Sigma) em PBS anticorpos dentro de 0,1% de Tween 20 durante 1 h, seguido por três lavagens de 10 min em PBS dentro de 0,1% de Tween 20. O membranas foram, então, incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano para 60 min. Em imunoprecipitação, proteínas (500 g) foram incubadas com anticorpos específicos e imobilizado em esferas de proteína A-Sepharose. As esferas foram lavadas extensivamente com tampão de immunoprecipitative Bacco, cozidos, e microcentrifugadas. Entrada 10% do ligado celular para IP e 50 g de proteínas foram analisadas por transferência de Western. A detecção foi realizada com reagente de transferência de Western ECL (Amersham), e quimioluminescência foi exposto pelos filmes Kodak X-Omat.

Calpaína Actividade Ensaios

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC é um substrato de calpaína de proteases. A quantificação de ácido 7-amino-4-metilcumarina (AMC) fluorescência permite o acompanhamento da hidrólise enzimática do conjugado péptido-AMC e pode ser utilizado para medir a actividade da enzima. As células foram preparadas e tratadas em 24 poços, placas Corning /Costar. Antes da adição de células inibidores foram carregados com 40 H Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) e tratou-se com honokiol para o sincronismo indicado a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora. Proteólise da sonda fluorescente foi monitorado usando um sistema de leitura de placas fluorescentes (HTS-7000 Plus Série bioensaio, Perkin Elmer) com configurações de filtro de 360 ​​± 20 nm para excitação e 460 ± 20 nm para a emissão.

siRNA e Ensaios de transfecção

o siARN duplexes específicos para a inibição de calpaina I-(μ-calpaína) e a calpaina II (m- calpaina) expressões em células humanas foram obtidas a partir de Santa Cruz Biotechnology: a calpaína-I, catálogo n ° . sc-29885, uma piscina de específica do destino marco 20-25 nt siRNAs; -calpaína II, catálogo n °. sc-41459, um específico para o alvo de 20-25 nt siRNA. Os ARNsi de controlo (catálogo n °. SC-37007) é um não-direccionamento de 20-25 nt ARNsi concebido como um controlo negativo. Além disso, o siRNA duplexes específicos para a inibição da expressão de GRP94 foi sintetizado comercialmente por MWG Biotech (Alemanha). O sentido (superior) e anti-sentido (inferior) sequências do duplex siARN GRP94 foram como se segue: 5′-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 ‘; 3’-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 ‘. Como controlo não específico, um duplex de siRNA NC com sequências aleatórias foi concebidos como se segue: 5’-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 ‘; 3’-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 ‘. Os ARNsi foram usadas a uma concentração de 100-200 nM para a transfecção transitória de células com lipofectina (Invitrogen) por poço numa placa de 6 poços, com meio fresco. Após 24 h a partir da transfecção inicial e 24-36 h de tratamento, as células ou os lisados ​​celulares foram recolhidos e analisados ​​quanto apoptose ou a expressão da proteína, respectivamente.

imunofluorescência e Laser Scanning Microscopia Confocal

Células eram lavadas duas vezes com PBS, fixadas em paraformaldeído a 4% durante 30 min e, em seguida, bloqueadas por incubação em 1% de albumina de soro bovino em PBS. Os anticorpos primários foram aplicados como indicado para as lâminas a uma diluição de 1:500 e incubadas a 4 ° C durante a noite. As amostras foram tratadas com anticorpos secundários conjugados com FITC ou TRITC-conjugados (Sigma).