Sumário

Background

Os microRNAs (miRNAs) são curtos único não-codificante encalhado RNAs que suprimem a expressão do gene, quer através de repressão translacional ou a degradação de ARNm alvo. Acredita-se que o emparelhamento entre os RNAs mensageiros e região 5 ‘semente de miRNAs a ser essencial para a repressão específica da expressão do gene alvo. Uma miARN pode ter várias centenas de diferentes alvos numa célula. evidências rapidamente acumulando sugere que muitos miRNAs estão envolvidos na regulação do ciclo celular e jogar consequentemente papéis críticos na carcinogênese.

Metodologia /crescimento principais conclusões

Introdução de miR-107 sintéticos ou miR-185 suprimiu de as linhas humanas não-pequenas células do pulmão de células de cancro. Citometria de fluxo revelou estes miRNAs induzir uma parada do ciclo celular G1 na H1299 células ea supressão da progressão do ciclo celular é mais forte do que em Let-7 miRNA. Por expressão do gene análises com micromatrizes de oligonucleótidos, encontramos centenas de genes são afectadas pela transfecção destes miARNs. Usando previsão miRNA-alvo análises e os dados da matriz, listamos um conjunto de alvos prováveis ​​de miR-107 e miR-185 para parada do ciclo celular G1 e validar um subconjunto deles usando em tempo real RT-PCR e immunoblotting para CDK6.

Conclusões /Significado

Foram identificados nova reguladoras do ciclo celular miRNAs, miR-107 e miR-185, localizada em regiões cromossômicas frequentemente alterados em cancros do pulmão humanos. Especialmente para miR-107, um grande número de genes regulados de deslocamento são anotadas com o termo ontologia gene “ciclo celular”. Nossos resultados sugerem que estes miRNAs podem contribuir para regular o ciclo celular em tumores malignos humanos

Citation:. Takahashi Y, Forrest ARR, Maeno E, Hashimoto T, Daub CO, Yasuda J (2009) miR-107 e miR -185 pode induzir a paragem do ciclo celular em Non Human pequenas células do cancro do pulmão linhas celulares. PLoS ONE 4 (8): e6677. doi: 10.1371 /journal.pone.0006677

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de junho de 2009; Aceito: 17 de julho de 2009; Publicado: 18 de Agosto 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Takahashi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Research Grant para RIKEN omics Centro de Ciência de MEXT para Yoshihide Hayashizaki, Grant para o Sistema de pesquisa RIKEN Frontier, programa de pesquisa RNA funcional para YH e Grant-in-Aid para a Investigação Científica para J.Y. ARRF é apoiado por um CJ Martin Fellowship do Australian NHMRC (ID 428261). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

miARNs são 19 a 23 bases de comprimento RNAs de cadeia simples que desempenham papéis críticos em processos biológicos [1]. As sequências de nucleótidos de miARNs são frequentemente evolutivamente conservada entre organismos multicelulares [2]. Os miARNs são expressos como em forma de cadeia dupla em gancho de pré-miARNs e processamento sequencial por diferentes enzimas de ARNase III, Drosha e Dicer, gera madura miARN [3] .A miARN madura liga-se com um conjunto de proteínas, incluindo Agonaute, para formar um miARN induzida silenciamento complexo (miRISC). O miRISC é acreditado para fazer um complexo com RNAs mensageiros-alvo e pós-transcricionalmente suprime a expressão dos genes alvo. O mecanismo de ação da miRISC ainda é controversa [4], no entanto, há um consenso geral de que a maioria dos RNAs mensageiros-alvo têm sítios de ligação para os miRNAs em regiões não traduzidas 3 ‘. Do segundo ao oitavo bases da sequência 5 ‘final da miARN é chamado sequência de semente e acredita-se ser essencial para o reconhecimento dos RNAs mensageiros-alvo por miARNs.

Tornou-se evidente que algumas miARNs desempenham papéis críticos na a regulação do ciclo celular, em cooperação com os oncogenes ou genes supressores de tumores (ver revisão [5], [6]). Um exemplo de ciclo celular regulação miRNA é a

let-7

(para

HSA-deixou-7a

, MIMAT0000062). A introdução de fibras sintéticas pré-let-7 faz com que a paragem do ciclo celular em células de cancro do pulmão [7]. Muitos miARNs são conhecidos para regular negativamente genes relacionados com o ciclo celular. O cluster de miR-17~92 foi identificada como a jusante do

MYC

oncogene [8] e regular negativamente factores de transcrio E2F, que são mediadores bem conhecidos da progressão do ciclo celular [9] .Outra relacionado com o gene de tumor importante,

TP53

, induzir a expressão de miR-34 membros da família e sobre-expressão de miR-34 causou a interrupção do ciclo celular na fase G1 [10] – [16]

Aqui nós relatamos. ciclo celular potencial regulação miRNAs durante a pesquisa dos miRNAs relacionadas ao câncer em células de câncer de pulmão humanos. Neste estudo, revisitar um conjunto de regiões genômicas identificadas por Zhao

et al

. que são amplificados ou suprimidos em cancros do pulmão humanos [17]. Durante o estudo, descobrimos que

miR-107

(MIMAT0000104) e

miR-185

(MIMAT0000455) suprimem a proliferação em linhas de células de adenocarcinoma de pulmão e induzem a paragem do ciclo celular na fase G1 do ciclo de célula. Buscou-se caracterizar RNAs mensageiros-alvo a jusante desses miRNAs pelo uso de perfis de microarray com a ontologia gene análises e previsões TargetScan [18].

Resultados

A expressão de miR-31, 107, e 185 na coleta de tecido humano, incluindo tecido de cancro do pulmão e linhas celulares

a partir das regiões identificadas por Zhao

et al

. [17], encontramos 13 e 26 miRNAs anotados nas regiões homozigoticamente excluídos e amplificados respectivamente (tabela complementar S1). Porque muitos dos genes relacionados com o cancro contribuir para a transformação maligna em amplo espectro de tipos de células, que priorizados miARNs que têm sido implicados em outros cancros humanos adultos de início. Então, nós escolhemos três miRNAs: miR-107, miR-185 e miR-31 (MIMAT0000089) [19] – [22]. Adicionamos a let-7a para o crescimento celular e o controlo do ciclo celular, porque a miARN pode suprimir o crescimento de células nas linhas de células de cancro do pulmão [23] e induzem a paragem do ciclo celular na linha celular HepG2 [7].

Usando a tecnologia de RT-PCR quantitativo de Taq-Man, medimos a expressão dos quatro miARNs no cancro do pulmão humano A549 linhas celulares e H1299 e através de um painel de ARN comercialmente disponível a partir de amostras normais e de cancro do tecido do pulmão (Fig. 1). A maioria dos miARNs mostraram expressão relativamente ubíqua entre tecidos normais (Fig. 1). É interessante que a expressão dos miRNAs analisados ​​(miR-107, 185, e deixe-7a) foram menores nas linhas de tumor de pulmão e de células de câncer de pulmão do que no pulmão normal. O miR-31 foi altamente expressa em linhas celulares de cancro de pulmão.

os níveis de expressão de miARN foram medidos por miARN TaqMan qRT-PCR no pulmão normal, cérebro, pituitária, fígado e tecidos de ovário, uma amostra de tumor de pulmão e também nas linhas de células de tumor de pulmão, H1299 e A549. O eixo vertical indica a expressão relativa de cada miRNA normalizada com a de RNU44.

supressão do crescimento e interrupção do ciclo celular por sobre-expressão de miRNAs candidatos em linhas celulares de cancro de pulmão humano

o efeito destes miARNs sobre a proliferação foi testada pelo ensaio de MTT com células H1299 e A549 pré-miARN transfectadas. A transfecção de HSA-miR-107 e miR-HSA-185 reduziu dramaticamente a proliferação celular em ambas as linhas celulares (Fig. 2). No caso de células H1299, os miARN let-7a mostraram uma redução significativa a proliferação enquanto que os efeitos eram menos óbvia nas células A549. A extensão da supressão do crescimento de A549 através de let-7a é semelhante ao do relatado [7]. O miR-31 mostrou ligeira supressão do crescimento celular, mas os níveis de supressão não foram estatisticamente significantes em muitos pontos de tempo para ambas as células (Fig. 2).

Crescimento efeito de supressão das transfecções candidatos miRNA sobre H1299 (esquerda painel) e A549 (painel da direita) como medido pelo ensaio MTT. O eixo vertical indica a proporção relativa da A450 nm: 0 a do dia de cada célula como 1. Nota miR-107 e miR-185 suprime a proliferação em ambas as linhas celulares

conteúdo de ADN por análise. fluir transfecção citometria revelada de HSA-miR-107 e HSA-miR-185 induziu um aumento significativo na percentagem de células na fase G1 do ciclo celular, para níveis semelhantes como controlo let-7a, enquanto um controlo negativo mexidos não fez (Fig. 3). Não se observou qualquer qualquer aumento aparente da população sub-G1 na citometria de fluxo ou quaisquer alterações morfológicas relacionadas com apoptose, tais como a formação de bolhas e condensação nuclear, sob o microscópio de contraste de fase (dados não apresentados). Isto sugere que a supressão do crescimento induzido por hsa-miR-107 e miR-HSA-185 de transfecção foi causada pela indução da paragem G1, em vez de apoptose.

Os histogramas do conteúdo de DNA obtidos pela análise FACS são mostrados. As percentagens de cada um dos estádios do ciclo celular estão apresentados na inserção dos histogramas. Não havia um portão aplicada aos acontecimentos de modo que não houve acumulação evidente de populações sub-G1 em todos os experimentos.

Identificação de mRNAs alvo candidato dos miRNAs por gene profiling análise

O perfil de microarray foi feito para determinar as alterações globais nos níveis de expressão de mRNA em células H1299 transf ectadas com miARNs crescimento supressivos em comparação com um controlo negativo. No hsa-miR-107, hsa-miR-185 e deixe-7A-HSA transfectadas células foram 561, 646 e 812 transcrições down-regulamentados e 608, 698 e 949 upregulated em 1,5 vezes ou mais, respectivamente. Análise do gene ontologia foi levada a cabo sobre os genes regulados negativamente nos transfectans. A Tabela 1 apresenta os termos GO mais significativamente enriquecidos para os genes regulados por baixo com cada miRNA. Os cinco principais termos em genes regulada por hsa-miR-107 foram todos ciclo celular relacionados (quadro 1). Regulada negativamente genes com a 7a deixou-se principalmente envolvidos no metabolismo do ARNr, biogénese de ribossoma, e a fase M do ciclo celular. Finalmente, os genes regulados para baixo com HSA-miR-185 mostrou nenhum enriquecimento em termos relacionados com o ciclo celular, em vez dos termos relacionados com o desenvolvimento e diferenciação foram proeminentes. Além disso, os 33 127 e os genes normalmente regulada para baixo e regulados positivamente, respectivamente, por ambos os miARNs não apresentaram enriquecimentos ontologia gene, o que sugere que estes miARNs induzir a paragem do ciclo celular, com diferentes vias de sinalização (tabelas 2, 3 e dados não mostrados).

Foram comparadas as previsões alvo de miRNA com o software TargetScan [18] para esses miRNAs para os genes regulados negativamente em nossa expressão profiling conjuntos de dados. Para ambos os sítios conservados e não conservados, encontramos a mudança de dobragem mediana de alvos previsto foi consistentemente mais baixa do que a de todos os genes detectados nas matrizes (fig. 4). Há uma tendência para alvos mais fortemente previstos para ser mais baixo-regulado do que metas previstas fracos. Da mesma forma, as metas conservadas tendem a ser mais previsões regulada para baixo do que todas as metas previstas (Fig. 4).

alvo da análise foram extraídos de miRNAs 185, 107 e let7a. sinal de expressão média é mostrado apenas para genes considerados como detectado pelo software Agilent. Eixo Y indica a mudança de dobragem mediana para conjuntos de genes alvo microRNA previstos a limiares diferentes, em comparação com todos os genes no microarray (mostrada em preto). Em todos os casos, o sinal mediano de alvos preditos é menor do que o observado quando são utilizadas todas as sondas. Quando a experiência é estendido para três dias, observa-se menos de um efeito, sugerindo alvos directos são mais afetados no primeiro dia.

Nós então combinados estes objectivos previstos por computador para os genes down- regulados mais de 0,75 vezes no nível de RNA para diminuir os potenciais alvos destes miRNAs. Encontramos muitos desses alvos potenciais foram anotados com os termos “ciclo celular” nas anotações Entrez Gene (tabela 2), sugerindo que estes três miRNAs pode regular diretamente a progressão do ciclo celular através destes genes. Interessantemente, no nosso lado, a 7-não deixe suprimir a expressão do CDK6 (NM_001145306) ARNm, que é suprimida por sobre-expressão de let-7 no estudo anterior [7]. Tabela 3 indica que conjuntos distintos de oncogenes conhecidos são reprimidos por estes miRNAs.

A partir dessas listas e outra lista que descrevem candidatos alvos miRNA anotados com o ciclo celular termos, o cancro do pulmão, oncogene ou supressor de tumor nas anotações Entrez Gene ( tabela S2 suplementar), escolhemos um subconjunto de transcritos para validação por qRT-PCR pela comparação com as listas de alvos fornecidas pelo TargetScan [18] e PicTar [24] software (Fig. 5A). Para miR-107, que confirmou mRNA down-regulação da

CCNE1

(NM_001238),

CDK6

,

CDCA4

(NM_017955.3),

RAB1B

(NM_030981.2) e

CRKL

(NM_005207.3), e para miR-185, que confirmou a infra-regulação da

CCNE1

,

CDK6

,

AKT1

(NM_001014431.1),

HMGA2

(NM_003483.4) e

CORO2B

(NM_006091.3) (Fig. 5B). Fazemos notar que tanto o miR-107 e miR-185 transfecção causada sub-regulação da ciclina E1 (CCNE1) e ciclina quinase dependente 6 níveis (CDK6) de ARNm, embora o nível de supressão de CDK6 por miR-185 é modesta (Fig. 5B). Em seguida, confirmada pelo western blot que os níveis de proteína CDK6 são também regulada pelo miR-107, enquanto que a expressão CDK6 foi relativamente inalterado por miR-185 (Fig. 5C). Uma vez que o nível de supressão da expressão de mRNA por CDK6 miR-185 é bastante modesta, a queda subsequente da expressão da proteína CDK6 no ponto de tempo de observação (24 horas após a transfecção) pode ser demasiado pequeno para ser observado os immunoblottings convencionais.

A) sequência de nucleótidos Representante jogos entre possíveis genes-alvo e miRNAs. Os números entre parênteses indicam as posições de nucleótidos alvo a partir do codão de paragem. nucleotídeos apenas combinando com sequências de sementes de miRNA são indicadas com as linhas verticais. B) A análise de RT-PCR quantitativo de potenciais alvos de miR-107 (CCNE1, CDK6, CDCA4, RAB1B e CRKL) e miR-185 (CCNE1, CDK6, AKT1, HMGA2, CORO2B) são mostrados. O eixo vertical indica a razão de expressão relativa de cada gene normalizada com a da GAPDH. C) Western Blot demonstrando a regulação negativa da proteína CDK6 por miR-107.

Discussão

Que aconteceu para descobrir que miR-107 e miR-185 pode suprimir a proliferação de células em dois linhas e células de câncer de pulmão induzidos a prisão G1 do ciclo celular. A extensão da supressão do crescimento por estes miARNs é semelhante ao que pelo supressor tumoral miARN, deixou-7. perfil de expressão gênica análise com a transfecção destes miRNAs indicou que apenas miR-107 mostrou o enriquecimento significativo de reguladores do ciclo celular para os efetores a jusante. Por outro lado, o miR-185 não reprimir significativamente regulador do ciclo celular, bem como deixar-7, um ciclo celular conhecido regulação miARN [6]. O miR-185, no entanto, poderia suprimir a expressão do mRNA do ciclo celular que regula genes tais como CDK6 e AKT1.

Os conjuntos de genes comumente regulados por todos os miRNAs supressivos três de crescimento não são tantos e não tão fortemente relacionado com a regulação do ciclo celular (Tabela 2). Estes resultados sugerem que as três vias de sinalização regulam miARNs celulares distintas. Desde miARN tem uma vasta gama de alvos em uma célula (ou seja, menos específico) e dado que a extensão da supressão da expressão de destino por miARN é geralmente moderada, a função de miARNs deve ser considerada como a “sintonia fina” da expressão de genes em mamíferos células [25]. A acumulação destes pequenos efeitos reguladores podem causar as reacções biológicas importantes nas células [5] .Por outro lado, alguns potenciais moléculas-alvo, tais como CCNE1 e CDK6 podem ser críticos para a regulação do ciclo celular por estes miARNs. Por exemplo, a redução de CCNE1 com ARNsi provoca paragem do ciclo celular em linhas celulares de cancro do fígado [26]. No caso de CDK6, redução de CDK6 por siARN causada fase S prolongada em células estaminais embrionárias humanas [27]. Em geral, a importância de miARN na regulação do ciclo celular é bastante razoável porque miARNs é suposto ser moléculas-chave para a indução de diferenciação celular, o qual acompanha com a paragem do ciclo celular, em muitos casos.

Em termos de miR-107 , outras evidências suporta um papel para este miRNA em paragem G1 e supressão do crescimento. miR-107 ações 7 das 8 bases de sua sequência de semente com a família miR-16 de miRNAs, que induzem a paragem em G1, segmentando vários ciclinas e reguladores do ciclo celular, incluindo CDK6 que confirmou como um alvo miR-107 [28]. Além disso, um estudo anterior descobriu que os inibidores sintéticos para miR-107 de aumentar a proliferação de células A549, mas não afectam as células HeLa [29] sugerindo miR-107 pode de facto, desempenhar um papel na redução específica do pulmão proliferação. Curiosamente, o miR-107 mostraram overexpressions em cancros pancreáticos, sugerindo este miARN tem algum papel na carcinogénese positivo pancreático [21]. Por outro lado, durante a preparação deste manuscrito, Lee et al. relataram que a desmetilação e a desacetilação tratamentos para linhas celulares de cancro pancreático humano induziu a sobre-expressão de miR-107 e a sobre-expressão do crescimento celular suprimidos miR-107 e a expressão do CDK6 nas linhas de células de cancro pancreático humano [30]. Este último estudo é compatível com os nossos dados em termos de CDK6 como um alvo a jusante candidato de miR-107. É interessante se este miRNA tinha quaisquer funções celulares específicas nas células, em vez de regulação do ciclo celular. Sanches

et al

. sugeriu que o miR-107 foi induzida nos músculos quadríceps exercidas ratos [31]. De acordo com a revisão por Wilfred et al., O miR-107 e sua par�ogo, miR-103, podem funcionar na regulação do metabolismo celular [32]. Pode ser interessante possibilidade de que estas miARNs regulam as funções celulares fundamentais tais como a progressão do metabolismo ou do ciclo celular em vez da especificação da diferenciação celular.

O mecanismo de paragem do ciclo celular por miR-185 não é clara. O número de reguladores do ciclo celular nos genes suprimidos a jusante é muito menor por miR-185 que por miR-107. Um grupo de cientistas sugeriram que este miRNA é sobre-expresso no cancro da bexiga [20]. No outro papel, Choong relatado que o miR-185 têm forte correlação positiva com o aparecimento de antigénios de superfície de células eritróides (CD71, CD36 e CD235a) em células de sangue de cordão umbilical humano estimuladas com factores de crescimento e diferenciação eritróide induzida [33]. De um modo geral, a indução de diferenciação celular geralmente pares com a supressão da progressão do ciclo celular. Considerando-se as funções de miARN em outros metazoários, muitos dos miARNs indutíveis com a diferenciação celular pode ter algumas funções supressoras do ciclo celular. O miARN deve ter outras funções biológicas em diferentes tipos de células. Por isso, é interessante investigar se miR-185 tem todas as funções de diferenciação em células de câncer de pulmão. Outra questão importante é que o miR-185 mostrou funções de crescimento supressivos (figuras 2, 3) e diminuição da expressão em células de cancro do pulmão (Figura 1), embora a miARN é localizada numa região cromossómica amplificado em linhas celulares de cancro duas pulmonares ([17 ] e quadro suplementar S1). Estes resultados são contra-intuitivo. É possível, no entanto, que os supressores de tumor possa ser localizado numa amplificação cromossómico região exibição em células tumorais. Um exemplo é um potencial gene supressor tumoral,

GSDMA

(NM_178171.4) [34], é localizada numa região cromossómica amplificado em células de cancro gástrico [35]. Este gene é regulada negativamente nos cancros gástricos humanos, embora o gene mostrou amplificação em células tumorais [35]. No caso de o miR-185, epigenética silenciamento de miARN pode ocorrer antes da amplificação do gene da região do cromossoma 22q21.1. Outras investigações claramente precisa abordar estas questões minuciosamente.

Por fim, informamos que novos miRNAs candidatos que pode regular a progressão do ciclo celular em linhagens humanas pulmão de não pequenas células de células de câncer. Ainda é uma questão em aberto que se quaisquer alterações genéticas somáticas pode causar a supressão destes miRNAs em câncer de pulmão humano ou quaisquer outros tumores malignos. Melhor caracterização dos locos genômica destes miRNAs é necessário fazer a questão clara.

Métodos

Extração de posição miRNA

Annotated miRNA loci foram extraídas de regiões de ganho cromossômico e perda identificado por Zhao

et al

. [17] em um grande painel de carcinomas do pulmão humanos que utilizam matrizes de SNP. As coordenadas HG16 foram convertidos para sua Hg18 usando equivalentes utilizando a ferramenta UCSC Levante-Over (https://genome.ucsc.edu).

As linhas celulares

linhas celulares de cancro do pulmão humano , H1299 e A549, foram adquiridas a partir da ATCC. As linhas celulares foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor, 100 ug /ml de penicilina /estreptomicina e 292 ug /ml de L-glutamina (Invitrogen, Carlesbad, CA, EUA).

preparações de RNA e quantificação dos RNAs utilizando PCR em tempo real

Todo o tempo real PCR foi realizada com sistema StepOnePlus em tempo real PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) em quadruplicado. O RNA total foi extraído de células H1299 e A549 com o

mir

kit de isolamento Vana miRNA (Ambion, Austin, TX, EUA). Os ARNs totais de tecidos humanos foram adquiridas a partir de Biochain Institute, Inc. (Hayward, CA, EUA; número de Catálogo: R1234152-50, R1235152-50, R1234035-50, R1234068-10, R1234149-50, R1234183-50). Para a quantificação da miARN, 100 ng de ARN total foi analisada com o kit TaqMan MicroRNA transcrição reversa (RT) (Applied Biosystems) com RNU44 como controlo de carga. Para a quantificação de ARNm, 500 ng de ARN total foi transcrito reverso usando a enzima RT PrimeScript II (Takara Bio Inc., Shiga, Japão) e a PCR foi realizada com a pré-mistura de SYBR Ex Taq (perfeito em tempo real: Takara Bio, Inc. ) com GAPDH como controlo de carga. Toda a análise de PCR em tempo real foram realizadas em triplicado.

miRNA transfecção

Synthetic pré-miRNAs e controle negativo não específico (miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control # 1) foram adquiridos de Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, EUA). Os pré-miARNs foram transfectadas a uma concentração final de 10 nM com Lipofectamine2000 (Invitrogen), e meio mudado 24 horas após a transfecção.

crescimento celular medição

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubou-se a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. A viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT usando o kit de contagem de células-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japão), de acordo com o protocolo do fabricante. Após 1 hora de incubação com os meios que contêm o composto de tetrazólio, a absorvância a 450 nm foi detectada durante 0,1 seg com Arvo MX 1420 (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA).

análise do ciclo celular

As células foram colhidas após 72 horas, fixados em etanol a 70% arrefecido em gelo e seguido por ARNase a de tratamento, coradas com 50 ug /ml de iodeto de propídio para análise do conteúdo de ADN por citometria de fluxo em um sistema FACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin, NJ, EUA). Os dados foram coletados e processados ​​usando o software de análise de FlowJo FACS (Árvore Star, Inc., Ashland, OR, EUA).

Expressão de perfil usando um array de expressão gênica Agilent

A sonda cRNA foi gerado a partir de ARN total (500 ng) com a amplificação kit de rotulagem (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). -Cy3 marcado ARNc (1,65 ug) foi, em seguida, fragmentada e expressão relativa foi medida por hibridação com toda 4 × 44K microarrays oligo humana (Agilent). Feature Extraction ver. 9.1 software (Agilent) foi usado para analisar a imagem de micromatriz. As análises de microarray foram realizadas em duplicado. Todos os dados de microarranjos relatadas no manuscrito é descrito de acordo com orientações Miame e os dados foram depositados em Cibex (Centro de expressão do gene Informação Biologia) do banco de dados [36] pelo Centro de Biologia Informação e DNA Data Bank of Japan (DDBJ), National Instituto de Genética (Mishima, Japão). O número de acesso para o conjunto de dados é CBX79.

Microarray e ontologia Gene análise

Os dados Microarray foi visualizado e normalizada usando GeneSpring GX 7,3 software (Agilent). Os valores inferiores a 0,01 foram ajustados para 0,01. Para cada chip de cada medição foi dividido pelo percentil 50 de todas as medições para que o chip. Em seguida, para cada sonda as medições foram normalizadas para as medições de controlo negativo. Por causa da limitação dos recursos, a estatística

p

-valor podem não ser aplicáveis ​​critérios para a seleção de genes de nosso conjunto de dados. Assim, para análise ontologia gene, genes diferencialmente expressos foram definidos como ≥1.5 dobrar para cima ou para baixo em relação ao controlo negativo no dia correspondente. Gene Ontology enriquecimento termo em conjuntos de genes cima e para baixo regulados foram avaliados utilizando a ferramenta web GOstat [37]. A ferramenta web GOstat fornece um valor de p sobre se a lista gene fornecidas são significativamente enriquecido para genes anotados com um determinado Gene Ontology. Este valor é calculado com base em como muitos genes no conjunto de genes são anotados com a ontologia dada, e quantos genes em todo o microarray (ao fundo) são anotadas com a mesma ontologia. Nós definimos o plano de fundo como o conjunto de genes detectados em pelo menos um dos experimentos da matriz.

Os anticorpos e análise immunoblotting

Os anticorpos para o α-tubulina (Sigma) e CDK6 (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foram usadas. As células em cultura (5,0 x 105 células /poço) foram cultivadas em poços de placas de 6 cavidades e foram transfectadas, com miARNs. 24 horas após a transfecção, as células foram lisadas e sujeitas a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana Immobilon (Millipore, Billerica, MA) por electrotransferência. Os complexos imunitários foram detectados por quimioluminescência aumentada (Perkin Elmer) e visualizada com LAS 3000 analisador de imagem (Fuji Film, Tóquio, Japão).

Informações de Apoio

Tabela S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0006677.s001

(0,03 MB XLS)

Tabela S2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0006677.s002

(0.27 MB XLS)

Reconhecimentos

Agradecemos MPEs. Satomi Fujiwara, Asami Hirakiyama, e Kana Nakamura por sua assistência técnica.