Abstract

Fundo

Entre os cânceres ginecológicos, o câncer de ovário é o segundo mais comum e tem a maior taxa de mortalidade. O cancro é uma doença genética e surge devido à acumulação de mutações somáticas em genes críticos. A compreensão da base genética de câncer de ovário tem implicações tanto para a detecção precoce e para a intervenção terapêutica nesta população de pacientes.

Metodologia /principais conclusões

Quinze linhas celulares de cancro do ovário, comumente usado para experimentos in vitro, foram selecionados para mutações utilizando sequenciamento direto bidirecional em todas as regiões codificantes do

BRAF

,

MEK1

e

MEK2

.

BRAF

mutações foram identificados em quatro dos quinze linhas celulares de cancro do ovário estudados. Juntas, estas quatro linhas celulares continha quatro

BRAF

mutações diferentes, dois dos quais eram novos. ES-2 tinha a mutação comum p.V600E B-Raf no exão 15 e Hey continha uma mutação missense exon 11, p.G464E. Os dois mutantes de B-Raf foram identificados novos a 5 aminoácidos heterozigótica eliminação p.N486-P490del em OV90, e uma substituição missense p.Q201H exão 4 em OVCAR 10. Uma das linhas de células, ES-2, continha uma mutação em MEK1, especificamente, um romance substituição missense heterozigótica, p.D67N que resultou de um G nt 199 → uma transição. Nenhuma das linhas celulares de codificação continham mutações região em

MEK2

. Caracterização funcional do p.D67N mutante MEK1 por transfecção transitória com a análise Western blot posteriores demonstraram aumento da fosforilação ERK, em comparação com os controles.

Conclusões /Significado

Neste estudo, relatamos romance

BRAF

mutações no exon 4 e exon 12 e também relatam a primeira mutação no

MEK1

associada com o câncer humano. Os dados funcionais indicam a alteração

MEK1

mutação pode conferir de activação através da via MAPK. O significado destas descobertas é que

BRAF

e

MEK1 /2

mutações podem ser mais comuns do que o previsto no câncer de ovário, que pode ter implicações importantes para o tratamento de pacientes com esta doença e sugere potencial novo avenidas terapêuticas

Citation:. Estep AL, Palmer C, McCormick F, Rauen KA (2007) Análise de Mutantes de

BRAF

,

MEK1

e

MEK2

em 15 linhas celulares de cancro do ovário: implicações para a terapia. PLoS ONE 2 (12): e1279. doi: 10.1371 /journal.pone.0001279

Editor do Academic: Amanda Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de julho de 2007; Aceito: 13 de novembro de 2007; Publicação: 05 de dezembro de 2007

Direitos de autor: © 2007 Estep et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Subvenção NIH HD048502 (KAR) financiou parcialmente. Canary Foundation financiou parcialmente. A Fundação Canárias não têm um papel na recolha, análise e interpretação dos dados

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é o segundo câncer ginecológico mais comum nos Estados Unidos que afecta cerca de 22.000 mulheres a cada ano, causando um número estimado de 15.200 mortes [1]. O cancro é uma desordem genética resultante da acumulação de mutações somáticas em genes envolvidos nas vias celulares críticas. Estas mutações normalmente resultam em proteínas que exibem o seu efeito oncogénico, alterando a sinalização através de redes de transdução vitais, ou em haploinsuficiência de proteínas críticas supressores de tumor.

A compreensão da base genética de câncer de ovário tem implicações tanto para a detecção precoce, bem como para a intervenção terapêutica nesta população de pacientes. Genes que foram encontrados somaticamente mutado no cancro do ovário incluem

KRAS

[2] – [5],

ARN

[2],

PIK3CA

[5] – [9 ],

PTEN

[5], [10], [11],

TP53

[5], [12], [13] e

BRAF

[2] – [4]. B-Raf, o produto de proteína de

BRAF

, é uma proteína quinase serina /treonina e o primeiro na cascata da proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK), que é uma das muitas vias efectoras a jusante de Ras. estímulos extracelular leva à activação de Ras, o que por sua vez activa Raf (A-Raf, B-Raf, e /ou C-Raf-1). Raf fosforila e activa depois MEK1 e /ou MEK2 (MAPK quinase). MEK1 e MEK2 são treonina /tirosina-quinases com as isoformas de ter a capacidade de fosforilam e activam ERK1 e ERK2 (MAPK). ERK, uma vez ativado por MEK, tem numerosos citosólica e substratos nucleares [14]. sinalização a montante aberrante resultante em hyperactivated ERK desempenha um papel chave na patogénese e progressão de, aproximadamente, 30% dos cancros humanos, incluindo o cancro do ovário [15]. Como resultado, esta via tem sido um alvo atraente para o desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas para o tratamento de cancro [16].

Os genes que compreendem a via MAPK,

BRAF

,

MEK1

e

MEK2

, foram sistematicamente verificados em busca de mutações em 15 linhas de células de cancro do ovário usando sequenciação directa bidirecional de todos os exons. Relatórios anteriores demonstraram que a B-Raf mutante em aproximadamente 28-37% dos carcinomas de baixo grau serosas [3], [17]. Com esta informação, a busca foi ampliada para incluir

MEK1

e

MEK2

, dois genes, juntamente com

BRAF

, que nós determinamos recentemente para ser causal para cardio-facio -cutaneous (CFC) síndrome (MIM 115150), uma síndrome múltipla anomalia congênita em que os indivíduos têm dismorfia craniofacial característica, defeitos cardíacos e anomalias ectodérmicas [18]. Curiosamente, ao contrário mutações germinativas identificados na síndrome CFC, há mutações somáticas já foram identificados em

MEK1 /2

em qualquer tipo de câncer. Em nossa análise, romance

BRAF

mutações foram identificadas no exão 4 e exon 12 de duas linhas de células separadas. Além disso, relatamos a primeira mutação funcional em

MEK1 associada com o câncer humano. O significado destas descobertas é que

BRAF

e

MEK1 /2

mutações pode ser mais comum do que anteriormente reconhecido no cancro do ovário, o que poderia ter implicações importantes para o tratamento de pacientes com câncer de ovário.

resultados

BRAF e MEK1 mutações

O DNA genômico de 15 linhas de células de cancro do ovário foi exibido para a

BRAF

mutações na codificação exons 1-18. Quatro mutações foram identificados em quatro linhas celulares individuais: OVCAR 10, OV90, Ei e ES-2 (Figura 1). Nenhuma das outras linhas celulares teve

BRAF

mutações. Dois dos quatro

BRAF

mutações identificadas eram novas. OVCAR 10 continha uma nt 603 G → T transversion causando uma p.Q201H substituição missense heterozygous no exão 4 (Figura 1A). OV90 continha um heterozigoto 5 deleção de aminoácidos romance, p.N486-P490del, no exão 12 (Figura 1B). Em adição aos dois novos

BRAF

mutações identificadas, foram identificadas duas mutações adicionais que tenham sido previamente reportados no cancro. Ei continha um nt 1391 G → Uma transição resultando numa mutação sem sentido exão 11, p.G464E (Figura 1C). O electrofograma demonstraram perda de heterozigosidade neste locus. ES-2 continha um exão 15, T → Uma transversão no nt 1799, substituindo o ácido glutâmico por valina na posição 600 (p.V600E) (Figura 1D). Nenhuma destas mutações foram identificadas nos controlos.

Quatro

BRAF

mutações foram identificados em quatro linhas de células individuais. A) 10 OVCAR continha uma NT 603 L → transversão T causando uma substituição p.Q201H missense heterozigoto no exão 4. B) OV90 continha um romance deleção heterozigótica começando no nt 1457 (seta), resultando numa eliminação de 5 aminoácidos, p.N486 -P490del, no exão 12. C) Hey continha uma nt 1391 G → a transição resultando em perda de heterozigosidade. D) ES-2 continha um exão 15, T → Uma transversão no nt 1799, substituindo o ácido glutâmico por valina na posição 600 (p.V600E). E) A nt 199 G → A transição em

MEK1,

exão 2 resultou em uma substituição missense heterozygous, p.D67N.

Todos os onze exons codificantes do

MEK1

e

MEK2

também foram sequenciadas nas mesmas linhas celulares e controles. Uma mutação no

MEK1

foi identificada em ES-2 que consiste de uma nova substituição missense heterozigótica, p.D67N, que resultou de uma NT 199 g → Uma transição (Figura 1E). Não foram identificadas outras substituições nonsynonymous em MEK1. Os onze codificação exons de

MEK2

foram sequenciados e não substituições nonsynonymous foram identificados.

Nucleotide Variação

Além destas mutações, um total de quatro polimorfismos de nucleotídeo único sinônimo diferentes (SNPs) foram identificados em

BRAF

(Tabela 1),

MEK1

(Tabela 2), e

MEK2

(Tabela 3). Três destas quatro SNPs foram encontrados em cinco ou mais das linhas de células e quinze foram previamente relatado (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/). Em ordem de freqüência, os três SNPs de banco de dados sinônimo incluem: i) MEK2 p.I220I (rs10250) presente em 11 das 15 linhas celulares (73%), ii) BRAF p.G634G (rs9648696) encontrados em seis dos 15 células linhas (40%) e, iii) MEK2 p.D151D (rs17851657) identificada em cinco das linhas celulares de 15 (33%). Houve um exclusivamente identificada MEK1 SNP em OVCAR 10 resultante de uma NT 348 L heterozigótica → Uma transição no exão 3, p.Q113Q (Tabela 2). Todos os SNPs sinónimo foram caracterizados por SIFT (Classificando intolerante De Tolerant) e determinado a ser tolerado.

Caracterização funcional de mutantes

SIFT foi utilizado para caracterizar a significado funcional das substituições de aminoácidos identificadas nonsynonymous em B-Raf MEK1 e. B-Raf p.G464E, p.N486-P490del, p.V600E e MEK1 p.D67N foram previstos para ser substituições deletérios que causam uma alteração da função da proteína, enquanto que B-Raf p.Q201H foi previsto para ser tolerado.

Para corroborar a alteração funcional do mutante MEK1 p.D67N romance identificados em ES-2, a transfecção transiente de células HEK 293T com posterior análise de Western blot revelou um aumento da actividade de quinase medida por fosforilação de ERK (Figura 2). O mutante p.D67N MEK1 aumentou a fosforilação de ERK em comparação com o tipo selvagem MEK1. O nível de fosforilação de ERK foi menor do que o mutante p.Y130C CFC MEK1 que é conhecido por ter um nível elevado de actividade (controlo positivo).

células 293T de rim embrionário humano foram transfectadas transientemente com o vector vazio, wild- digite MEK1, MEK1 p.Y130C (mutante controlo positivo, que tem conhecido alto nível de atividade [18]) e o mutante MEK1 p.D67N. ERK (ERK1 p44 e p42 ERK2) fosforilação foi determinada por transferência de Western utilizando anticorpos específicos de fosfo. O mutante MEK1 p.D67N tinha aumentado fosforilação de ERK em comparação com o nível induzido pelo vector vazio e de tipo selvagem MEK1. O nível de fosforilação de ERK induzida por MEK1 p.D67N é ligeiramente menor do que o mutante p.Y130C CFC MEK1 que é conhecido por ter actividade aumentada [18]. Marcada com myc MEK1 é mostrado para a eficiência de transfecção e da ERK total é apresentado como um controlo de carga.

Discussão

Altered sinalização através da via de MAPK no cancro muitas vezes resulta de mutações no componentes a montante de ERK, incluindo K-Ras, N-Ras, H-Ras, C-Raf-1 e B-Raf [15]. Estudos moleculares de linhas celulares de cancro do ovário e amostras tumorais identificaram mutações genéticas em alguns destes genes,

KRAS

,

ARN

e

BRAF

, o que resulta na alteração da sinalização por essa via crítica [2], [19] – [23].

mutações somáticas no

BRAF

foram relatados com uma frequência elevada em numerosos cancros, incluindo melanoma, tireóide, colo-rectal e do ovário. Cerca de 70 mutações missense afectam 34 códons foram relatados (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). No cancro, a maioria dos somática

BRAF

mutações resultam em substituições missense encontrados em, mas não limitado a, exão 11 (o circuito rico em glicina) e exão 15 (o segmento de activação) no domínio de proteína cinase [ ,,,0],24]. Uma mutação missense no exão 15, resultando em uma substituição missense, B-Raf p.V600E, é responsável por mais de 90% do

BRAF

mutações identificadas no câncer humano. A estrutura cristalina da Raf-B mostra que o segmento de activação é mantido numa conformação inactiva por associação com o G-loop. Mutações nessas duas regiões, o loop rica em glicina e o segmento de ativação, são acreditados para interromper essa interação, a conversão de B-Raf em sua conformação activa [25].

Além de mutações somáticas, mutações germinativas em

BRAF

foram recentemente identificadas como causando síndrome de CFC, um distúrbio de múltiplas anomalias congênitas em que os indivíduos têm dismorfismos características craniofaciais, malformações cardíacas, anomalias ectodérmicas e atraso de desenvolvimento [18], [26]. A maioria das mutações na síndrome de CFC estão fora do domínio do exão 11 e 15 do exão proteína quinase. O causador CFC mutação mais comum, p.Q257R, reside no exão 6 do domínio rico em cisteína. Como a maioria cancerígenos mutações em

BRAF

, estudos bioquímicos determinaram que a maioria das proteínas mutantes romance CFC B-Raf aumentaram a actividade da quinase em relação à actividade da quinase de tipo selvagem de B-Raf [18], [26 ]. Estes estudos pontuar o facto de

BRAF

mutações ocorrem não só somaticamente mas também na linha germinativa, e que as mutações que conferir um aumento de actividade de quinase não são restritas para os tipicamente associados com o cancro.

sequenciação bidireccional de todos os exons codificantes dos

BRAF

em 15 e linhas de células de câncer de ovário muito utilizados bem caracterizados identificou quatro linhas de células com

BRAF

mutações. Apenas uma linha de células tinha o exão comum 15

BRAF

mutação. ES-2, que é derivada a partir de carcinoma de células claras do ovário [27] tinha a mutação heterozigótica p.V600E missense comum. Relatórios anteriores demonstraram que a B-Raf mutante mais geralmente em carcinomas ovarianos serosas de baixo grau com uma frequência de cerca de 28-37% e que todas as mutações estão a variante comum p.V600E B-Raf [3], [17]. Curiosamente, as duas linhas de células serosas derivados examinadas neste estudo (Ei e OV90) não tem a mutação comum p.V600E B-Raf; No entanto, ambos continham

BRAF

mutações. Hey, derivada de um carcinoma seroso papilífero [28], continha uma mutação missense exon 11, p.G464E. Esta mutação sem sentido foi descrito anteriormente (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) e é também um codão que é mutado na síndrome de CFC ([29]; Rauen, dados não publicados). OV90 o qual é derivado a partir de um adenocarcinoma seroso [30] continha uma nova mutação no exão 12, resultando numa eliminação de cinco aminoácidos heterozigótica, p.N486-P490del. Embora extremamente rara, exão somática 15 B-Raf em grelha deletion-inserções foram relatados no cancro [31], [32]. Além disso, foram identificados dois indivíduos CFC com pequenas deleções em-frame no exão 11 (Rauen, dados não publicados). Finalmente, OVCAR 10, o qual é derivado a partir de um cancro epitelial de ovário humano, tinha um p.Q201H substituição missense heterozigótica único no exão 4. Este SNP nonsynonymous não foi identificado no cancro ou síndrome de CFC e foi determinado para ser tolerada por peneirar assim talvez B-Raf p.Q210H representa um polimorfismo raro.

Apenas duas das linhas celulares do cancro do ovário tinham mutações no exão tipicamente afectada 11/15 regiões no domínio de proteína cinase de B-Raf. Esta descoberta levanta a possibilidade de que o câncer associado

BRAF

mutações fora do exão 11/15 pode ser mais comum do que o previsto. Uma vez que a grande maioria dos

BRAF

estudos de levantamento mutação publicados são restritas a exons 11 e 15, outras mutações possíveis fora dessas regiões pode ser negligenciado.

Para explorar o significado funcional destes novos B- mutantes Raf, todos aqueles identificados neste estudo foram analisados ​​pelo SIFT (https://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html), um programa de análise de mutação on-line que prevê a conseqüência funcional da substituições de aminoácidos nonsynonymous [33], [34]. Todos

BRAF

mutações identificadas foram previstos ter alterado a função da proteína exceto para p.Q201H. O significado funcional de

BRAF

mutações de codificação em outros de 11 e 15 exons é apoiada por estudos bioquímicos de novas mutações germinativas identificados no CFC. Como mutações somáticas, a maioria das mutações da linha germinativa CFC conferem um aumento da actividade de quinase, enquanto alguns são prejudicadas quinase. No entanto, todas as mutações CFC que tenham sido caracterizados bioquimicamente a função da proteína Alter, em certa medida ([18], [26]; Rauen, dados não publicados).

B-Raf tem apenas dois efectores a jusante conhecidos, MEK1 e MEK2 . Num esforço para caracterizar o espectro de mutações da via de MAPK no cancro do ovário, também sequenciados

MEK1 /2

e identificada uma nova MEK1 missense heterozigótica substituição, p.D67N, em ES-2, que resultou de uma NT 199 g → Uma transição. Esta é a primeira mutação MEK funcional identificados associados com câncer e não representa um polimorfismo raro em que esta mutação não foi identificada em 40 controles normais (80 alelos) ou em 52 indivíduos CFC (104 alelos) temos seqüenciados até o momento ([18 ]; Rauen, dados não publicados). Curiosamente, embora não tinha identificado este MEK1 p.D67N mutante em nossa coorte CFC, esta mesma mutação MEK1 foi recentemente relatado como uma mutação germinativa na síndrome CFC [29]. Além de um

MEK1

mutação, ES-2 também teve um B-Raf substituição p.V600E missense. Estas duas mutações podem ter sido co-operando eventos tumorigénicas. O que faz com que esta descoberta particularmente interessante é o facto de os estudos anteriores de sequenciação do domínio de MEK1 /2 de proteína cinase não conseguiu identificar quaisquer mutações em gliomas, tumores de células germinativas testiculares, cancro da mama e cancro do pulmão [35] – [38]. Notavelmente, o p.D67N em ES-2 cai fora do domínio cinase de proteína que se estende a partir do AA 68-271 (www.ensembl.org/Homo_sapiens). Muitas mutações de linha germinal CFC estão localizados a 5 ‘do domínio de proteína cinase ([18], [29], [39]; Rauen, dados não publicados). Estudos funcionais desses novos mutantes CFC têm demonstrado aumento da atividade

in vitro

sobre MEK tipo selvagem em estimular a fosforilação ERK, mas estes mutantes CFC não são tão activo como um mutante MEK constitutivamente ativa gerada artificialmente ([18]; Rauen, dados não publicados). Outros estudos têm demonstrado que a alteração do terminal N de MEK aumenta a atividade basal da cinase, implicando um importante papel regulador juntamente com o reconhecimento de substrato [40] – [42].

Para avaliar a consequência funcional da MEK1 p. D67N, esta substituição de aminoácidos foi analisada por SIFT e verificou-se ser funcionalmente afectado. Para corroborar esta informação, MEK1 p.D67N foi transitoriamente transfectado em células HEK 293T, e ERK fosforilação foi medido por análise de Western blot. O p.D67N mutante MEK1 está ativando como demonstrado pelo aumento da fosforilação ERK, em comparação com vector vazio e wildtype MEK1, dois controles que não ativam ERK. No entanto, o nível de fosforilação ERK para p.D67N é menor do que o controle CFC MEK1 p.Y130C mutante positivo [18].

Além de

BRAF

e

MEK1

mutações, vários banco de dados de SNP sinónimo também foram identificados. B-Raf p.G634G (rs9648696) foi identificado em 40% das linhas celulares de 15, MEK2 p.I220I (rs10250) estava presente em 73% e MEK2 p.D151D (rs17851657) foi identificada em 33% das linhas celulares. Estes SNPs da base de dados sinónimas estavam presentes a uma frequência que é comparável ao que foi anteriormente relatado (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp; [43]). Houve uma identificada exclusivamente

MEK1

SNP em OVCAR 10 resultante de uma nt 348 G heterozigotos → Uma transição no exão 3, p.Q113Q. Todos os SNPs sinónimas foram caracterizados por SIFT e determinado a ser tolerado.

Os nossos achados enfatizam que as mutações que alteram a função da via de MAPK desempenha um papel importante no cancro do ovário [15]. Além disso, a identificação de mutações em componentes chave da via MAPK será importante na determinação da capacidade de resposta do cancro a agentes terapêuticos, o comportamento agressivo e metastática do tumor e o prognóstico do paciente. Quatro dos 15 (26%) linhas celulares neste estudo tinham

BRAF

mutações e 1 de 15 (7%) tinham uma mutação MEK. Sabe-se que

BRAF

mutações foram identificadas em certos tipos de cancro do ovário; No entanto, mutações nos efectores a jusante de B-Raf, incluindo

MEK1

e

MEK2

também podem ser importantes contribuintes da tumorigênese do câncer de ovário. Definindo as pathogenetics de câncer de ovário pode permitir o uso de terapias-alvo, tais como inibidores de pequenas moléculas de MAPK via, que começaram recentemente a demonstrar uma grande promessa [16]. Além disso, um relatório indica que as células com B-Raf activada têm melhorado, sensibilidade selectiva para inibidores de MEK [44]. Nossos resultados sublinham a importância que a melhor caracterização da sensibilidade de vários BRAF e MEK mutantes a pequenas inibição molécula é uma avenida importante prosseguir para o desenvolvimento de tratamentos eficazes para o câncer de ovário.

Métodos

linhas celulares e isolamento de ADN genómico

Quinze linhas celulares de cancro do ovário, comumente usado para

in vitro

experimentos, foram rastreados para mutações: OVCAR 3, SKOV 3, TOV-112d, A2780, OV90 , ES-2, TOV-21g, Caov-3, A1847, IGROV 1, OVCAR 5, 2008, OVCAR 10, PEO1 e Hey. As pelotas de células de cada uma destas linhas de células foram gentilmente cedidas pelos Drs. Charles Drescher e Beatrice Knudsen. O ADN genómico foi isolado a partir dos sedimentos celulares utilizando o kit de tecido de DNA QIAamp (Qiagen, Valencia, CA), de acordo com as instruções do fabricante. Quarenta controles humanos saudáveis ​​foram incluídos neste estudo. O ADN genómico foi isolado a partir de linfócitos de sangue periférico usando o kit de ADN Midi sangue QIAamp (Qiagen, Valencia, CA), de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de controlo foram obtidos no âmbito de um conselho de revisão instituição aprovada pela Universidade da Califórnia em San Francisco.

PCR e bidirecional Sequencing

iniciadores de PCR foram concebidos para amplificar todos os exons codificantes e regiões intrônicas de flanqueamento de

BRAF

(NM_004333.2),

MEK1

(NM_002755.2) e

MEK2

(NM_030662.2) (Tabela 4 e Tabela 5). Para a sequenciação, os iniciadores de PCR foram modificados na extremidade 5 ‘para a frente incluem M13 (GTAAAACGACGGCCAGT) e inverter sequências (CAGGAAACAGCTATGACC). PCR e sequenciação foram realizadas por Agencourt Bioscience Corporation (Beverly, MA). sequenciamento bidirecional foi realizada com ABI Big Dye Kit Cycle Sequencing v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as orientações do fabricante e executado em um instrumento de sequenciação capilar ABI3730xl (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Análise

Os dados Sequencing foi analisada utilizando dois programas de análise de sequência, v5.02 PolyPhred Software (Universidade de Washington, Seattle, WA) e SeqScape® Software (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Além disso, a revisão manual foi realizada com Mutation Surveyor 3,00 (SoftGenetics LLC, State College, PA). Uma avaliação mais aprofundada das mutações de nucleótidos detectados consistiu de Triagem intolerante De Tolerant (SIFT; blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) e triagem em bancos de dados conhecidos: NCBI, cósmico, UniProtKB /Swiss-Prot e JSNP (www.ncbi.nlm .nih.gov /SNP, www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/, ca.expasy.org/sprot/, snp.ims.u-tokyo.ac.jp/).

os plasmídeos

Humano

MEK1

ADNc (Origene, Rockville, MD) foi clonado num vector pcDNA3 com um marcador myc na extremidade N-terminal. O

MEK1

nt 199 G → A transição foi introduzido usando Quick-Change Site-Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA) e verificado por sequenciação directa.

análise transiente Transfec�es e Western Blot

de rim embrionário humano (HEK) células 293T foram semeadas no dia anterior em placas de seis cavidades e foram transfectadas, em duplicado, com 2 ug de plasmídeo de ADN total e 5 ul de Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram privadas de soro (0,5% de soro fetal de bovino) e 24 horas depois lisadas em tampão contendo protease e cocktail de inibidor de fosfatase (Sigma, St. Louis, MO). Os níveis de expressão de myc-MEK, ERK ERK fosforilada e total foram quantificados por Western blot. Myc (A-14) e p-ERK (E-4) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), e p44 /42 MAP cinase anticorpo foi adquirido a Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Agradecimentos

os autores agradecem a Fundação Canárias (www.canaryfoundation.org) pelo apoio financeiro e científico e Drs. Ingrid Revet e William Tidyman para comentários inteligentes e assistência técnica.